CN113832088A - 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用 - Google Patents

一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113832088A
CN113832088A CN202110928705.XA CN202110928705A CN113832088A CN 113832088 A CN113832088 A CN 113832088A CN 202110928705 A CN202110928705 A CN 202110928705A CN 113832088 A CN113832088 A CN 113832088A
Authority
CN
China
Prior art keywords
heparin
heparinase
membrane
ultrafiltration
kettle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110928705.XA
Other languages
English (en)
Inventor
吴凌天
闫如玉
国兆宇
周茹
芮蝶
包天铮
刘思瑜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changshu Institute of Technology
Original Assignee
Changshu Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changshu Institute of Technology filed Critical Changshu Institute of Technology
Priority to CN202110928705.XA priority Critical patent/CN113832088A/zh
Publication of CN113832088A publication Critical patent/CN113832088A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01019—Heparinase (3.2.1.19)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用，属于生物工程技术领域。本发明将来源于普通变形杆菌Pedobacter heparinus ATCC13125的肝素酶进行异源表达，选取信号肽amyQ，pHT01载体，通过乳糖或异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，实现了肝素酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，并通过设计的肝素酶‑酶膜反应器实现了小分肝素的高效连续生产，并使肝素酶得到了循环利用，大大降低了生产成本。本发明以食品级枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子肝素的提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

Description

一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素的方法。
背景技术
肝素是天然的抗凝药物。在医学上广泛用作医用介入设备。此外，肝素与体外循环作为化疗药物和抗炎药物的助剂、生长因子的调节剂，肝素被用于治疗血液动力学紊乱、肠炎疾病、癌症、静脉血栓等疾病。
Figure BDA0003210210090000011
肝素具有聚合结构，因而肝素组合物通常包含分子量通常为5kDa～40kDa的肝素。小分子肝素的分子量一般为3kDa～8kDa，平均分子量为5kDa左右。与肝素相比，低分子肝素能被更好地被吸收，并且可以进行皮下给药；在血流中保留更长的时间；具有更可预测的临床响应。因此，制备小分子肝素具有重要意义。
制备小分子肝素方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使硫酸软骨素和透明质酸发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子肝素的研究的热点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，提供一种产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，实现了肝素酶的分泌表达，解决了肝素酶以包涵体存在的生产问题
本发明还要解决的技术问题是，提供上述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。
本发明最后解决的技术问题是，提供上述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备小分子肝素中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌中导入了肝素酶基因，所述肝素酶基因前具有扩增信号肽amyQ基因，所述肝素酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述扩增信号肽amyQ基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
上述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1s)将扩增信号肽amyQ基因与肝素酶Hap基因连接，得到重组基因片段；
(2s)将重组基因片段克隆到pHA01质粒中，得到重组质粒；
(3s)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，得到产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-△spoOA或者B.subtilis WB800-△spoOA。
一步法高效制备小分子肝素的方法，该方法包括如下步骤：
(1)基因工程菌的构建：
根据已报道的P.heparinus来源的肝素酶基因序列，设计引物通过体外扩增法得到SEQID NO.1所示的基因序列，再扩增信号肽amyQ。信号肽amyQ和肝素酶Hap基因通过重叠PCR组合成amyQ-Hap。再将amyQ-Hap和pHA01载体用限制性内切酶BamHI和XbaI分别进行双酶切。再将酶切后的2个基因片段用DNAT4连接酶连接，即得到重组质粒pHA01-amyQ-Hap；再将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，即得到重组枯草芽孢杆菌。
