CN111455003A

CN111455003A - 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法

Info

Publication number: CN111455003A
Application number: CN202010361005.2A
Authority: CN
Inventors: 陈小燕; 余强; 张宇; 袁振宏; 王忠铭
Original assignee: Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明提供了一种微藻制备D‑阿洛酮糖的方法。该方法利用纤维素酶对微藻干物质进行酶解糖化得到微藻酶解液，同时构建一株具有生物转化D‑阿洛酮糖的大肠杆菌重组菌株，利用该重组菌株对微藻酶解液进行异构化转化，将产物进行色谱分离处理，最后得到95％纯度的D‑阿洛酮糖。本发明以微藻为原料制备D‑阿洛酮糖，可以有效地降低D‑阿洛酮糖的生产成本，对于加速其工业化进程具有积极意义。

Description

一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法

技术领域

本发明涉及基因工程、生物催化技术和生物发酵领域，具体涉及一种生物转化D-阿洛酮糖的大肠杆菌重组菌以及利用该重组菌以微藻为原料制备D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

稀有糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，其在膳食、保健、医药等领域中具有重要的潜在应用价值。D-阿洛酮糖，果糖C-3异构体，作为稀有糖之一，其甜度是蔗糖的70％，而热量仅为后者的0.3％，是蔗糖的良好替代品。动物实验证明D-阿洛酮糖具有独特的营养学和生理学功能，如能降低血糖，可作为II型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；能降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积等。D-阿洛酮糖具有独特的营养学和生理学功能，2011年被美国食品及药品管理局(FDA)批准为GRAS(一般认为安全，Generally Recognized as Safe)食品，允许应用于医药制剂、食品、膳食补充剂中，其开发前景广阔，具有优良的应用价值。

自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，其生产方法可分为两种：化学法和生物法。化学法的副产品多，分离纯化困难。生物法具有反应简单，产物单一，纯化方便等优点。生物转化法主要利用Carbohydrate Epimerase(糖类差向异构酶)、Oxidoreductases(氧化还原酶)、Keto-aldol Isomerases(醛酮糖异构酶)等酶作为催化剂，在不同单糖(主要为四碳糖、五碳糖、六碳糖)之间相互转化以获得目的稀有糖。在上述酶中，D-塔格糖-3-差向异构酶(DTEase)可催化D-果糖的C-3位差向异构，生成D-阿洛酮糖。第一个被发现的DTEase因其最适底物为D-塔格糖而命名，随后在不同的微生物中，如Agrobacterium tumefaciens、Rhodobacter sphaeroides SK011、Clostridium cellulolyticum H10、Ruminococcussp.、Clostridium scindens、Desmospora sp.、Dorea sp.CAG317、Treponema primitia和Arthrobacter globiformis等菌株均发现该酶的存在，且因为该酶的最适底为D-阿洛酮糖，因此又称为D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)。

国内外有许多文献报道关于以果糖为底物，D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化制备D-阿洛酮糖的研究。但是D-果糖的价格昂贵，导致D-阿洛酮糖的生产成本相当昂贵。以相对低廉的D-葡萄糖为原料制备D-阿洛酮糖受到了研究人员的关注。

木质纤维素生物质是自然界最丰富且廉价的原料，由纤维素水解产生的葡萄糖含量可达20-50％，利用纤维素原料发展综合生物炼制为高值产品经济化带来新的方向。以纤维素为原料制备D-阿洛酮糖鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低成本的，高效的，适合工业化制备D-阿洛酮糖产品的方法，具体提供一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：

(1)将微藻进行酶解处理，得到含有糖化产物的混合物；

(2)将步骤(1)得到的混合物与大肠杆菌重组菌株混合进行异构化反应，得到葡萄糖/果糖/D-阿洛酮糖的混合物，将混合物分离，得到D-阿洛酮糖；

所述的大肠杆菌重组菌株含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA。

上述，步骤(1)中的酶解处理具体为：将微藻和纤维素酶混合，纤维素酶的加入量为10-200PFU/g微藻干物质(即1g微藻干物质加入10-200PFU纤维素酶)，在pH为4.0-6.0，温度为30-50℃的条件下反应48-72h。

