CN103388011B - 一种高效发酵生产l-山梨糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，以固定化基因工程菌为生产种子，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30℃、200rpm条件下增殖培养20-24h；按15%的接种量将培养好的固定化种子接入发酵培养基，30℃，500rpm，2.5vvm，1-L发酵罐条件下半连续补料发酵21天。应用上述方法以山梨醇为唯一碳源，发酵16h后，D-山梨醇转化率达到90%以上，与对照菌株相比提高了37%；以山梨醇为唯一碳源，可完成21天的固定化细胞的半连续补料发酵，与游离菌发酵相比节约20批次的种子制备成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，特别是一种利用分子生物学手段通过给山梨醇脱氢酶基因基添加poly(A/T)尾巴以增强其mRNA稳定性来强化工程菌山梨醇脱氢酶基因的转录和表达，进而强化山梨醇氧化脱氢途径，从而调控山梨醇快速化地导向目标代谢产物，并利用固定化基因工程菌进行半连续补料发酵的方法，山梨糖的方法。
背景技术
L-山梨糖，一种己酮糖，为D-果糖的C-2位和C-3位差向异构体，分子量180.16。L-山梨糖作为一种重要的化学原料，主要被用来作为生产维生素C(VC)的前体。目前工业上主要用“莱氏法”和“两步发酵法”生产VC，二法初始均经发酵将D-山梨醇转化为L-山梨糖。其中，以D-山梨醇为底物的发酵工艺是唯一用于工业生产的方法，但是现有技术发酵周期长，导致生产成本高、产品质量不易控制。
目前，国内外关于微生物发酵法生产L-山梨糖的研究主要集中于对发酵条件的优化和控制，但是简单的发酵优化并不能很好地缩短发酵周期等，代谢工程作为一种理性的菌种改造方法能够更加有效地实现目标产物的高产。虽然目前采用代谢工程手段来强化L-山梨糖积累的研究鲜有报道，但是鉴于山梨醇脱氢酶(sldhAB)是Gluconobacter oxydans将D-山梨醇转化为山梨糖的关键酶，同时G.oxydans属于原核生物其mRNA稳定性较差，如果在其sldhAB基因的终止密码子后面加上一定数目的碱基A(T)，通过转录可使mRNA3’端带有poly(A/T)的尾巴来增强mRNA的稳定性，进而强化这山梨醇氧化脱氢途径，应该能够使D-山梨醇高效脱氢氧化为L-山梨糖，从而成为进一步强化G.oxydans生产山梨糖时表现的有效策略。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，其特征在于以固定化基因工程菌为生产种子，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30℃、200rpm条件下增殖培养20-24h；按15%的接种量将培养好的固定化种子接入发酵培养基，30℃，500rpm，2.5vvm，1-L发酵罐条件下半连续补料发酵21天；所述基因工程菌为产山梨醇脱氢酶基因的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，其构建方法为将携带poly(A/T)尾巴的山梨醇脱氢酶基因与强启动子连接，克隆到表达载体后转化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans WSH-003得到基因工程菌。
通过给山梨醇脱氢酶基因基添加poly(A/T)尾巴以增强mRNA稳定性来强化转录同时过量表达，进而强化山梨醇氧化脱氢的代谢途径来构建一株高产L-山梨糖的基因工程菌，并利用固定化基因工程菌进行半连续补料发酵的方法。
以下是本发明技术方案的详细描述。
携带多聚A(T)尾巴的目的基因sldh扩增与表达质粒的构建
通过设计引物从Gluconobacter oxydans WSH-003基因组PCR扩增获得tufB基因片段，酶切连接到含卡那霉素(Kan)抗性标记基因的质粒pBBR1MCS-2(Four new derivatives of thebroad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes)，获得重组质粒pBBR-tufB。根据Genbank:NC_006677.1所示山梨醇脱氢酶基因，通过化学全合成方法获得山梨醇脱氢酶基因并使其终止密码子后携带poly(A/T)尾巴，接着酶切连接到重组质粒pBBR1MCS-2-tufB，得到表达载体pBBR-tufB-sldhAB。
过量表达sldh的G.oxydans重组菌的筛选
将重组质粒pBBR-tufB-sldh经三亲本杂交法转化G.oxydans细胞，将能在山梨醇培养基+Ceporex+Kan平板上生长的菌落，在山梨醇+Ceporex+Kan平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提取质粒，酶切验证，得到大约5.4kb和2.7kb的片段，表明sldhAB基因已成功导入G.oxydans中，所得重组菌命名为G.oxydans-sldhAB6。该菌在以山梨醇为唯一碳源的培养基上生长时，L-山梨糖的积累能力显著提高，发酵16h内D-山梨糖的转化率达90%以上，是出发菌株的1.37倍，发酵周期缩短1/3。