(2)肝素酶的诱导表达：
将重组枯草芽孢杆菌接种于5mL含有氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养；再以4％接种量转接200mL含氯霉素抗性的发酵培养基，发酵培养2～4h至OD660达到0.6～1.0时，加入乳糖或IPTG诱导表达16～24h。
(3)小分子肝素制备：
(3a)原料预处理：将原料(猪肠粘液、猪肺、牛肺或者羊肺)放入反应釜中，加入适量蒸馏水，控制温度为70～95℃，加热1～4h；
(3b)酶解：用NaOH调节步骤(3a)得到的软骨预处理液的pH为8.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，使总酶活与原料质量的比例为1×104～6×104U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，使总酶活与原料质量的比例为1×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；
酶解完成的确定：将0.5mol/L三氯乙酸滴加到酶解液中观察酶解液的混浊程度，酶解液不混浊或显微混浊，则证明酶解完成；
(3c)过滤：过滤步骤(3b)得到的混合液A，收集滤液；
(3d)吸附：将步骤(3c)得到的滤液加入肝素专用吸附层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了肝素的层析柱；
吸附完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的吸附穿透液中，或将CPC滴加到吸附液中，若无肝素析出或溶液没有变浑浊，即吸附完成。
(3e)除杂：用50～80g/L的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(3d)得到的吸附了肝素的层析柱进行除杂处理；
除杂完成的确定方法：除杂穿透液中蛋白质浓度小于1‰时，除杂完成；
(3f)洗脱：用200～260g/L的NaCl水溶液以1～3BV/h的流速对吸附了肝素的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有肝素；
洗脱完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的实时洗脱液中，若无肝素析出或溶液没有变浑浊，洗脱完成。
(3g)脱盐：将步骤(3f)得到的洗脱液A用超滤系统2kDa～5kDa超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；
脱盐完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的超滤截留液中，若仅溶液变浑浊，但无肝素沉淀析出，脱盐完成；
(3h)肝素的连续降解：将步骤(3g)得到超滤截留液I泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，向其中加入肝素酶，使肝素酶的总酶活与肝素质量的比例为1×104～6×104U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃。同时开启超滤膜系统，小分子肝素透过超滤膜进入浓缩釜中，大分子肝素被截留返回到降解反应釜中继续降解，肝素酶则被截留返回到降解反应釜中循环利用。当浓缩釜中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜中被循环利用，小分子肝素被截留返回到浓缩釜13中继续浓缩。
肝素降解完成的确定方法：以CPC滴定法测定降解反应釜中肝素的浓度小于降解前肝素浓度的10％，即降解完成。
(3i)除菌：对步骤(3h)浓缩釜13中得到的纳滤截留液I进行除菌处理，得到无菌滤液I；
(3j)浓缩：将步骤(3i)得到无菌滤液I通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液Ⅰ；
(3k)干燥：将步骤(3j)得到的无菌浓缩液Ⅰ加入用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到小分子肝素成品；
其中，步骤(2)中，所述的发酵培养基优选成分为：糖蜜20g/L，酵母粉8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 5g/L，pH 6.5。
其中，步骤(2)中，所述的重组枯草芽孢杆菌表达肝素酶的时机是OD660为0.4～1.2，优选0.8；所述的诱导剂乳糖浓度为10～40g/L，优选20g/L(或IPTG 40～200mg/L，优选80mg/L)；所述优选诱导表达时间为16～20h。
其中，步骤(3a)中，所述的原料为猪小肠粘膜、猪肺、牛肺和羊肺中的一种或几种的混合物，反应釜中，水与原料的质量比为0.5～1：1；
其中，步骤(3b)中，所述的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加量按照酶活比为1：3添加；所述的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的添加量按照酶活比为1：5添加；优选木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶的添加量是3×105U：1kg，优选菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的添加量是4×105U：1kg。
其中，步骤(3d)中，所述的树脂为RD 35吸附树脂。
其中步骤(3e)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为60g/L，流速为5BV/h；
其中步骤(3f)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为220g/L，流速为1.5BV/h；
其中步骤(3g)中，所述的脱盐超滤系统中超滤膜的优选孔径为2kDa；
其中步骤(3h)中，所述的肝素优选浓度为3～5％；肝素酶优选添加量为5×104U：1kg；酶膜反应器中超滤膜系统12的优选操作压力为0.15～0.25MPa；酶膜反应器中纳滤膜系统14的优选操作压力为0.10～0.15MPa；酶膜反应器中超滤膜系统12和纳滤膜系统14的优选循环流速为5～10L/min；
