CN109517777A - 一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明将硫酸软骨素AC裂解酶进行异源表达，选取信号肽amyQ，采用自行构建的pHA03载体，通过乳糖或异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，实现了硫酸软骨素AC裂解酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素AC裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子透明质酸的高效连续生产。本发明以食品级枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子透明质酸提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

Description

一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产硫酸软骨素AC裂解酶的枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名玻尿酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1,3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单位组成的线性多糖；每个双糖单位通过件β-(1,4)糖苷键与另一个双糖单位连接起来；其双糖单位可达25000个之多，分子量在20000～50000kDa之间。
透明质酸具有高度粘弹性和可塑性，超强的持水性和渗透性以及良好的生物相容性，被广泛应用于医学、药物、化妆品和食品等领域。透明质酸的粘弹性在关节腔内所起到的润滑、缓冲势作用及在结缔组织中充当填料的生物学功能之外，它还通过作用于细胞及细胞间质中的透明质酸受体，调节细胞功能，在组织生成和修复、肿瘤侵袭等过程中发挥重要作用。
目前工业生产透明质酸的方法通常包括组织提取和微生物发酵等，虽然工艺不同，但透明质酸分子量一般为20000～50000kDa，此类透明质酸因分子量较大，人体吸收及生物利用度较低，严重影响了透明质酸的疗效。因此，制备小分子透明质酸具有重要意义。
小分子透明质酸的制备方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使透明质酸发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子透明质酸的研究热点。
硫酸软骨素裂解酶(Chondroitinase,ChSase)是一类能将透明质酸降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。根据其作用底物的不同分为ChSase AC,ChSase AC,ChSase AC和ChSase C。硫酸软骨素裂解酶产生菌如表1所示，其中肝素黄杆菌Flavobacteriumheparinum是ChSase AC的主要来源。
表1硫酸软骨素裂解酶产生菌
目前，虽然ChSase AC重组菌已经构建，但是仅仅得到少量的可溶性蛋白，大多的ChSase AC以包涵体的形式存在。此外，小分子量透明质酸一般用于医药和食品领域，而大肠杆菌表达的ChSase AC并不适用于小分子量透明质酸的制备。国内对于ChSase AC的发酵生产主要的问题是：发酵生产ChSase AC酶活偏低，且多为胞内表达，而破碎过程必定会增加生产成本。因此，构建以分泌型生产ChSase AC的菌株具有更重要的经济、社会和环境意义。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，提供一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的基因工程菌及其构建方法，实现硫酸软骨素ABC裂解酶的分泌表达，以解决现有技术中硫酸软骨素ABC裂解酶表达量少、酶活低、存在包涵体等问题。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的基因工程菌在发酵制备硫酸软骨素ABC裂解酶中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供一种一步法高效小分子透明质酸的方法，通过设计的硫酸软骨素裂解酶-酶膜反应器实现了小分子透明质酸的一步法高效连续生产，并将昂贵的硫酸软骨素裂解酶循环利用，大大降低了生产成本。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-△spoOA或者B.subtilis WB800-△spoOA。
上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1S)将SEQID NO.1所示的基因序列克隆到表达载体上，得到重组质粒，所述表达载体为pHA03；
(2S)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，既得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶或小分子透明质酸中的应用。
一种小分子透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)透明质酸的制备：包括组织提取法和生物合成法；
(1-1)组织提取法：
(1-1a)动物组织预处理：将动物组织放入反应釜中，加入蒸馏水，控制温度为70～95℃，加热1～2h，除去上层油脂，得到软骨处理液；
(1-1b)酶解：用NaOH调节软骨预处理液的pH为7.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，使中性蛋白酶和胰蛋白酶的总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，继续酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；
