CN108048511B - 调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺。所述工艺首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，初始生长阶段控制pH为5.2～5.4，发酵培养14～18小时后，调节pH至4.8～5.0，开始补加甲醇进行诱导表达。本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段降低pH值，控制菌种生长，同时提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。

Description

调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺。
背景技术
胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质，广泛分布于皮肤、软骨、血管等组织，参与细胞的迁移、分化和繁殖，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能起着重要的作用，在食品、饲料、美容、化妆品、医药等领域应用普遍。目前，胶原蛋白原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理如猪、牛等动物皮肤、骨骼等组织后分离纯化获得。但是，上述方法得到的胶原蛋白成分复杂，水溶性差，并且由于来自动物组织，存在病毒隐患，限制了胶原蛋白在医药方面的应用。
随着DNA重组技术的迅速发展，各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。与传统工艺相比，胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点，但是也存在着发酵周期较长，生产效率较低等问题。中国专利201010602214.8公开了一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，采用巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris C13为菌种，重组胶原蛋白表达量为5g/L，发酵周期99小时，发酵水平为0.051g/L·h，发酵周期虽短，但蛋白表达量和发酵水平过低。中国专利201110327865.5构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为136小时，蛋白表达量为16g/L，发酵水平为0.118g/L·h，蛋白表达量虽有提高，但是发酵周期过长，发酵水平较低。因此，进一步地缩短发酵时间，提高蛋白表达量，进而提高发酵水平，有利于胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺。该工艺通过在初始生长阶段控制pH为5.2-5.4，在甲醇诱导阶段，降低发酵液pH至4.8-5.0，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，缩短了发酵周期，提高了重组人源胶原蛋白的表达量，进一步提升了重组人源胶原蛋白的生产水平。
本发明的技术方案如下：
调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，初始pH为5.2～5.4，发酵培养14～18小时后，调节pH至4.8～5.0，开始补加甲醇进行诱导表达。
本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。
本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O
3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油 10.0～40.0g/L，PTM1溶液 0.435～4.35mL/L。
本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明在发酵过程中，通过在甲醇诱导表达阶段降低pH，可以控制菌体生长，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短的同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，表达量高达18.9g/L，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
具体实施方式
在本发明的具体实施例中，采用的菌株为表达重组人源胶原蛋白的毕赤酵母，为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC NO.5021，保藏日期为2011年6月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，初始阶段控制pH为5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后，控制pH为5.0，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.5g/L，发酵周期115小时，发酵生产水平为0.152g/L·h，与对比例1相比提高23.6％。
实施例2
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，初始阶段控制pH为5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后，控制pH为4.8，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.8g/L，发酵周期114小时，发酵生产水平为0.156g/L·h，与对比例1相比提高26.8％。
实施例3
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，初始阶段控制pH为5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后，控制pH为4.8，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.3g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.164g/L·h，与对比例1相比提高33.3％。
实施例4
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，初始阶段控制pH为5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后，控制pH为4.9，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.9g/L，发酵周期110小时，发酵生产水平为0.172g/L·h，与对比例1相比提高39.8％。
实施例5
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，初始阶段控制pH为5.4。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后，控制pH为5.0，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.8g/L，发酵周期108小时，发酵生产水平为0.165g/L·h。与对比例1相比提高34.1％。
实施例6
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，初始阶段控制pH为5.4。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后，控制pH为4.8，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.6g/L，发酵周期116小时，发酵生产水平为0.152g/L·h，与对比例1相比提高23.6％。
对比例1
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.0。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵120h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.1g/L，发酵周期134小时，发酵生产水平为0.120g/L·h。
对比例2
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中初始控制pH5.0。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，控制pH5.2。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵120h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为15.5g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.119g/L·h。
对比例3
发酵培养基：85％ H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.1。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵120h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.2g/L，发酵周期132小时，发酵生产水平为0.123g/L·h。

Claims (1)

1.调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母菌种种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧＞30％，初始阶段控制pH为5.3；当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时；甘油耗尽后，控制pH为4.9，开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段；调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，
其中，
所述的发酵培养基的配方为：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO418.2g/L； MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
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