其中，步骤(3i)中，所述除菌处理，是利用0.01～0.22μm除菌膜过滤除菌，优选0.1μm的金属除菌过滤器。
有益效果：
1、本发明采用食品级枯草芽孢杆菌作为生产菌株，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，安全无毒，操作简单，为重组枯草芽孢杆菌工业化生产小分子肝素提供了借鉴。
2、设计的肝素酶-酶膜反应器，避免了酶的固定化操作，并使游离肝素酶得到了重复利用，有效降低了生产成本。
3、本发明通过生物降解法，从动物组织(液)中一步法制备了小分子肝素，减少了生产工序和能耗，降低了生产周期与生产成本，符合节约资源，环境友好的生产理念。
4、本发明将生物降解法替代了物理降解法和化学降解法制备小分子肝素的工艺，有效的保证了产品的生物活性和物理化学性质。
5、本发明利用除菌膜对小分子肝素溶液进行灭菌处理，使其微生物指标达到检测标准，避免了传统辐照灭菌引起的产品物理性状的改变。
6、本发明将层析法和冷冻干燥法代替了传统工艺中乙醇沉淀肝素的步骤，避免了易燃易爆品-乙醇的使用，不仅解决生产中的安全问题，而且节能减排，经济效益显著。
7、本发明将酶膜反应器用于小分子肝素的生产，可根据生产要求更改膜分离系统12中超滤膜的膜孔径实现肝素的分子量可控连续生产。
附图说明
图1重组pHT01-amyQ-Hap构建流程图；
图2肝素酶的SDS-PAGE电泳图；
图3酶膜反应器结构示意图；
图4酶膜反应器操作稳定性(批次反应收率)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
图3中，1-1、1-2为温度传感器，2-12-2为电机，3-1～3-11为调节阀，4-1～4-4为恒流泵，5为原料/物料进口，6-1、6-2为空气阀，7为清水进口，8-1、8-2为夹套，9-1、9-2为搅拌器，10降解反应福，11-2、11-2为压力表，12为超滤膜组件，12-1为超滤进口，12-2为超滤出口，13为浓缩福，14为纳滤膜组件，14-1/14-2为纳滤进/处口，15-1、15-2为物料出口，16为超滤回流出口，17为纳滤回流出口。
本发明中的酶膜反应器包括如下部件：
降解反应釜10、超滤膜组件12、浓缩釜13和膜过滤组件14；
所述降解反应釜10包括：夹套8-1、搅拌桨9-1、电机2-1、温度传感器1-1，所述夹套8-1包覆在降解反应釜10-1的外部，所述搅拌桨9-1与电机2-1连接，所述搅拌桨9-1、温度传感器1-1伸入反应釜10-1的内部，所述降解反应釜10-1的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件12的一端连接，所述反应液出口管道上设有料液出口15-1；
所述超滤膜组件12包括：超滤液进口12-1、超滤液出口12-2，所述超滤膜组件12内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述超滤液进口12-1与反应液出口管道连接，所述超滤液出口12-2通过管道与浓缩釜13连接，所述超滤膜组件12上设有超滤回流出口16，所述超滤回流出口16通过管道与降解反应釜10-1连接；
所述浓缩釜13包括：夹套8-2、搅拌桨9-2、电机2-2、温度传感器1-2，所述夹套8-2包覆在浓缩釜13的外部，所述搅拌桨9-2与电机2-2连接，所述搅拌桨9-2、温度传感器1-2伸入浓缩釜13的内部，所述浓缩釜13上设有清水进入管道7；
所述膜过滤组件14包括进口14-1和出口14-2，所述膜过滤组件14中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为500Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件14的进口14-1通过管道与浓缩釜13连接。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌的构建
信号肽amyQ的扩增：以质粒pHT43为模板，扩增信号肽amyQ基因片段。PCR扩增体系为基因组1μL，引物1和引物2各4μL,KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后62℃退火30s，72℃延伸0.2min，循环35次；72℃延伸1min。将PCR产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到纯化的amyQ基因片段。
肝素酶基因的扩增：以P.heparinus ATCC13125的基因组为模板，扩增肝素酶基因基因片段。PCR扩增体系为基因组DNA 1μL，引物3和引物4各4μL，KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸1min。将PCR产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到纯化的肝素酶基因片段。
表1重组枯草芽孢杆菌构建所需引物
Figure BDA0003210210090000071
信号肽amyQ和肝素酶基因的整合：重叠PCR扩增体系为：纯化的amyQ基因片段和纯化的肝素酶基因片段各1μL，KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1.2min，循环5次；72℃延伸1min。向上述PCR产物中加入引物1和引物4各4μL，继续扩增，PCR反应程序同上。将PCR产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到纯化的amyQ-Hap基因片段。
amyQ-Hap基因片段双酶切：酶切体系为10×QuickCut Green Buffer 10μL，已纯化的amyQ-Hap基因片段86μL，QuickCut BamHI和QuickCut XbaI各2μL，将上述加入离心管中，轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温20min。将酶切产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到酶切的amyQ-Hap基因片段。
线性pHT01载体的制备：双酶切体系为10×QuickCut Green Buffer 10μL，pHT01环状质粒86μL，QuickCut BamHI和QuickCut XbaI各2μL，将上述加入离心管中，轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温20min。将酶切产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到线性化pHT01载体。