酶解完成的确定：将0.5mol/L三氯乙酸滴加到酶解液中观察酶解液的混浊程度，酶解液不混浊或显微混浊，则证明酶解完成；
(1-1c)过滤：过滤步骤(1b)得到的混合液A，收集滤液，得到透明质酸溶液；
(1-2)微生物发酵法：
(1-2a)透明质酸的生物合成
将兽疫链球菌接种至接种至发酵培养基中，在发酵罐中培养，具体培养方法如下：
将培养好的斜面种子兽疫链球菌(S.zooepidemicus)接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，37℃，200rpm，过夜培养。按8％的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐(BioFlo 115,New Brunswick Scientific,USA)中，装液量为4.5L，搅拌转速400r/min，通气量1.0vvm，温度37℃，发酵18～20h，发酵罐中透明质酸发酵培养基配方为：酵母粉10g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸钠2g/L，蔗糖60g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙0.002g/L,氯化锌5×10-5g/L，硫酸铜2×10-5g/L，pH 7.0；
(1-2b)过滤：向发酵液中加体积分数为1‰～5‰的高岭土或者硅藻土，搅拌0.5～1h后用板框过滤机过滤除菌，得到含有透明质酸的滤液。
(2)吸附：将步骤(1-1c)或(1-2b)得到的透明质酸溶液分别泵入透明质酸专用吸附层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了透明质酸的层析柱；
吸附完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的吸附穿透液中，或将CPC滴加到吸附液中，若无透明质酸析出或溶液没有变浑浊，即吸附完成。
(3)除杂：用0.5％～1％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(2)得到的吸附了透明质酸的层析柱进行除杂处理；
除杂完成的确定方法：除杂穿透液中蛋白质浓度小于1‰时，除杂完成；
(4)洗脱：用2％～5％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对吸附了透明质酸的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有透明质酸；
洗脱完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的实时洗脱液中，若无透明质酸析出或溶液没有变浑浊，洗脱完成；
(5)脱盐：将步骤(4)得到的洗脱液A用孔径为100kDa～300kDa的超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；
脱盐完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的超滤截留液中，若仅溶液变浑浊，但无透明质酸沉淀析出，脱盐完成；
(6)透明质酸的连续降解：将步骤(5)得到超滤截留液Ⅰ泵入酶膜反应器的降解反应釜13中，向其中加入硫酸软骨素AC裂解酶，使硫酸软骨素AC裂解酶的总酶活与透明质酸质量的比例为2×105～6×105U：1kg，控制转速50～100rpm，温度25～40℃，降解反应进行1h后，开启酶膜反应器的超滤膜系统，小分子透明质酸透过超滤膜进入酶膜反应器的浓缩釜中，得到小分子透明质酸浓缩液；
透明质酸降解完成的确定方法：以CPC滴定法测定降解反应釜中透明质酸的浓度小于降解前透明质酸浓度的10％，即降解完成；
(7)除菌：对小分子透明质酸浓缩液进行除菌处理，得到无菌滤液；
(8)浓缩：将步骤(7)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液；
浓缩完成的确定方法：透明质酸浓度在100～150g/L时，即浓缩完成；
(9)干燥：将步骤(8)得到的无菌浓缩液泵入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子透明质酸成品。
步骤(6)中，所述的酶膜反应器包括如下部件：
各单元通过管道连接，主体部分包括降解反应釜(10)、超滤膜组件、浓缩釜13和纳滤膜组件(14)；
其中，所述降解反应釜(10)包括：夹套(8-1)、搅拌桨(9-1)、电机(2-1)、温度传感器(1-1)，所述夹套(8-1)包覆在降解反应釜(10-1)的外部，所述搅拌桨(9-1)与电机(2-1)连接，所述搅拌桨(9-1)、温度传感器(1-1)伸入反应釜(10-1)的内部，所述降解反应釜(10-1)的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件的一端连接；
所述所述超滤膜组件包括：第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)；所述第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)分别设有第一超滤液进口(12-1-1)、第二超滤液进口(12-1-2)、第三超滤液进口(12-1-3)，和第一超滤液出口(12-2-1)、第二超滤液出口(12-1-2)、第三超滤液出口(12-1-3)；所述第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)内均设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述第一超滤液进口(12-1-1)、第二超滤液进口(12-1-2)、第三超滤液进口(12-1-3)与反应液出口管道连接，所述第一超滤液出口(12-2-1)、第二超滤液出口(12-1-2)、第三超滤液出口(12-1-3)通过管道与浓缩釜(13)连接，所述第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)上分别设有第一超滤回流出口(16-1)、第二超滤回流出口(16-2)、第三超滤回流出口(16-3)，所述第一超滤回流出口(16-1)、第二超滤回流出口(16-2)、第三超滤回流出口(16-3)通过管道与降解反应釜(10-1)连接；