步骤(2)中的异构化反应是在pH为6-10，温度为30-60℃的条件下反应24-72h；优选，所述的异构化反应是在pH为7.5，温度为50℃的条件下反应24h；所述的异构化反应体系含有Co²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺金属离子中的至少一种。

所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE克隆于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CGMCC 1.1488，木糖异构酶基因XYLA克隆于大肠杆菌(E.coli)MG1665。

所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该酶的编码基因含有870bp核苷酸，编码的蛋白质理论分子量约为34kDa。

所述的木糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该酶的编码基因含有1350bp核苷酸，编码的蛋白质理论分子量约为50kDa。

所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA单独或者串联连接于大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上，在T7强启动子的作用下，实现D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA的过量表达。

所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA均存在于非基因组的独立复制质粒。

本发明还提供一种重组表达载体，该重组表达载体含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA；所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，木糖异构酶基因XYLA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种将D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA在大肠杆菌中串联表达质粒的构建方法，具体步骤为：

1、合成一条基因序列，该序列含有T7启动子序列、核糖体结合位点、多克隆限制性内切酶区域，该基因序列如SEQ ID NO.5所示；

2、通过1对限制性内切酶(NotI和XhoI)的作用对上述基因序列(SEQ ID NO.5)进行酶切。大肠杆菌原始表达质粒pET28a进行同样的酶切处理。将两个酶切序列进行连接反应，构建新质粒pET-28a(+)-dual。设计2对引物，分别含有质粒pET-28a(+)-dual的2个酶切位点及DPE和XYLA的部分起始和终止核酸序列，其中一对用于扩增DPE基因序列，另一对用于扩增XYLA序列。获得的序列进行酶切后，共同连接至质粒pET-28a(+)-dual，构建重组表达质粒28a-DPE-XYLA。

本发明还提供一种重组菌株，该重组菌株含有上述的重组表达载体。所述的重组菌株的宿主菌株为大肠杆菌、酵母菌、棒状杆菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。优选，所述的宿主菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。更优选，所述的宿主菌株为大肠杆菌，如大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。

本发明的重组表达载体或重组菌株可应用于生物转化制备D-阿洛酮糖。

将构建的重组表达质粒28a-DPE-XYLA转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/DPE-XYLA，菌株经诱导产酶12小时以后，重组细胞转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的产量达到了12％，转化微藻酶解液生成D-阿洛酮糖量为5.8g/L，说明本发明的重组菌株对木质纤维素水解液(如微藻酶解液)具有很好转化生成阿洛酮糖的能力，在木质纤维素物质高值化产品炼制工业具有重要的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例中的D-阿洛酮糖生物转化大肠杆菌重组菌株的构建方法与应用示意图

图2是本发明的表达载体pET28a-DPE-XYLA的质粒示意图谱。

图3是本发明的大肠杆菌重组菌株诱导产酶后的蛋白表达SDS-PAGE图谱，M表示蛋白marker，1表示含有空白质粒pET-28a(+)-dual的重组菌株表达蛋白条带，2表示含有重组表达质粒28a-DPE-XYLA的重组菌株表达蛋白条带，3表示纯化后的DPE与XYLA蛋白条带。

图4是本发明的大肠杆菌重组菌株转化葡萄糖生成D-阿洛酮糖的平衡时间影响。

图5是本发明的大肠杆菌重组菌株在不同反应温度条件下生成D-阿洛酮糖的对比图。

图6是本发明的大肠杆菌重组菌株在不同反应pH条件下生成D-阿洛酮糖的对比图。

图7是本发明的大肠杆菌重组菌株在不同初始D-葡萄糖浓度条件下生成D-阿洛酮糖的曲线图。

图8是本发明的微藻干物质酶解图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实验材料、试剂和方法：

1、菌株及载体：

本发明从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CGMCC 1.1488中克隆得到一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE；从大肠杆菌(E.coli)MG1665中克隆得到一种木糖异构酶基因XYLA。大肠杆菌表达载体pET28a(+)购自于Novagen公司，大肠杆菌E.colitrans1-T1和E.coli BL21(DE3)购自于北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：

Taq DNA聚合酶酶、限制性内切酶(NotI和XhoI)、T4 DNA连接酶购自trans公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自Tiangen公司，其它均为分析纯或者国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

LB培养基：每升培养基含1wt％蛋白胨、0.5wt％酵母提取物、1wt％NaCl，pH 7.0，溶剂为水。配制：将培养基各成分混合溶于水，搅拌溶解，调节pH至7.0，于121℃灭菌150min。LB固体培养基为液体培养基加入2wt％的琼脂粉。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

本发明实施例中的D-阿洛酮糖生物转化的大肠杆菌重组菌株的构建方法与应用示意图见图1所示。

实施例1根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CGMCC 1.1488、大肠杆菌(E.coli)MG1665基因组的提取

1、菌株培养

(1)原始菌株的培养：将根癌土杆菌CGMCC 1.1488、大肠杆菌MG1665二种原始菌株的-80℃甘油菌保存菌种室温溶解后，分别划线接种至LB固体平板，37℃培养至长出单菌落。挑取单菌落于5mL相应的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养，得到根癌土杆菌CGMCC 1.1488或大肠杆菌MG1665的细菌培养液。

(2)重组菌株的培养：大肠杆菌重组菌株培养时，在相应的LB液体培养基和LB固体培养基上添加卡那霉素至终浓度为50μg/mL。

2、基因组DNA提取

(1)取细菌培养液1.8mL至2mL的EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清液，用重悬液GA将菌体重悬，得到重悬菌液；

(2)向EP管中加入200μL重悬菌液，涡旋振荡至菌体完全悬浮，然后加入4μL核酸内切酶A溶液(100mg/mL)，振荡15s，室温放置5min，向管中加入20μL蛋白酶K溶液(10mg/mL)，均匀混合；

(3)加入220μL缓冲液GB，颠倒混匀后置金属浴中70℃、10min，原混浊液变澄清，短暂离心去除管壁上的液滴；

(4)向EP管中加入220μL无水乙醇，涡旋振荡30s，溶液中可能出现白色絮状沉淀；

(5)将EP管中的溶液(包括絮状沉淀)转移至一个干净的滤柱(spin column)中，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；

(6)向滤柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；

(7)向滤柱中加入700μL Washing Buffer，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；

(8)向滤柱中加入500μl Washing Buffer，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；

(9)将滤柱12000rpm离心2min，弃去收集管，将滤柱转移至干净的1.5mL EP管中，常温下静置2～3min；

(10)待吸附膜上残余的Washing Buffer完全挥发，滴加50μL 60℃预热的TE缓冲液至吸附膜中央，常温下静置3min后，12000rpm离心2min，用移液枪将EP管中的液体吸回至吸附膜中央，重复离心后，弃去滤柱，于-20℃保存基因组DNA备用。

实施例2根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CGMCC 1.1488D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的编码基因、大肠杆菌(E.coli)MG1665中木糖异构酶XYLA编码基因的克隆

根据根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CGMCC 1.1488D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的编码基因在NCBI数据库中的信息，设计引物DPE-F和DPE-R，以根癌农杆菌基因组DNA(按实施例1的方法提取获得)为模板扩增DPE序列。

DPE-F:5'-GGGGATCCGATGAAACACGGCATCTATTATTCTTACTGG-3'(BamHI)

DPE-R:5'-GGAAGCTTTCAGCCACCAAGAACGAAGCG-3'(HindIII)

PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30个循环，72℃保温10min。得到一个约870bp片段，将该片段回收后与pEASY-blunt zero载体相连，生成克隆载体pEASY-DPE，送华大基因测序。通过BLAST比对，结果确认获得的片段为D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的编码基因。

根据大肠杆菌(E.coli)MG1665中木糖异构酶XYLA编码基因在NCBI数据库中的信息，设计引物xylA-F和xylA-R，以大肠杆菌基因组DNA(按实施例1的方法提取获得)为模板扩增XYLA序列。

xylA-F:5'-GGGGTACCATGCAAGCCTATTTTGACCAGC-3'(KpnI)

xylA-R:5'-CGACTAGTTTATTTGTCGAACAGATAATGG-3'(SpeI)

PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环，72℃保温10min。得到一个约1350bp片段，将该片段回收后与pEASY-blunt zero载体相连，生成克隆载体pEASY-XYLA，送华大基因测序。通过BLAST比对，结果确认获得的片段为木糖异构酶XYLA的编码基因。

实施例3重组质粒pET28a-DPE-XYLA的构建及重组菌株的转化

合成一段序列(如SEQ ID NO.5所示)，包含T7启动子，核酸结合位点，限制性内切酶多克隆位点，两端分别含有NotI和XhoI酶切位点，用上述双酶切体系分别对上述序列与原始质粒pET28a(+)进行酶切处理，酶切产物回收后，用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞，转化得到的阳性克隆子转入LB液体培养基培养过夜，提取得到串联表达空白质粒pET-28a(+)-dual。

用BamHI和HindIII对含D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的克隆载体pEASY-DPE进行酶切，并与同样酶切后的表达载体pET28a(+)-dual用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞，转化得到的阳性克隆子转入LB液体培养基培养过夜，提取得到重组表达质粒pET28a-DPE。

用KpnI和SpeI对含木糖异构酶XYLA的克隆载体pEASY-XYLA进行酶切，并与同样酶切后的载体pET28a-DPE用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli Trans1-T1感受态细胞，转化得到的阳性克隆子转入LB液体培养基培养过夜，提取得到重组表达质粒pET28a-DPE-XYLA(图2)。

将重组表达质粒pET28a-DPE-XYLA转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在卡那抗性培养基上筛选阳性克隆子，获得含有重组质粒的BL21(DE3)菌株(大肠杆菌重组菌株)。将大肠杆菌重组菌株按2％v/v接种于100mL LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养3h，OD₆₀₀达到约0.6-1后，加入终浓度0.6mM IPTG，于30℃、200rpm诱导培养12h，获得含D-阿洛酮糖3-差向异构酶与木糖异构酶的大肠杆菌重组菌株诱导培养液。以导入串联表达空白质粒pET-28a(+)-dual的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)培养液作为对照。

采用SDS-PAGE电泳测定含有空白质粒pET-28a(+)-dual的重组菌株和含有重组表达质粒pET28a-DPE-XYLA的重组菌株表达的蛋白质分子量，结果见如图3。图3显示含有重组表达质粒pET28a-DPE-XYLA的重组菌株能同时表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶与木糖异构酶。

实施例4大肠杆菌重组菌株的转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的产物分析

将上述实施例3所得含D-阿洛酮糖3-差向异构酶与木糖异构酶的大肠杆菌重组菌株诱导培养液进行离心，收集细胞，将菌体重悬于含有10g/L葡萄糖的pH7.0的磷酸缓冲液中，得到反应液，该反应液中含有1mM的CoCl₂和1mM的MgCl₂。反应体系置于37℃水浴锅进行异构化反应一定时间(24h)，离心取上清，用HPLC进行产物分析。

HPLC检测方法：反应液12000rpm离心10min去除蛋白以及不溶性杂质，上清用0.22μm滤器过滤后进样。产物测定采用Waters 2695液相色谱仪，柱子为Sugar-PakI糖柱，检测器为2414示差检测器，柱温90℃，流动相为纯水，流速为0.4mL/min。

结果显示，大肠杆菌重组菌株经诱导产酶12小时后，转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的产量达到了12％。

实施例5不同反应条件下大肠杆菌重组菌株转化D-阿洛酮糖的分析

实验方法与实施例4基本相同，只改变反应时间来检测不同时间条件下大肠杆菌重组菌株转化合成D-阿洛酮糖的影响，结果见图4。图4显示，大肠杆菌重组菌株转化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的反应时间最长为48h。

实验方法与实施例4基本相同，只改变反应温度来检测不同温度条件下大肠杆菌重组菌株转化合成D-阿洛酮糖的影响，温度变化为30℃至60℃，结果见图5。图5显示，大肠杆菌重组菌株转化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的最佳反应温度是50℃。

实验方法与实施例4基本相同，只改变pH来检测不同酸碱性条件下大肠杆菌重组菌株转化合成D-阿洛酮糖的影响，pH变化为6.0-10.0，结果见图6。图6显示，大肠杆菌重组菌株转化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的最佳反应pH是7.5。

实施方法与实施例4基本相同，只改变初始D-葡萄糖浓度来检测大肠杆菌重组菌株转化合成D-阿洛酮糖的影响，结果见图7。图7显示，大肠杆菌重组菌株转化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的最大初始D-葡萄糖浓度变化为400g/L。

实施例6微藻干物质酶解生成糖混合物的分析

取10g微藻干物质以固液比1g：20mL加入柠檬酸溶液中，调节pH至4.8，分别加入20mg，40mg，60mg纤维素酶(相当于纤维素酶的加入量分别为10PFU、20PFU或30PFU/g微藻干物质)，于50℃，150rpm条件下，在恒温摇床中震荡酶解48和72h，在10000rpm离心10min后取上清液，得到微藻酶解液，用HPLC测定微藻酶解液中葡萄糖的浓度，结果见图8。图8显示，在30PFU纤维素酶作用下，微藻酶解72h后得到的酶解液中含有葡萄糖约26.4g/L。

实施例7大肠杆菌重组菌株转化微藻干物质转化D-阿洛酮糖的分析

将上述实施例3所得含D-阿洛酮糖3-差向异构酶与木糖异构酶的大肠杆菌重组菌株诱导培养液进行离心，收集细胞，将菌体重悬于实施例6得到的含有26.4g/L葡萄糖的微藻酶解液，调节pH至7.5，得到反应液，该反应液中含有1mM的CoCl和1mM的MgCl。反应体系置于50℃水浴锅进行异构化反应一段时间(48h)，得到混合物，将混合物离心取上清，用HPLC进行产物分析。

结果显示，大肠杆菌重组菌株经诱导产酶12小时后，转化微藻酶解液生成D-阿洛酮糖的产物中含D-阿洛酮糖为5.8g/L。

实施例8色谱柱分离D-阿洛酮糖的分析

将实施例7中的混合物经钙型阳离子树脂处理，脱去金属离子并回收。用模拟移动床进行色谱分离，获得含有95％D-阿洛酮糖的水溶液，以及含果糖与葡萄糖的混合溶液，混合溶液再次进行异构化反应(步骤参考上述实施例7)转化成D-阿洛酮糖，反复5次后得到阿洛酮糖的转化率为10.5g/100g微藻。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院广州能源研究所

<120> 一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CGMCC 1.1488(Agrobacterium tumefaciens CGMCC 1.1488)

<400> 1

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Ala Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CGMCC 1.1488(Agrobacterium tumefaciens CGMCC 1.1488)

<400> 2

atgaaacacg gcatctatta ttcttactgg gaacatgagt ggagcgccaa gttcggtccc 60

tatatcgaga aggtcgccaa gctcggtttc gacatcatcg aagtcgccgc ccaccatatc 120

aacgaataca gcgacgccga actcgcgacc atcaggaaga gcgcgaagga taacggcatc 180

atcctcaccg ccggcatcgg tccgtcgaaa accaagaacc tgtcgtcgga agatgctgcg 240

gtgcgtgcgg ccggcaaggc gttctttgaa agaacccttt cgaacgtcgc caagctcgat 300

atccacacca tcggcggcgc attgcattcc tattggccaa tcgattattc gcagcccgtc 360

gacaaggcag gcgattatgc gcgcggcgtc gagggtatca acggcattgc cgatttcgcc 420

aatgatctcg gcatcaacct gtgcatcgaa gtcctcaacc gctttgaaaa ccacgtcctc 480

aacacggcgg cggaaggcgt cgcttttgtg aaggatgtcg gcaagaacaa tgtgaaagtc 540

atgctggata ccttccacat gaacatcgag gaagacagtt tcggtgacgc catccgcacg 600

gccggcccgc ttctggggca cttccatacc ggtgaaagca atcgccgcgt accgggcaag 660

ggcagaatgc cgtggcacga aatcggcctt gcgctgcgtg atatcaacta cgccggcgcg 720

gtaatcatgg agcctttcgt caagacaggc ggcaccatcg gctcggatat caaggtgtgg 780

cgcgacctga gcggtggcgc cgacatcgcg aaaatggatg aagatgcccg caatgcgctg 840

gcattctccc gcttcgttct tggtggctga 870

<210> 3

<211> 449

<212> PRT

<213> 大肠杆菌MG1665(E.coli MG1665)

<400> 3

Met Glu Gly Phe Ile Met Glu Phe Asn Met Gln Ala Tyr Phe Asp Gln

1 5 10 15

Leu Asp Arg Val Arg Tyr Glu Gly Ser Lys Ser Ser Asn Pro Leu Ala

20 25 30

Phe Arg His Tyr Asn Pro Asp Glu Leu Val Leu Gly Lys Arg Met Glu

35 40 45

Glu His Leu Arg Phe Ala Ala Cys Tyr Trp His Thr Phe Cys Trp Asn

50 55 60

Gly Ala Asp Met Phe Gly Val Gly Ala Phe Asn Arg Pro Trp Gln Gln

65 70 75 80

Pro Gly Glu Ala Leu Ala Leu Ala Lys Arg Lys Ala Asp Val Ala Phe

85 90 95

Glu Phe Phe His Lys Leu His Val Pro Phe Tyr Cys Phe His Asp Val

100 105 110

Asp Val Ser Pro Glu Gly Ala Ser Leu Lys Glu Tyr Ile Asn Asn Phe

115 120 125

Ala Gln Met Val Asp Val Leu Ala Gly Lys Gln Glu Glu Ser Gly Val

130 135 140

Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Cys Phe Thr Asn Pro Arg Tyr Gly

145 150 155 160

Ala Gly Ala Ala Thr Asn Pro Asp Pro Glu Val Phe Ser Trp Ala Ala

165 170 175

Thr Gln Val Val Thr Ala Met Glu Ala Thr His Lys Leu Gly Gly Glu

180 185 190

Asn Tyr Val Leu Trp Gly Gly Arg Glu Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn

195 200 205

Thr Asp Leu Arg Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gly Arg Phe Met Gln Met

210 215 220

Val Val Glu His Lys His Lys Ile Gly Phe Gln Gly Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Glu Pro Lys Pro Gln Glu Pro Thr Lys His Gln Tyr Asp Tyr Asp Ala

245 250 255

Ala Thr Val Tyr Gly Phe Leu Lys Gln Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ile

260 265 270

Lys Leu Asn Ile Glu Ala Asn His Ala Thr Leu Ala Gly His Ser Phe

275 280 285

His His Glu Ile Ala Thr Ala Ile Ala Leu Gly Leu Phe Gly Ser Val

290 295 300

Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala Gln Leu Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe

305 310 315 320

Pro Asn Ser Val Glu Glu Asn Ala Leu Val Met Tyr Glu Ile Leu Lys

325 330 335

Ala Gly Gly Phe Thr Thr Gly Gly Leu Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg

340 345 350

Arg Gln Ser Thr Asp Lys Tyr Asp Leu Phe Tyr Gly His Ile Gly Ala

355 360 365

Met Asp Thr Met Ala Leu Ala Leu Lys Ile Ala Ala Arg Met Ile Glu

370 375 380

Asp Gly Glu Leu Asp Lys Arg Ile Ala Gln Arg Tyr Ser Gly Trp Asn

385 390 395 400

Ser Glu Leu Gly Gln Gln Ile Leu Lys Gly Gln Met Ser Leu Ala Asp

405 410 415

Leu Ala Lys Tyr Ala Gln Glu His His Leu Ser Pro Val His Gln Ser

420 425 430

Gly Arg Gln Glu Gln Leu Glu Asn Leu Val Asn His Tyr Leu Phe Asp

435 440 445

Lys

<210> 4

<211> 1350

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1665(E.coli MG1665)

<400> 4

atggagggat tcatcatgga gttcaatatg caagcctatt ttgaccagct cgatcgcgtt 60

cgttatgaag gctcaaaatc ctcaaacccg ttagcattcc gtcactacaa tcccgacgaa 120

ctggtgttgg gtaagcgtat ggaagagcac ttgcgttttg ccgcctgcta ctggcacacc 180

ttctgctgga acggggcgga tatgtttggt gtgggggcgt ttaatcgtcc gtggcagcag 240

cctggtgagg cactggcgtt ggcgaagcgt aaagcagatg tcgcatttga gtttttccac 300

aagttacatg tgccatttta ttgcttccac gatgtggatg tttcccctga gggcgcgtcg 360

ttaaaagagt acatcaataa ttttgcgcaa atggttgatg tcctggcagg caagcaagaa 420

gagagcggcg tgaagctgct gtggggaacg gccaactgct ttacaaaccc tcgctacggc 480

gcgggtgcgg cgacgaaccc agatcctgaa gtcttcagct gggcggcaac gcaagttgtt 540

acagcgatgg aagcaaccca taaattgggc ggtgaaaact atgtcctgtg gggcggtcgt 600

gaaggttacg aaacgctgtt aaataccgac ttgcgtcagg agcgtgaaca actgggccgc 660

tttatgcaga tggtggttga gcataaacat aaaatcggtt tccagggcac gttgcttatc 720

gaaccgaaac cgcaagaacc gaccaaacat caatatgatt acgatgccgc gacggtctat 780

ggcttcctga aacagtttgg tctggaaaaa gagattaaac tgaacattga agctaaccac 840

gcgacgctgg caggtcactc tttccatcat gaaatagcca ccgccattgc gcttggcctg 900

ttcggttctg tcgacgccaa ccgtggcgat gcgcaactgg gctgggacac cgaccagttc 960

ccgaacagtg tggaagagaa tgcgctggtg atgtatgaaa ttctcaaagc aggcggtttc 1020

accaccggtg gtctgaactt cgatgccaaa gtacgtcgtc aaagtactga taaatatgat 1080

ctgttttacg gtcatatcgg cgcgatggat acgatggcac tggcgctgaa aattgcagcg 1140

cgcatgattg aagatggcga gctggataaa cgcatcgcgc agcgttattc cggctggaat 1200

agcgaattgg gccagcaaat cctgaaaggc caaatgtcac tggcagattt agccaaatat 1260

gctcaggaac atcatttgtc tccggtgcat cagagtggtc gccaggaaca actggaaaat 1320

ctggtaaacc attatctgtt cgacaaataa 1350

<210> 5

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggccgctt gtacacggcc gcataatcaa attaatacga ctcactatag gggaattgtg 60

agcggataac aattcccctc tagaaataat tttgtttaac tttaaggaag gagatatacc 120

atgggcccta ggggtaccct gcagactagt cttaagttaa ttaactcgag c 171

Claims

1.一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将微藻进行酶解处理，得到含有糖化产物的混合物；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的酶解处理具体为：将微藻和纤维素酶混合，纤维素酶的加入量为10-200PFU/g微藻干物质，在pH为4.0-6.0，温度为30-50℃的条件下反应48-72h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的异构化反应是在pH为6-10，温度为30-60℃的条件下反应24-72h；所述的异构化反应体系含有Co²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺金属离子中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE克隆于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CGMCC 1.1488，木糖异构酶基因XYLA克隆于大肠杆菌(E.coli)MG1665。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，木糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，木糖异构酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

7.根据权利要求1、4或6所述的制备方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA单独或者串联连接于大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上，在T7强启动子的作用下，实现D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA的过量表达。

8.一种重组表达载体，其特征在于，含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA；所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，木糖异构酶基因XYLA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求8所述的重组表达载体。

10.权利要求8所述的重组表达载体或权利要求9所述的重组菌株在生物转化制备D-阿洛酮糖中的应用。