重组质粒pHT01-amyQ-Hap的构建：将线性化pHT01载体和酶切的amyQ-Hap基因片段通过T4 DNA连接酶过夜环化连接，将环化产物连接加入100μL感受态DH 5α细胞中，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速置于冰上1～3min。加入新鲜的LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min，取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12～16h。将阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养并提取质粒，送测序公司测序确认，重组质粒pHT01-amyQ-Hap构建成功。
重组枯草芽孢杆菌构建：吸取5μL重组质粒pHT01-amyQ-Hap加入500μL枯草芽孢杆菌感受态中，在37℃恒温摇床中100rpm条件下培养1.5h，取转化菌液用涂布棒涂布于氯霉素抗性平板。将阳性菌落接种于含有氯霉素抗性的LB液体培养基中培养。经酶活测定结果可知，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒，即构建完成含肝素酶基因的重组枯草芽孢杆菌。
实施例2：肝素酶的诱导表达
将构建的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800-△spoOA-pHT01-amyQ-Hap接种于含有氯霉素抗性的LB液体中培养基中，37℃过夜培养；再以4％接种量转接到1L含氯霉素的发酵培养基中，发酵培养2～4h至OD660达到0.8时，加入20g/L的乳糖或者80mg/L IPTG进行诱导表达24h，发酵液上清液中肝素酶酶活可达3200U/mL。
实施例3：发酵液的肝素酶酶活测定
取1mL的发酵液离心，分别取0.5mL发酵上清液和1.5mL 25g/L肝素(0.02mol/LTris-HCL配制，pH7.5)，加入到石英比色皿中，30℃孵育反应，在232nm处扫描1min，计算反应的斜率k(min-1)。肝素酶的酶活(U/L)计算公式如下：
Figure BDA0003210210090000081
实施例4：以猪小肠粘膜为原料一步法制备小分子肝素。
将1000根猪小肠上刮下的肠粘膜加入酶解反应釜中，加入10kg蒸馏水，升温到85℃，保持1h，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为3×107U的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，55℃酶解2h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为4×108U的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用碟片离心机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至8.5后，打入肝素专用吸附层析柱内，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用60g/L的NaCl水溶液以4BV/h的流速对肝素的层析柱进行除杂处理；再用220g/L的NaCl水溶液以1.5BV/h的流速对肝素的层析柱进行洗脱处理，得到含有肝素的洗脱液；将含有肝素的洗脱液用2kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的肝素溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，并加入8×106U的肝素酶，50rpm，30℃条件下进行反应。同时开启超滤膜系统12(2kDa)，实现小分子肝素与肝素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，将小分子肝素溶液浓缩。对小分子肝素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用冷冻干燥器进行干燥，得到无菌小分子肝素成品，产品收率为9.3万U效价/根猪小肠，小分子肝素平均分子量为1950Da；
如果制备其他不同分子量的肝素，只需更换酶膜反应器中，超滤系统12的不同孔径的超滤膜即可实现。
实施例5：以牛肺、猪肺和羊肺为原料一步法制备小分子肝素。
将1000kg牛肺、猪肺和羊肺的混合物加入酶解反应釜中，加入1000kg蒸馏水，升温到85℃，保持1h，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为2×107U的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，55℃酶解2h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为1×108U的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用碟片离心机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至8.5后，打入肝素专用吸附层析柱内，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用60g/L的NaCl水溶液以4BV/h的流速对肝素的层析柱进行除杂处理；再用220g/L的NaCl水溶液以1.5BV/h的流速对肝素的层析柱进行洗脱处理，得到含有肝素的洗脱液；将含有肝素的洗脱液用2kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的肝素溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，并加入4×105U的肝素酶，50rpm，30℃条件下进行反应。同时开启超滤膜系统12(5kDa)，实现小分子肝素与肝素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，将小分子肝素溶液浓缩。对小分子肝素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用冷冻干燥器进行干燥，得到无菌小分子肝素成品，产品收率为9.3万U效价/根猪小肠，小分子肝素平均分子量为1950Da；