所述浓缩釜(13)包括：夹套(8-2)、搅拌桨(9-2)、电机(2-2)、温度传感器(1-2)，所述夹套(8-2)包覆在浓缩釜(13)的外部，所述搅拌桨(9-2)与电机(2-2)连接，所述搅拌桨(9-2)、温度传感器(1-2)伸入浓缩釜(13)的内部，所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道(7)，所述清水进入管道(7)上设有调节阀(3-5)和恒流泵(4-2)，所述浓缩釜(13)通过管道与膜过滤组件(14)连接；
所述膜过滤组件(14)包括进口(14-1)和出口(14-2)，所述膜过滤组件(14)中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为小于360Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件(14)的进口(14-1)通过管道与浓缩釜(13)连接。
步骤(6)中，所述硫酸软骨素AC裂解酶按照如下方法制备得到：
将权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养；再转接发酵培养基，发酵培养2～4小时至OD660达到0.6时，加入IPTG或乳糖诱导表达16～24h。
所述发酵培养基的配方如下：蔗糖8g/L，硫酸软骨素5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，CaCl2 2g/L，pH 6.5。
步骤(7)中，所述除菌处理，是利用0.01～0.10μm金属过滤器进行过滤除菌。
步骤(8)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度80～90℃，二效温度75～85℃，三效温度60～70℃，真空度为0.02～0.06MPa。
步骤(2)中，所述的树脂为BE-D82型透明质酸专用吸附树脂。
步骤(3)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为0.7％，流速为4BV/h；
步骤(4)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为3％，流速为2BV/h；
步骤(5)中，所述超滤膜的孔径优选为100kDa～300kDa；
其中步骤(6)中，反应釜中透明质酸优选质量浓度为3～5％；硫酸软骨素AC裂解酶优选添加量为5×104U：1kg；酶膜反应器中超滤膜组件的优选操作压力为0.15～0.25MPa；酶膜反应器中钠滤膜组件的优选操作压力为0.10～0.15MPa；酶膜反应器中超滤膜组件12和超滤膜组件14的优选循环流速为5～8L/min。
有益效果：
1、本发明采用食品级枯草芽孢杆菌作为生产菌株，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，安全无毒，操作简单，为重组硫酸软骨素裂解酶AC工业化生产小分子透明质酸提供了借鉴。
2、本发明设计的硫酸软骨素AC裂解酶-酶膜反应器，避免了酶的固定化操作，并使游离硫酸软骨素AC裂解酶得到了重复利用，有效降低了生产成本。
3、本发明通过生物降解法，从动物组织(或者微生物合成)中一步法制备了小分子透明质酸，减少了生产工序和能耗，降低了生产周期与生产成本，大大提高了利润空间，符合节约资源，环境友好的生产理念。
4、本发明将层析法和喷雾干燥法代替了传统工艺中乙醇沉淀透明质酸的步骤，此外本发明将动物组织提取透明质酸过程中的丙酮脱脂步骤用蒸煮除油法替代，避免了生产过程中易燃易爆(乙醇和丙酮)的使用，不仅解决生产中的安全问题，而且节能减排，经济效益显著。
5、本发明将生物降解法替代了物理降解法和化学降解法制备小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素的工艺，有效的保证了产品的生物活性和物理化学性质。
6、本发明根据生产要求选择使用酶膜反应器中膜分离系统12-1、12-2、12-3或者更换酶膜反应器的膜分离系统12-1、12-2、12-3中超滤膜(其他分子量截留超滤膜)，实现硫酸软骨素A、B、C分子量的可控连续生产。
7、本发明利用除菌膜对小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素溶液进行除菌处理，使其微生物指标达到检测标准，避免了传统辐照除菌引起的产品物理性状的改变。
附图说明
图1 pHA03质粒构建图；
图2 pHA03-cslAC质粒构建图；
图3硫酸软骨素AC裂解酶SDS-PAGE电泳图；
图4本发明酶膜反应器示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
图4中，1-1、1-2为温度传感器，2-1、2-2为电机，3-1～3-12为调节阀，4-1～4-4为恒流泵，5为原料/物料进口，6-1、6-2为空气阀，7为清水进口，8-1、8-2为夹套，9-1、9-2为搅拌器，10为降解反应釜，11-1、11-2为压力表，12-1～12-3为超滤膜组件，12-1-2、12-2-1、12-3-2超滤出口，13浓缩釜，14超滤膜组件，14-1超滤进口，14-2超滤出口，15-1、15-2物料出口，16-1、16-2、16-3超滤回流出口，17超滤回流出口。
本发明中酶膜反应器包括如下部件：
各单元通过管道连接，主体部分包括降解反应釜10、超滤膜组件、浓缩釜13和纳滤膜组件14；