微生物菌株的种子培养与发酵：
种子培养基：山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO32g，pH4.8-5.1，自来水定容至1L。
发酵培养基：山梨醇150g，酵母膏2g，CaCO32g，pH4.8-5.1，自来水定容至1L。
种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。
将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，温度为30℃，转速200rpm，培养时间为20-24h。
采用电子蠕动泵将海藻酸钠、硅藻土与G.oxydans-sldhAB6种子的混合溶液泵入CaCl2中，形成直径为2mm的固定化细胞颗粒，4℃静置3h，使颗粒稳定成型，再用无菌水洗涤2次，即得固定化细胞。
将采用不同浓度的海藻酸钠、硅藻土制备的固定化细胞在增殖培养基中增殖24h后接入发酵培养基，采用摇瓶发酵，每隔4h取样检测山梨醇的转化率，得到最佳的海藻酸钠浓度为2.5%、硅藻土浓度为0.5%。
利用2.5%的海藻酸钠固定化细胞，通过不同直径的蠕动泵泵管制备不同直径的固定化凝珠，增殖后进行发酵，得到最佳的固定化凝珠直径为2mm。
按15%的接种量将制备好的固定化细胞接入种子培养基，500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，30℃、200rpm条件下增值培养培养24h。
按15%的接种量将增值培养后的种子接入发酵培养基，1-L发酵罐中发酵培养基为500mL，30℃、500rpm、2.5vvm条件下半连续补料发酵21天。
细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV7500型可见分光光度计，于600nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
sldh基因转录水平的RT-PCR验证：取对数生长期的菌液5mL，4℃条件下8,000rpm离心5min，取细胞沉淀参照RNAiso PlusRNA使用说明提取对照菌和重组菌的总RNA，电泳验证提取的总RNA无误后使用PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA，反转录程序为：37℃15min，85℃5s。使用Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒进行sldh基因转录变化情况的测定。检测的基因为sldh基因。RT-PCR反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM:10μL，PCR forward primer(10μM)：0.4μL，PCRreverse Primer(10μM)：0.4μM，cDNA模板：2μL，dH2O(RNAase free)：7.2μL。反应程序：预变性：95℃40s，变性：95℃5s，退火/延伸：55℃30s，共40个循环。
D-山梨醇与L-山梨糖浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)
仪器：Agilent1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)。
色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)；
流动相：0.005mol/L H2SO4；
流速：0.6mL/min；
柱温：35℃；
进样量：5μL；
检测器为示差折光检测器。
样品制备：500μL发酵液在8000rpm下离心10min，取上清液250μL移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0.22μm滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
本发明提供的自克隆工程菌能以山梨醇唯一碳源，过量积累L-山梨糖。在发酵16h后，山梨醇转化率达90%以上，比出发菌株提高了37%，并且利用固定化细胞进行21天半连续补料发酵，与游离菌发酵相比可节约20批次制备种子的成本。这一调节微生物细胞中山梨醇脱氢途径，促进代谢流快速流向代谢产物，实现代谢产物过量积累的策略，为工业生物技术特别是采用代谢工程手段改造菌株来提高目的产物的生成提供了新的技术思路。
具体实施方式
实施例1重组菌G.oxydans WSH-003-sldh的构建及鉴定
通过设计引物从Gluconobacter oxydans WSH-003基因组PCR扩增获得tufB基因，并将其克隆到表达载体ppBBR1MCS-2，构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。即得到重组质粒pBBR-tufB。通过化学全合成方法获得山梨醇脱氢酶基因并使其终止密码子后携带AAATTTAAATTT尾巴，再将其克隆到重组质粒pBBR-tufB。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将重组质粒pBBR-tufB-sldhAB利用三亲本杂交法转化G.oxydans细胞，将能在山梨醇培养基+Ceporex+Kan平板上生长的菌落，在山梨醇+Ceporex+Kan平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提取质粒，酶切验证，得到大约5.4kb和2.7kb的片段，表明sldh基因已成功导入G.oxydans，所得重组菌命名为G.oxydans-sldhAB6。该菌在以山梨醇为唯一碳源的培养基上生长时，L-山梨糖的积累能力显著提高，是出发菌株的1.37倍。
其中：
山梨醇培养基：
山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO32g，pH4.8-5.1，固体培养基添加20g琼脂。
山梨醇+Ceporex+Kan平板
山梨醇培养基+100mg头孢霉素+25mg卡那霉素，固体培养基添加20g琼脂。
实施例2重组菌G.oxydans-sldhAB6底物浓度的优化
根据G.oxydans-sldhAB6的培养特性，以不同初始浓度的山梨醇为碳源进行发酵实验，并相互比较，根据实验结果和原料成本综合考虑，当山梨醇添加量为150g/L时，山梨糖的生产强度最高，工艺的经济指标最优，此时山梨糖的产量达135g/L，并且发酵周期缩短了1/3。
实施例3固定化重组菌G.oxydans-sldhAB6的半连续补料发酵
根据G.oxydans-sldhAB6的培养特性，以不同浓度的山梨醇为碳源进行补料发酵实验，并相互比较，根据实验结果和原料成本综合考虑，当山梨醇初始添加量为150g/L时，补料间隔为24h，每批补山梨醇70g时山梨糖的生产强度最高，工艺的经济指标最优，并可补料发酵20批。
实施例4山梨醇为唯一碳源时重组菌与对照菌发酵特性的比较
以山梨醇为唯一碳源，重组菌和对照菌相比：(1)重组菌中山梨醇脱氢酶的表达量上调了1倍；(2)以山梨醇为唯一碳源，发酵16h后，D-山梨醇转化率达到90%以上，与对照菌株相比提高了37%，并且发酵周期缩短了1/3；(3)以山梨醇为唯一碳源，可完成21天的固定化细胞的半连续补料发酵，与游离菌发酵相比节约20批次的种子制备成本。过量表达sldhAB基因有效地加快了山梨醇脱氢步骤的速度，使L-山梨糖快速生成并过量积累。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，其特征在于以固定化基因工程菌为生产种子，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30℃、200rpm条件下增殖培养20-24h；按15％的接种量将培养好的固定化种子接入发酵培养基，30℃，500rpm，2.5vvm，1-L发酵罐条件下半连续补料发酵21天；所述基因工程菌为产山梨醇脱氢酶基因的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，其构建方法为将携带poly A/T尾巴的山梨醇脱氢酶基因与强启动子连接，克隆到表达载体后转化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-003得到基因工程菌；所述山梨醇脱氢酶基因根据Genbank:NC_006677.1通过化学全合成方法获得，并在其基因终止密码子后添加polyA/T尾巴；所述固定化基因工程菌采用的固定化方法为：采用海藻酸钠和硅藻土共固定化制备得到直径为2-mm的固定化细胞；所述强启动子是来源于G.oxydans WSH-003的tufB启动子。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于发酵方法为半连续补料发酵，2-mm固定化细胞可重复使用21天。
3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于种子培养基组成为：山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4.8-5.1，自来水定容至1L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基组成为：山梨醇150g，酵母膏2g，CaCO3 2g，pH 5.1-5.3，自来水定容至1L。
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