如果制备其他不同分子量的肝素，只需更换酶膜反应器中，超滤系统12的不同孔径的超滤膜即可实现。
实施例6：小分子肝素的连续生产
其他操作步骤均与实施例4、5相同，所不同的是，在第一批次降解反应完成之后，继续向降解反应釜10中投料，且投料量不变，但硫酸软骨素AC裂解酶不再添加，后续降解反应所需硫酸软骨素AC裂解酶实质是将第一批次降解反应的酶进行循环利用，即小分子肝素的连续批次生产。但随着酶的逐渐失活，后续批次降解反应所需时间逐渐增长，当降解反应时间延长为原来1倍时，向降解反应釜10中加入与第一批次等酶活的硫酸软骨素AC裂解酶。
实施例7：酶膜反应器的操作稳定性
其他操作步骤均与实施例4、5、相同，所不同的是，对酶膜反应器的操作稳定性进行考察。生产中酶膜反应器中的硫酸软骨素AC裂解酶是反复使用的，在连续投料(投料量不变，降解时间不变)6批次情况下，分别考察小分子肝素的收率(见附图4)，酶膜反应器在制备小分子肝素时具有较好的操作稳定性。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1092
<212> DNA
<213> 肝素杆菌(P. heparinus)
<400> 1
cagcaaaaaa aatccggtaa catcccttac cgggtaaatg tgcaggccga cagtgctaag 60
cagaaggcga ttattgacaa caaatgggtg gcagtaggca tcaataaacc ttatgcatta 120
caatatgacg ataaactgcg ctttaatgga aaaccatcct atcgctttga gcttaaagcc 180
gaagacaatt cgcttgaagg ttatgctgca ggagaaacaa agggccgtac agaattgtcg 240
tacagctatg caaccaccaa tgattttaag aaatttcccc caagcgtata ccaaaatgcg 300
caaaagctaa aaaccgttta tcattacggc aaagggattt gtgaacaggg gagctcccgc 360
agctatacct tttcagtgta cataccctcc tccttccccg acaatgcgac tactattttt 420
gcccaatggc atggtgcacc cagcagaacg cttgtagcta caccagaggg agaaattaaa 480
acactgagca tagaagagtt tttggcctta tacgaccgca tgatcttcaa aaaaaatatc 540
gcccatgata aagttgaaaa aaaagataag gacggaaaaa ttacttatgt agccggaaag 600
ccaaatggct ggaaggtaga acaaggtggt tatcccacgc tggcctttgg tttttctaaa 660
gggtattttt acatcaaggc aaactccgac cggcagtggc ttaccgacaa agccgaccgt 720
aacaatgcca atcccgagaa tagtgaagta atgaagccct attcctcgga atacaaaact 780
tcaaccattg cctataaaat gccctttgcc cagttcccta aagattgctg gattactttt 840
gatgtcgcca tagactggac gaaatatgga aaagaggcca atacaatttt gaaacccggt 900
aagctggatg tgatgatgac ttataccaag aataagaaac cacaaaaagc gcatatcgta 960
aaccagcagg aaatcctgat cggacgtaac gatgacgatg gctattactt caaatttgga 1020
atttacaggg tcggtaacag cacggtcccg gttacttata acctgagcgg gtacagcgaa 1080
actgccagat ag 1092
<210> 2
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60
tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcc 93
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccat gattcaaaaa cgaaagcgga ca 32
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatgttaccg gatttttttt gctgggctga tgtttttgta atcggcaa 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgccgatta caaaaacatc agcccagcaa aaaaaatccg gtaacatc 48
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctctagact atctggcagt ttcgctgtac cc 32

Claims (8)

1.一株产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌中导入了肝素酶基因，所述肝素酶基因前具有扩增信号肽amyQ基因，所述肝素酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述扩增信号肽amyQ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要请求1所述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1s)将扩增信号肽amyQ基因与肝素酶Hap基因连接，得到重组基因片段；
(2s)将重组基因片段克隆到pHA01质粒中，得到重组质粒；
(3s)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，得到产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
3.根据权利要求2所述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-△spoOA或者B.subtilisWB800-△spoOA。