其中，所述降解反应釜10包括：夹套8-1、搅拌桨9-1、电机2-1、温度传感器1-1，所述夹套8-1包覆在降解反应釜10-1的外部，所述搅拌桨9-1与电机2-1连接，所述搅拌桨9-1、温度传感器1-1伸入反应釜10-1的内部，所述降解反应釜10-1的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件的一端连接；
所述所述超滤膜组件包括：第一超滤柱12-1、第二超滤柱12-2、第三超滤柱12-3；所述第一超滤柱12-1、第二超滤柱12-2、第三超滤柱12-3分别设有第一超滤液进口12-1-1、第二超滤液进口12-1-2、第三超滤液进口12-1-3，和第一超滤液出口12-2-1、第二超滤液出口12-1-2、第三超滤液出口12-1-3；所述第一超滤柱12-1、第二超滤柱12-2、第三超滤柱12-3内均设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述第一超滤液进口12-1-1、第二超滤液进口12-1-2、第三超滤液进口12-1-3与反应液出口管道连接，所述第一超滤液出口12-2-1、第二超滤液出口12-1-2、第三超滤液出口12-1-3通过管道与浓缩釜13连接，所述第一超滤柱12-1、第二超滤柱12-2、第三超滤柱12-3上分别设有第一超滤回流出口16-1、第二超滤回流出口16-2、第三超滤回流出口16-3，所述第一超滤回流出口16-1、第二超滤回流出口16-2、第三超滤回流出口16-3通过管道与降解反应釜10-1连接；
所述浓缩釜13包括：夹套8-2、搅拌桨9-2、电机2-2、温度传感器1-2，所述夹套8-2包覆在浓缩釜13的外部，所述搅拌桨9-2与电机2-2连接，所述搅拌桨9-2、温度传感器1-2伸入浓缩釜13的内部，所述浓缩釜13上设有清水进入管道7，所述清水进入管道7上设有调节阀3-5和恒流泵4-2，所述浓缩釜13通过管道与膜过滤组件14连接；
所述膜过滤组件14包括进口14-1和出口14-2，所述膜过滤组件14中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为360Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件14的进口14-1通过管道与浓缩釜13连接。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌的构建。
利用GeneRunner软件设计引物，根据质粒pMA5基因序列设计引物(P1，P2和P3，P4)分别合成片段F1和F2；根据pHT43基因序列设计引物(P5，P6)合成片段F3；根据pUC55-MCS质粒基因序列设计引物(P7，P8)合成片段F4；根据P.heparinus ATCC13125基因组中硫酸软骨素AC裂解酶的基因(csl AC)设计引物(P9，P10)合成片段F5。
表2-3重组质粒构建所需引物
Table 2-3 Primers used for the recombinant plasmid construction
(1)穿梭质粒pHA03的构建
F1基因片段的扩增：在0.2mL Eppendorf管中按表2加入各试剂。其中模板DNA所使用的pMA5质粒由质粒快速抽提试剂盒提取。PCR循环参数为：94℃预变性30s，60℃ 30s；72℃ 3min；共循环35次。由聚合酶链式反应得到的产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
表2 PCR反应体系的组分
F2基因片段的扩增：在0.2mL Eppendorf管中按表2加入各试剂。其中模板DNA所使用的pMA5质粒由质粒快速抽提试剂盒提取。聚合酶链式反应循环参数为：94℃预变性30s，62℃ 30s；72℃ 2.3min；共循环35次。由聚合酶链式反应得到的产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
F3基因片段的扩增：在0.2mL Eppendorf管中按表2加入各试剂。其中，模板DNA所使用的pHT43质粒由质粒快速抽提试剂盒提取。聚合酶链式反应循环参数为：94℃预变性30s，61℃ 30s；72℃ 1.6min；共循环35次。由聚合酶链式反应得到的产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
F4基因片段的扩增：在0.2mL Eppendorf管中按表2加入各试剂。其中，模板DNA所使用的pUC55-MCS质粒由质粒快速抽提试剂盒提取。聚合酶链式反应循环参数为：94℃预变性30s，59℃ 30s；72℃ 1min；共35次循环。由聚合酶链式反应得到的产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
上述四个片段用MultiS试剂盒进行环化连接。在冰水浴条件下配制如表2-5中的反应体系，使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应0.5h。然后将其放入预先准备的冰水浴中冷却5min。再按照热休克转化方法将连接产物转入感受态E.coli DH5α中，37℃过夜培养，挑取克隆子，经液体LB培养12h后，抽提质粒酶切验证并进行测序。
表3环化反应体系的组分
(2)重组载体pHA03-csl AC的构建
F5基因片段的扩增：在0.2mL Eppendorf管中按表2加入各试剂。其中模板DNA所使用的P.heparinus ATCC13125基因组由基因组快速抽提试剂盒提取。PCR循环参数为：94℃预变性30s，58℃ 30s；72℃ 2min；共35次循环。扩增产物和质粒pHA03经BamH I和Xba I双酶切后，分别采用胶回收试剂盒纯化。用T4连接酶将线性化载体和目的片段在孵化器中16℃过夜连接，次日按照热休克转化方法将连接产物转入感受态E.coli DH5α中，37℃培养12h，挑取克隆子，再经液体LB培养12h后，将阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养并提取质粒，抽提质粒酶切验证并进行测序确认，重组质粒pHA03-csl AC构建成功。
(3)重组枯草芽孢杆菌构建
吸取5μL重组质粒pHA03-csl AC加入500μL枯草芽孢杆菌感受态中，在37℃恒温摇床中100rpm条件下培养1.5h，取转化菌液用涂布棒涂布于硫酸卡那霉素抗性平板。将阳性菌落接种于含有硫酸卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。经酶活测定结果可知，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒，即构建完成含硫酸软骨素AC裂解酶基因的重组枯草芽孢杆菌。
实施例2：硫酸软骨素AC裂解酶的诱导表达
将构建的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800-△spoOA-pHA03-csl AC接种于含有硫酸卡那霉素抗性的LB液体中培养基中，37℃过夜培养；再以4％接种量转接到1L含硫酸卡那霉素的发酵培养基中，发酵培养2～4h至OD660达到0.6时，加入8g/L的木糖进行诱导表达24h，发酵液上清液中硫酸软骨素AC裂解酶酶活可达16U/mL。
实施例3：发酵液的硫酸软骨素AC裂解酶酶活测定
取1mL的发酵液离心，分别取0.1mL上清液和7.9mL 1g/L硫酸软骨素A(0.02mol/LTris-HCL配制，pH7.5)，加入到15mL的比色管中，置于37℃水浴锅中反应20min，立即置于沸水浴中煮沸5min，对照管以相同的条件加入灭活的发酵液上清液，在232nm处测定光吸收值。酶的活力单位U定义为37℃条件下，每分钟催化形成1μmol不饱和双糖所需的酶量。
实施例4：以新鲜鸡为原料制备小分子透明质酸。
将1000kg新鲜鸡冠加入酶解反应釜中，加入2000kg蒸馏水，升温90℃，保持1h，除去上层油脂，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为5×108U的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，55℃酶解2h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为4×108U的中性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用板框过滤机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后，打入透明质酸专用层析柱内，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用0.7％的NaCl水溶液以4BV/h的流速对层析柱进行除杂处理；再用3％的NaCl水溶液以2BV/h的流速对层析柱进行洗脱处理，得到含有透明质酸的洗脱液；将洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜13中，并加入9×106U的硫酸软骨素AC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解1h后，开启超滤膜系统12-1(50kDa超滤膜)，实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行除菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子透明质酸成品45.3kg，产品收率为4.53％，平均分子量为45kDa；
注：可以通过使用不同的超滤系统(12-1、12-2或12-3)或者更换超滤系统中的超滤膜来控制透明质酸的分子量，最终实现透明质酸分子量的可控生产。
实施例5：
将2000kg新鲜牛眼加入酶解反应釜中，加入2000kg蒸馏水，升温90℃，保持1h，除去上层油脂，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为5×109U的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，55℃酶解2h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为2×108U的中性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用板框过滤机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后，打入透明质酸专用层析柱内，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用0.7％的NaCl水溶液以4BV/h的流速对层析柱进行除杂处理；再用3％的NaCl水溶液以2BV/h的流速对层析柱进行洗脱处理，得到含有透明质酸的洗脱液；将洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜13中，并加入6×105U的硫酸软骨素AC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解1h后，开启超滤膜系统12-2(100kDa超滤膜)，实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行除菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子透明质酸成品3.16kg，产品收率为1.58％，平均分子量为90kDa。
注：可以通过使用不同的超滤系统(12-1、12-2或12-3)或者更换超滤系统中的超滤膜来控制透明质酸的分子量，最终实现透明质酸分子量的可控生产。
实施例6：
将培养好的2支茄子瓶种子兽疫链球菌接种至装有300L种子培养基的500L发酵罐中培养，37℃，200rpm，过夜培养。按8％的接种量将种子培养基接入5000L的发酵罐中，装液量为3500L，搅拌转速150rpm，通气量1.0vvm，温度37℃，发酵18～20h。发酵结束后将3000L发酵液中加入9kg高岭土，搅拌半小时后，利用板框过滤机将发酵液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后，打入透明质酸专用层析柱内，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用0.7％的NaCl水溶液以4BV/h的流速对层析柱进行除杂处理；再用3％的NaCl水溶液以2BV/h的流速对层析柱进行洗脱处理，得到含有透明质酸的洗脱液；将洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜13中，并加入3.6×106U的硫酸软骨素AC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解1h后，开启超滤膜系统12-3(300kDa超滤膜)，实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行除菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子透明质酸成品18.34kg，产品收率为6.11％，平均分子量为280kDa。
注：可以通过使用不同的超滤系统(12-1、12-2或12-3)或者更换超滤系统中的超滤膜来控制透明质酸的分子量，最终实现透明质酸分子量的可控生产。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2037
<212> DNA
<213> 普通变形杆菌(P. heparinus )
<400> 1
cagcagaccg gtactgcaga actgattatg aagcgggtga tgctggacct taaaaagcct 60
ttgcgcaata tggataaggt ggcggaaaag aacctgaata cgctgcagcc tgacggtagc 120
tggaaggatg tgccttataa agatgatgcc atgaccaatt ggttgccaaa caaccacctg 180
ctacaattgg aaactattat acaggcttat attgaaaaag atagtcacta ttatggcgac 240
gataaagtgt ttgaccagat ttccaaagct tttaagtatt ggtatgacag cgacccgaaa 300
agccgcaact ggtggcacaa tgaaattgcc actccgcagg cccttggtga aatgctgatc 360
ctgatgcgtt acggtaaaaa gccgcttgat gaagcattgg tgcataaatt gaccgaaaga 420
atgaagcggg gcgaaccgga gaagaaaacg ggggccaaca aaacagatat cgccctgcat 480
tacttttatc gtgctttgtt aacgtctgat gaggctttgc tttccttcgc cgtaaaagaa 540
ttgttttatc ccgtacagtt tgtacactat gaggaaggcc tgcaatacga ttattcctac 600
ctgcagcacg gtccgcaatt acagatatcg agctacggtg ccgtatttat taccggggta 660
ctgaaacttg ccaattacgt tagggatacc ccttatgctt taagtaccga gaaactggct 720
atattttcaa agtattaccg cgacagttat ctgaaagcta tccgtggaag ttatatggat 780
tttaacgtag aaggccgcgg agtaagccgg ccagacattc taaataaaaa ggcagaaaaa 840
aagaggttgc tggtggcgaa gatgatcgat cttaagcata ctgaagaatg ggctgatgcg 900
atagccagga cagatagcac agttgcggcc ggctataaga ttgagcccta tcaccatcag 960
ttctggaatg gtgattatgt gcaacattta agacctgcct attcttttaa tgttcgtatg 1020
gtgagtaagc ggacccgacg cagtgaatcc ggcaataaag aaaacctgct gggcaggtat 1080
ttatctgatg gggctactaa catacaattg cgcggaccag aatactataa cattatgccg 1140
gtatgggaat gggacaagat tcctggcata accagccgtg attatttaac cgacagacct 1200
ttgacgaagc tttggggaga gcaggggagc aatgactttg caggaggggt gtctgatggt 1260
gtatacgggg ccagtgccta cgcattggat tacgatagct tacaggcaaa gaaagcctgg 1320
ttcttttttg acaaagagat tgtatgtctt ggtgccggta tcaacagcaa tgcccctgaa 1380
aacattacca ctacccttaa ccagagctgg ttaaatggcc cggttataag tactgcaggt 1440
aaaaccggcc ggggtaaaat aacaacgttt aaagcacagg gacagttctg gttgttgcac 1500
gatgcgattg gttattactt tcctgaaggg gccaacctta gtctgagtac ccagtcgcaa 1560