4.一种小分子肝素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)原料预处理：将肝素制备原料放入反应釜中，控制温度为70～95℃，加热1～4h，得到软骨处理液；
(2)酶解：用NaOH调节步骤(1)得到的软骨预处理液的pH为8.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，使总酶活与原料质量的比例为1×104～6×104U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，使总酶活与原料质量的比例为1×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；
(3)过滤：过滤步骤(2)得到的混合液A，收集滤液；
(4)吸附：将步骤(3)得到的滤液加入肝素专用吸附层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了肝素的层析柱；
(5)除杂：用50～80g/L的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(4)得到的吸附了肝素的层析柱进行除杂处理；
(5)洗脱：用200～260g/L的NaCl水溶液以1～3BV/h的流速对吸附了肝素的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有肝素；
(6)脱盐：将步骤(5)得到的洗脱液A用超滤系统2kDa～5kDa超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；
(7)肝素的连续降解：将步骤(6)得到超滤截留液I泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，向其中加入肝素酶，使肝素酶的总酶活与肝素质量的比例为1×104～6×104U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃；同时开启超滤膜系统12，小分子肝素透过超滤膜进入浓缩釜13中，大分子肝素被截留返回到降解反应釜10-1中继续降解，肝素酶则被截留返回到降解反应釜10中循环利用。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统14，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜10中被循环利用，小分子肝素被截留返回到浓缩釜13中继续浓缩，得到小分子肝素溶液；
(8)除菌：对步骤(7)浓缩釜13中得到的纳滤截留液I进行除菌处理，得到无菌滤液I；
(9)浓缩：将步骤(8)得到无菌滤液I通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液Ⅰ；
(10)干燥：将步骤(9)得到的无菌浓缩液Ⅰ加入用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到小分子肝素成品。
5.根据权利要求4所述小分子肝素的制备方法，其特征在于，所述肝素酶按照如下方法制备：
将产肝素酶的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养；再转接到发酵培养基中，发酵培养2～4h至OD660达到0.6～1.0时，加入乳糖或IPTG诱导表达16～24h，得到肝素酶。
6.根据权利要求4所述小分子肝素的制备方法，其特征在于，所述的酶膜反应器包括如下部件：
降解反应釜(10)、超滤膜组件(12)、浓缩釜(13)和膜过滤组件(14)；
所述降解反应釜(10)包括：夹套(8-1)、搅拌桨(9-1)、电机(2-1)、温度传感器(1-1)，所述夹套(8-1)包覆在降解反应釜(10-1)的外部，所述搅拌桨(9-1)与电机(2-1)连接，所述搅拌桨(9-1)、温度传感器(1-1)伸入反应釜(10-1)的内部，所述降解反应釜(10-1)的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件(12)的一端连接，所述反应液出口管道上设有料液出口(15-1)；
所述超滤膜组件(12)包括：超滤液进口(12-1)、超滤液出口(12-2)，所述超滤膜组件(12)内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述超滤液进口(12-1)与反应液出口管道连接，所述超滤液出口(12-2)通过管道与浓缩釜(13)连接，所述超滤膜组件(12)上设有超滤回流出口(16)，所述超滤回流出口(16)通过管道与降解反应釜(10-)连接；
所述浓缩釜(13)包括：夹套(8-2)、搅拌桨(9-2)、电机(2-2)、温度传感器(1-2)，所述夹套(8-2)包覆在浓缩釜(13)的外部，所述搅拌桨(9-2)与电机(2-2)连接，所述搅拌桨(9-2)、温度传感器(1-2)伸入浓缩釜(13)的内部，所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道(7)；
所述膜过滤组件(14)包括进口(14-1)和出口(14-2)，所述膜过滤组件(14)中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为500Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件(14)的进口(14-1)通过管道与浓缩釜(13)连接。
7.根据权利要求5所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，步骤(8)中，所述除菌处理，是利用0.01～0.10μm金属过滤器进行过滤除菌。
8.根据权利要求5所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，步骤(9)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度80～90℃，二效温度75～85℃，三效温度60～70℃，真空度为0.03～0.06MPa。