aaaggcaatt ggttccacat caacaattca cattcaaaag atgaagtttc tggtgatgta 1620
tttaagcttt ggatcaacca tggtgccagg ccagaaaatg cgcagtatgc ttatatcgtt 1680
ttgccgggaa taaacaagcc ggaagaaatt aaaaaatata atggaacggc accgaaagtc 1740
cttgccaata ccaaccagct gcaggcagtt tatcatcagc agttagatat ggtacaggct 1800
atcttctata cagctggaaa attaagcgta gcgggcatag aaattgaaac agataagcca 1860
tgtgcagtgc tgatcaagca catcaatggc aagcaggtaa tttgggctgc cgatccattg 1920
caaaaagaaa agactgcagt gttgagcatc agggatttaa aaacaggaaa aacaaatcgg 1980
gtaaaaattg attttccgca acaggaattt gcaggtgcaa cggttgaact gaaatag 2037
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctagaggtc gaaattcacc tcga 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcttaaga tgtggcgtgt tacg 24
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taacacgcca catcttaagc ttggagacaa ggtaaaggat aa 42
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acatgcatgc acatgattaa caattat 27
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ataattgtta atcatgtgca tgcaggcctt aactcacatt aa 42
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgatccttcc tcctttaatt 20
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggctgatgt ttttgtaatg atccttcctc ctt 33
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgaggtgaa tttcgacctc tagaggtacc gagct 35
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgggatccca gcagaccggt actgca 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctctagact atttcagttc aaccgt 26

Claims (10)

1.一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600-△spoOA或者B.subtilis WB800-△spoOA。
2.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1S)将SEQID NO.1所示的基因序列克隆到表达载体上，得到重组质粒，所述表达载体为pHA03；
(2S)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，既得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
3.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶或小分子透明质酸中的应用。
4.一种小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)透明质酸的制备：包括组织提取法和生物合成法；
(1-1)组织提取法：
(1-1a)动物组织预处理：将动物组织放入反应釜中，加入蒸馏水，控制温度为70～95℃，加热1～2h，得到软骨处理液；
(1-1b)酶解：用NaOH调节软骨预处理液的pH为7.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，使中性蛋白酶和胰蛋白酶的总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，继续酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；
(1-1c)过滤：过滤步骤(1b)得到的混合液A，收集滤液，得到透明质酸溶液；
(1-2)微生物发酵法：
(1-2a)透明质酸的生物合成
将兽疫链球菌接种至接种至发酵培养基中，在发酵罐中培养；
(1-2b)过滤：向发酵液中加体积分数为1‰～5‰的高岭土或者硅藻土，搅拌0.5～1h后用板框过滤机过滤除菌，得到含有透明质酸的滤液。
(2)吸附：将步骤(1-1c)或(1-2b)得到的透明质酸溶液分别泵入透明质酸专用吸附层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了透明质酸的层析柱；
(3)除杂：用0.5％～1％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(2)得到的吸附了透明质酸的层析柱进行除杂处理；
(4)洗脱：用2％～5％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对吸附了透明质酸的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有透明质酸；
(5)脱盐：将步骤(4)得到的洗脱液A用孔径为100kDa～300kDa的超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；
(6)透明质酸的连续降解：将步骤(5)得到超滤截留液Ⅰ泵入酶膜反应器的降解反应釜13中，向其中加入硫酸软骨素AC裂解酶，使硫酸软骨素AC裂解酶的总酶活与透明质酸质量的比例为2×105～6×105U：1kg，控制转速50～100rpm，温度25～40℃，降解反应进行1h后，开启酶膜反应器的超滤膜组件，小分子透明质酸透过超滤膜进入酶膜反应器的浓缩釜中，得到小分子透明质酸浓缩液；
(7)除菌：对小分子透明质酸浓缩液进行除菌处理，得到无菌滤液；
(8)浓缩：将步骤(7)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液；
(9)干燥：将步骤(8)得到的无菌浓缩液泵入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子透明质酸成品。
5.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的酶膜反应器包括如下部件：
各单元通过管道连接，主体部分包括降解反应釜(10)、超滤膜组件、浓缩釜(13)和纳滤膜组件14；
其中，所述降解反应釜(10)包括：夹套(8-1)、搅拌桨(9-1)、电机(2-1)、温度传感器(1-1)，所述夹套(8-1)包覆在降解反应釜(10-1)的外部，所述搅拌桨(9-1)与电机(2-1)连接，所述搅拌桨(9-1)、温度传感器(1-1)伸入反应釜(10-1)的内部，所述降解反应釜(10-1)的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件的一端连接；
所述所述超滤膜组件包括：第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)；所述第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)分别设有第一超滤液进口(12-1-1)、第二超滤液进口(12-1-2)、第三超滤液进口(12-1-3)，和第一超滤液出口(12-2-1)、第二超滤液出口(12-1-2)、第三超滤液出口(12-1-3)；所述第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)内均设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述第一超滤液进口(12-1-1)、第二超滤液进口(12-1-2)、第三超滤液进口(12-1-3)与反应液出口管道连接，所述第一超滤液出口(12-2-1)、第二超滤液出口(12-1-2)、第三超滤液出口(12-1-3)通过管道与浓缩釜(13)连接，所述第一超滤柱(12-1)、第二超滤柱(12-2)、第三超滤柱(12-3)上分别设有第一超滤回流出口(16-1)、第二超滤回流出口(16-2)、第三超滤回流出口(16-3)，所述第一超滤回流出口(16-1)、第二超滤回流出口(16-2)、第三超滤回流出口(16-3)通过管道与降解反应釜(10-1)连接；
所述浓缩釜(13)包括：夹套(8-2)、搅拌桨(9-2)、电机(2-2)、温度传感器(1-2)，所述夹套(8-2)包覆在浓缩釜(13)的外部，所述搅拌桨(9-2)与电机(2-2)连接，所述搅拌桨(9-2)、温度传感器(1-2)伸入浓缩釜(13)的内部，所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道(7)，所述清水进入管道(7)上设有调节阀(3-5)和恒流泵(4-2)，所述浓缩釜(13)通过管道与膜过滤组件(14)连接；
所述膜过滤组件(14)包括进口(14-1)和出口(14-2)，所述膜过滤组件(14)中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为360Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件(14)的进口(14-1)通过管道与浓缩釜(13)连接。
6.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述硫酸软骨素AC裂解酶按照如下方法制备得到：
将权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养；再转接发酵培养基，发酵培养2～4小时至OD660达到0.6时，加入IPTG或乳糖诱导表达16～24h。
7.根据权利要求6所述小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方如下：蔗糖8g/L，硫酸软骨素5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4 0.5g/L，K2HPO4·3H2O3g/L，CaCl2 2g/L，pH 6.5。
8.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述除菌处理，是利用0.01～0.10μm金属过滤器进行过滤除菌。
9.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度80～90℃，二效温度75～85℃，三效温度60～70℃，真空度为0.02～0.06MPa。
10.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的透明质酸专用吸附层析柱为为BE-D82型透明质酸专用吸附树脂。
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