CN202110928705.XA 2021-10-26 2021-10-26 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用 Pending CN113832088A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110928705.XA CN113832088A (zh) 2021-10-26 2021-10-26 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110928705.XA CN113832088A (zh) 2021-10-26 2021-10-26 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113832088A true CN113832088A (zh) 2021-12-24

Family

ID=78960429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110928705.XA Pending CN113832088A (zh) 2021-10-26 2021-10-26 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113832088A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533628A (zh) * 2012-02-24 2012-07-04 山东大学 一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶ⅰ中的应用
CN109517777A (zh) * 2018-11-27 2019-03-26 常熟理工学院 一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533628A (zh) * 2012-02-24 2012-07-04 山东大学 一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶ⅰ中的应用
CN109517777A (zh) * 2018-11-27 2019-03-26 常熟理工学院 一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SASISEKHARAN,R.: "Flavobacterium heparinum (clone pRSHEP.51) heparinase protein, complete，Accesion Number：cdsL12534.1", 《NCBI BLAST》 *
TANG,S. 等: "Bacillus amyloliquefaciens strain Z3 alpha-amylase mRNA, complete cds，Accession Number：MN006769.1", 《NCBI BLAST》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109988739B (zh) 一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法
EP2435578B1 (en) Biotechnological production of chondroitin
CN108707573B (zh) 一种产生n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用
CN101974587A (zh) 一种高效表达人血清白蛋白的方法
CN111733200A (zh) 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺
CN113801240B (zh) 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
CN113106112B (zh) 一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用
CN109517777B (zh) 一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用
CN104152515B (zh) 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法
CN109988723B (zh) 一株产硫酸软骨素abc裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用
CN111500479B (zh) 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用
CN113832088A (zh) 一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用
CN111455003A (zh) 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法
CN111777680A (zh) 一种提高重组胶原蛋白溶液稳定性的分离纯化工艺
CN108865913B (zh) 一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法
CN107778365A (zh) 一种多点整合的重组蛋白表达方法
CN102604881A (zh) 生产l-异亮氨酸的工程菌及其应用
CN112646044B (zh) TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法
CN111944795B (zh) 谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
Wu et al. Enhancement of polysialic acid yield by reducing initial phosphate and feeding ammonia water to Escherichia coli CCTCC M208088
CN113249234A (zh) 一种过表达cat和god的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法
CN110527690A (zh) 一种耐热型单宁酶及其应用
CN114480354A (zh) 一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法
CN114853863B (zh) 一种重组类贻贝粘蛋白纯化方法
CN116286575B (zh) 一种利用枯草芽孢杆菌高效表达生淀粉α-淀粉酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination