KR101219685B1 - 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법 - Google Patents

고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101219685B1
KR101219685B1 KR1020110016538A KR20110016538A KR101219685B1 KR 101219685 B1 KR101219685 B1 KR 101219685B1 KR 1020110016538 A KR1020110016538 A KR 1020110016538A KR 20110016538 A KR20110016538 A KR 20110016538A KR 101219685 B1 KR101219685 B1 KR 101219685B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
alpha
endo
arabinose
arabinane
arabinofuranosidase
Prior art date
Application number
KR1020110016538A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120097148A (ko
Inventor
오덕근
김영수
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020110016538A priority Critical patent/KR101219685B1/ko
Publication of KR20120097148A publication Critical patent/KR20120097148A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101219685B1 publication Critical patent/KR101219685B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01099—Arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinosidase (3.2.1.99)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 DSM 8903(Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903) 균으로부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase) 와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 고정화 담체 듀오라이트 A568 (Duolite A568)에 고정화 시켜 생물반응기에서 슈가빗 아라비난과 반응시켜 엘-아라비노스를 고수율로 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 유래한 재조합 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 고정화 하여 생물반응기를 이용하여 친환경적으로 기능성 단당인 엘-아라비노스를 생산할 수 있다.

Description

고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법 {L-Arabinose production in a packed-bed bioreactor containing immobilized alpha-L-arabinofuranosidase and endo-1,5-alpha-L-arabinanase}
본 발명은 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 고정화 효소를 이용한 반섬유소 슈가빗 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 DSM 8903(Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903) 균으로부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase) 와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 듀오라이트 A-568(Duolite A-568) 고정화 담체에 고정화하여 디브렌치드 아라비난 또는 슈가빗 아라비난과 반응시켜 엘-아라비노스를 고수율로 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물에 관한 것이다.
엘-아라비노스(L-arabinose)는 비만, 당뇨병과 고지혈증 등의 성인병 예방에 효력이 있는 것으로 알려지면서 관심이 급증하고 있다. 엘-아라비노스는 소장에서 슈크레이즈(sucrase)의 활성을 저해하여 설탕이 분해되지 않고 배출되어 과잉 설탕섭취로부터 초래하는 비만, 당뇨병의 부작용을 예방할 수 있다. 또한 엘-아라비노스를 정기적으로 섭취하면 혈중 중성지방의 농도가 현격히 낮아지는 결과가 보고되면서 고지혈증 예방효과도 기대된다. 기존의 다이어트 식품소재는 팽만감을 주면서 칼로리가 낮은 화합물이거나 설탕대용으로 이용되는 저칼로리 감미료가 대부분이고 식욕을 감퇴시키는 약재화합물도 이용되고 있다. 당뇨병 환자용 식품은 총 섭취 칼로리를 제한한 식품이 이용되는데, 이 경우 일반적으로 기호도가 낮아 환자가 장기적인 섭취를 기피하고 혈당치 상승을 억제하는 주사제와 약제를 함께 사용해야 하는 문제점이 있다. 엘-아라비노스는 이와 같은 문제점을 해결할 수 있는 기능성 당 중의 하나로 여겨진다. 설탕은 소장의 슈크레이즈에 의해 포도당과 과당으로 분해되어 흡수되므로 설탕의 과다섭취는 혈당치의 상승과 혈중 인슐린의 농도를 상승시키며 비만을 초래하게 된다. 엘-아라비노스의 맛은 설탕에 가깝고 소량의 첨가로는 감지가 어렵다. 따라서 설탕이 주성분으로 이용되는 식품군에 엘-아라비노스를 소량 첨가하면 감미성은 변화시키지 않고 건강에 좋은 제품을 제공할 수 있다.
엘-아라비노스는 디-자일로스와 더불어 식물체 구성 다당류인 헤미셀룰로오스의 구성당으로 자연계에 방대한 양이 존재하는데 식물체 조직으로부터 헤미셀룰로오스를 추출 분리하여 산가수분해 또는 효소가수분해 방법으로 생산한다. (Korean J. Food Sci. Technol. Vol 35 no 5 pp 757-763 (2003))
현재 사용되는 아라비노스의 생산방법에는 화학적·생물학적 합성법 및 효소법이 있다. 화학적 합성법은 촉매를 이용한 화학반응이나 생물학적 전환 과정을 통해 기질을 가수분해화시켜 아라비노스를 얻는 방법이다. 그러나 이 방법은 수율 측면에서는 우수한 반면, 정제 과정이 매우 까다롭기 때문에 대량 생산시 많은 시간과 노력을 필요로 하며, 강산·강알카리를 사용하는 반응과정 및 고온·고압 조건의 화학공정을 필요로 하기 때문에 환경면과 비용면에서 부정적이다. 이들 방법은 경제성이나 생산 수율이 매우 낮고, 특정한 조건에서만 반응이 진행되는 비효율성을 비롯하여 산업폐기물의 유발 등 많은 문제점을 나타내어 아라비노스의 대량생산에는 적합하지 않은 것으로 여겨지고 있다.
하지만 생물학적 합성법 중에 효소법은 미생물로부터 아라비노스를 생산할 수 있는 효소를 분리하여 아라비노스를 생산하게 하는 방법으로, 상기 발효법, 합성법에 비해 친환경적이라는 장점이 있다. 또한 아라비난이나 아라비노자일란은 아라비노스가 효소적으로 분해가 쉬운 알파 결합으로 이루어져 있어 분해가 용이하다.
그러나 아라비노스 가수분해효소는 자연에 존재하는 미생물에서는 매우 소량만이 존재하기 때문에 효소 정제 비용이 많이 들어 경제성이 없다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 아라비노스 가수분해효소를 도입한 재조합 균주가 제조된 바 있으나, 이전에 비해 그다지 큰 수율을 얻지 못하고 있는 실정이다. 또한 아라비노스 가수분해효소를 생산하는 것으로 알려진 균주들은 대부분 저온성·중온성 미생물로, 50℃ 이상의 온도 범위에서는 효소의 안정성이 급격하게 감소되어 대량생산에 적합한 정도의 활성을 나타낼 수 없다. 18~40℃의 온도 범위에서 활성을 나타내는 저온성·중온성 미생물 유래의 효소에 비해, 내열성 아라비노스 가수분해효소는 50 ℃이상의 온도 범위에서 더 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 현재까지 고온에서 안정적으로 높은 수율의 아라비노스 전환률을 나타내는 균주는 소수에 불과하여 산업적으로 이용된 예가 많지 않으며, 더욱이 70℃ 이상에서 높은 열안정성을 나타내는 균주의 효소에 대해서는 연구가 거의 이루어지지 않았다.
일반적으로 효소를 이용한 유용물질 생산은 다양한 방면에서 많이 이용되고 있지만 효소의 재사용 및 반응기 운영에 있어서 여러 가지 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복 하고자 고정화 효소를 이용한 생산방법이 대안으로 제시되어 진다.
이에 본 발명자들은 이미 고온에서 안정적으로 아라비노스를 생산할 수 있는 균주와 함께, 그로부터 분리한 내열성 엔도 및 엔소 형의 아라비노스 가수분해효소의 각각의 특성 및 아라비노스 생산에 관한 연구를 진행하였으며, 본 발명에서는 해당 엔도와 엔소형의 두 효소를 고정화 담체에 고정화하여 슈가빗 아라비난에 반응하여 생물반응기에서 높은 수율 및 낮은 생산단가로 아라비노스를 생산하는 방법을 발명하였다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스(L-arabinose)를 고농도 고수율로 생산할 수 있는 고정화효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스(L-arabinose)를 고농도 고수율로 생물반응기에서 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 담체에 고정화하고,
b) 상기 고정화된 효소와 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난을 반응시키는 단계를 포함하는 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고정화 담체는 듀오라이트 A568 (Duolite A568)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 서열번호 1의 아미노산에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 상기 효소에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 서열번호 2의 아미노산에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 상기 효소에 포함된다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈는 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균주로부터 유래한 것이 바람직하나 연쇄반응(PCR) 또는 화학적 합성 등의 방법을 통하여 수득할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)의 혼합비(w/w)는 7:1~17:1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 생산 방법의 반응의 pH는 5.5-6.5, 반응온도는 75-85℃, 슈가빗 아라비난 농도는 10g/L-25g/L의 범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 슈가빗 아라비난 기질 희석 비율 (Dilution rate)은 0.3-1.2 h-1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)가 담체에 고정화된 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고정화 담체는 듀오라이트 A568 (Duolite A568)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 복합체를 포함하는 엘-아라비노스를 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에서 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈는 J. Appl. Microbiol. Vol 109 no 4 pp 1188-1197 (2010)에 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈는 Biotechnol Lett (2009) 31:1439-1443에 자세하게 기재되어 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 고정화하여 생물 반응기에서 반섬유소(hemicellulose) 유래 슈가빗 아라비난(arabinan)의 기질로서 엘-아라비노스(L-arabinose)의 생산방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자는 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 분리된 것이다. 먼저, 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자를 가진 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응을 행하여, 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 연쇄반응 증폭 단편은 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency) 제어를 용이하게 한다. 상기의 연쇄반응 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA 라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 효소 유전자를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).
상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써,알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에 프로모터, 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a(+)를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.
본 발명에 관한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 제조는 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.
알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상층액을 원심 회수하여, 균체 파쇄, 친화성크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.
본 발명에서는 고온에서 안정적으로 아라비노스를 생산할 수 있는 내열성 아라비노스 가수분해효소 엔도와 엔소형의 두 효소를 고정화 담체에 고정하 시켜 혼합하여 아라비노스를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시하고 생물반응기를 통해 아라비노스를 높은 수율로 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. 이러한 결과를 토대로 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 대량으로 제조하며, 슈가빗 아라비난에서 엘-아라비노스를 고농도, 고수율로 얻는 최적 반응 조건을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 엘-아라비노스 생산방법은 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus)균으로부터 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 (endo-1,5-α-L-arabinanase)를 고정화 시켜 혼합반응으로 기질로서 슈가빗 아라비난(sugarbeet arabinan/branched arabinan)을 사용하는 단계로 구성된다.
상기 두 종류의 고정화된 가수분해효소의 기질로서 슈가빗 아라비난을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 기질 농도는 5 g/L 내지 25 g/L 범위인 것이 바람직하며, 20 g/L 내외 범위인 것은 더욱 바람직하다.
또한 상기 두 종류의 고정화된 효소의 혼합반응은 pH 5.0 내지 pH 7.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 6 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.
또한 상기 두 종류의 고정화된 효소의 혼합반응은 온도 60℃ 내지 90℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 75℃ 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하나, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 두 효소 혼합반응에서 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈는 각각 10:1 범위의 비율(w/w)로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균으로부터 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자를 분리하여 제작한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 고정화 담체에 고정화시켜 혼합반응시켜 엘-아라비노스를 고농도 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균주로부터 유래한 재조합 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 고정화 하여 생물 반응기를 이용하여, 친환경적으로 기능성 당인 엘-아라비노스를 생산할 수 있으며, 상기 엘-아라비노스는 다양한 저열량 감미료 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 고정화된 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 혼합비율에 따른 슈가빗 아라비난 에서 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 고정화된 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 슈가빗 아라비난 에서의 pH 및 온도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 고정화된 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 슈가빗 아라비난 에서의 온도에 따른 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 고정화된 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 비율에서 슈가빗 아라비난 농도 에 따른 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 고정화된 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 생물반응기에서 희석 비율에 따른 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 사용한 생물 반응기와 최적조건에서 생물반응기를 이용한 슈가빗 아라비난에서 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명에 사용된 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) DSM 8903 (DSMZ, Brauschweig, Germany), E. coli ER2566 (New England Biolabs, Herfordshire, UK) 및 플라즈미드 pET-28a(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)를 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자, 숙주 세포 및 발현벡터로 각각 사용하였다. 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균주는 카디셀룰로시럽터 (Caldicellulosiruptor) 배지(DSM Media Formulation No. 640)에서 배양하였고, 100% N2 가스 하에서 혐기조건하에서 70℃에서 5일간 배양하였다. 효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 50㎍/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.5에 도달할 때, IPTG를 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 발현을 유도하기 위하여 최종농도로 0.1mmol/l 첨가한 후 그 배양액을 4시간 동안 37℃에서 200 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
상기 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균주로부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 유전자 클로닝은 이전 연구에 잘 설명되어져 있다. (Biotechn. Lett. Vol 31 no 9 pp 1439-1443 (2009), J. Appl. Microbiol. Vol 109 no 4 pp 1188-1197 (2010))
배양된 E. coli 세포를 모아서 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific Model 100, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 18 watts, 얼음에서 단백질 저해제로 0.1 mmol/L의 phenylmethylsulfonyl fluoride를 함유한 50mmol/L lysis 버퍼(pH 8.0) (50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl)에서 2분 동안 소니케이션하였다. 미파쇄 세포 및 세포 찌꺼기를 4℃, 13 000 xg에서 20 분간 원심분리하여 제거하고 얻어진 상등액을 조 추출물로 사용하였다. 그 조추출물을 변성 대장균 단백질을 제거하기 위해서 75℃에서 10분간 가열하고 그 상등액을 13 000xg에서 20 분간 원심분리 하였다. 그 상등액을 75℃에서 5분 동안 열처리하여 얻은 효소 용액을 lysis buffer (pH 8.0)로 평형화된 His-Trap Q HP 컬럼(Amersham Biosciences, Uppsala,Sweden) 상에 적용하였다. 그 컬럼을 50mmol/L lysis buffer (pH 8.0)으로 lysis buffer와 250mmol/L imidazole의 선형구배로 용출하였다. 용출된 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 가지는 분획을 수집하고 4℃에서 16시간 동안 투석한 후 정제 효소로 사용하였다. 컬럼을 사용한 정제단계는 fast protein liquid chromatography(FPLC) system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해서 4℃ 저온실에서 수행하였다.
정제된 효소는 듀요라이트 A568 고정화 담체 1g에 정제된 효소 20mg을 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 흡착 시킨 후 50mmol/L citrate/phosphate buffer (pH 6.0)로 3번 세척한 후 고정화 효소로 사용하였다.
실시예 1: 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 고정화 담체 선정
정제된 효소를 듀오라이트 A568, 듀요라이트 S761, 듀오라이트 A7, IRA-120S, IRA-400, Chitopearl, Nano-particle, Glutaraldehyde 고정화 담체 각 1g에 정제된 효소를 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 흡착 후 50mmol/L citrate/phosphate buffer (pH 6.0)로 3번 세척한 후 1g/L 슈가빗 아라비난에 반응하여 전환율을 확인한 결과 표 1에서와 같이 듀오라이트 A568에서 가장 높은 전환율을 나타내었다.
서포트 전환율 (%)
Free enzymes 80.0
Duolite A568 79.6
Duolite S761 36.4
Duolite A7 35.4
IRA-120S 43.0
IRA-400 0
Chitopearl 28.0
Nano-particle 40.0
Glutaraldehyde 0
표 1은 여러 종류의 고정화 담체에서 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스 전환율을 나타낸 표이다.
실시예 2: 아라비노스의 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 최적 혼합 비율 조사
본 발명에 따른 엘-아라비노스 생산에서 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 혼합비율을 조사하기 위하여 1g/L 슈가빗 아라비난에 대해서 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 비율별(w/w)로 혼합하여 pH 6.0 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(75℃)에서 2시간 동안 반응을 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 비율은 10:1이었다.
실시예 3:고정화 효소 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비 난에이즈의 pH 가 엘- 아라비노스 생산 활성에 미치는 영향
상기 두 고정화 효소의 최적 혼합비율에서 엘-아라비노스 생산에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 1g/L 슈가빗 아라비난에 대하여 50mmol/L 씨트레이트/포스페이트 (citrate/phosphate buffer) 완충용액에서 pH 5.0에서부터 7.0 범위까지 효소 반응을 실시하였다. 그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 pH 6.0인 것을 알 수 있었다.
실시예 4: 고정화 효소 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라 비난에이즈의 온도가 엘- 아라비노스 생산 활성에 미치는 영향
상기 두 고정화 효소의 최적 혼합비율에서 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 1g/L 슈가빗 아라비난에 대하여 50mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액(citrate/phosphate buffer) pH 6.0에서 70-90℃ 까지 온도에서 각각 10분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 80℃인 것을 알 수 있었다.
최적 혼합비율의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 슈가빗 아라비난로부터 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 70℃에서 80℃까지의 범위에서 기질로서 1g/L 슈가빗 아라비난에 대하여 pH 6.0에서 50mM 씨트레이트/포스페이트(citrate/phosphate buffer) 완충용액에서 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다.
도 3은 본 발명의 본 발명의 최적 혼합비율의 고정화 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 슈가빗 아라비난로부터 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 안정성 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 3의 그래프에서 온도 표기는 70℃(○), 75℃(▼), 80℃(△)로 각각 나타내었다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 온도 70℃는 532시간, 75℃는 240시간, 80℃에서는 31시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 효소의 온도 안정성에 기초하여 생물반응기의 운영은 75℃에서 진행하였다.
실시예 5. 아라비노스의 생산을 위한 기질 농도의 최적화
아라비노스의 생산에 대한 기질 농도의 영향을 조사하기 위하여 5g/L 내지 25g/L의 슈가빗 아라비난 기질에 대하여 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 가수분해효소의 농도를 증가시키면서 2시간 반응 한 결과 슈가빗 아라비난의 농도가 20g/L 이상에서는 엘-아라비노스의 생산이 크게 증가하지 않아 최적농도를 20g/L로 하였다.
도 4는 기질인 슈가빗 아라비난 농도에 따른 엘-아라비노스의 생산을 살펴 본 것이다.
실시예 6. 아라비노스의 생산을 위한 생물반응기 희석 비율 결정
생물 반응기에서 엘-아라비노스를 생산하기 위해 생물반응기 (XK16, Amersham Pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)에 상기 두 고정화 효소 40ml을 충진하여 20g/L의 슈가빗 아라비난을 기질로 하여 희석 비율 (Dilution rate)을 0.075 부터 2.25 h-1로 변화시켜 75로 생물반응기를 운영하였다. 그 결과, 도 5에서와 같이 희석 비율이 0.6 h- 1 까지 16g/L의 엘-아라비노스 생산을 보였고 그보다 높은 희석 비율에서는 엘-아라비노스 생산이 감소함을 확인하였다. 희석 비율이 0.6 h-1 보다 낮을 때는 엘-아라비노스 생산은 16 g/L이었지만 생산성 (productivity)이 낮기 때문에 0.6h- 1 를 최적의 희석 비율로 정하였다.
도 5에서 엘-아라비노스 생산은 (●)로 나타내었으며 엘-아라비노스 생성성은 (○)로 나타 내었다.
실시예 7. 최적 조건에서 고정화 효소 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈를 이용한 생물반응기에서 슈가빗 아라비난 엘- 아라비 노스의 생산
고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 이용한 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 최적조건에서 생물반응기를 도 6a와 같이 운영하였다.
생물반응기에 고정화 효소 40 ml을 충진한 후 20 g/l 슈가빗 아라비난으로부터 pH 6.0과 75, 희석 비율 0.6 h- 1 에서 엘-아라비노스의 시간별 생산량을 측정하였다.
도 6b는 최적조건에서 상기 두 고정화 효소를 사용하여 기질로서 20g/L의 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 그래프로, 20g/L의 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 17g/L를 216시간 동안 생산하여 10.2g L-1 h- 1생산성과 85% 전환수율을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. a)서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 듀오라이트 A568 (Duolite A568) 담체에 고정화하고,
    b) 상기 고정화된 효소와 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난을 반응시키는 단계를 포함하는 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)의 혼합비(w/w)는 7:1~17:1인 것을 특징으로 하는 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)의 혼합비(w/w)는 10:1인 것을 특징으로 하는 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 생산 방법 반응의 pH는 6, 반응온도는 80℃, 슈가빗 아라비난 농도는 10g/L-25g/L의 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 슈가빗 아라비난 기질 희석 비율 (Dilution rate)은 0.3-1.2 h-1인 것을 특징으로 하는 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 슈가빗 아라비난 기질 희석 비율 (Dilution rate)은 0.6 h-1인 것을 특징으로 하는 슈가빗 아라비난 또는 디브렌치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 생산하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
KR1020110016538A 2011-02-24 2011-02-24 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법 KR101219685B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110016538A KR101219685B1 (ko) 2011-02-24 2011-02-24 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110016538A KR101219685B1 (ko) 2011-02-24 2011-02-24 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120097148A KR20120097148A (ko) 2012-09-03
KR101219685B1 true KR101219685B1 (ko) 2013-01-09

Family

ID=47108550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110016538A KR101219685B1 (ko) 2011-02-24 2011-02-24 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101219685B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333933A (zh) * 2013-05-24 2013-10-02 桐乡晟泰生物科技有限公司 L-阿拉伯糖的生产工艺

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioresource Technology, 2011, Vol.102, pp.4277-4280(2010.12.22. 온라인개재) *
Bioresource Technology, 2011, Vol.102, pp.4277-4280(2010.12.22. 온라인개재)*
GenBank Accession No.YP_001180343(2010.5.28.) *
GenBank Accession No.YP_001180343(2010.5.28.)*
GenBank Accession No.YP_001180344(2010.5.28.) *
GenBank Accession No.YP_001180344(2010.5.28.)*
Process Biochemistry, 1998. Vol.33, No.1, pp.57-65 *
Process Biochemistry, 1998. Vol.33, No.1, pp.57-65*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120097148A (ko) 2012-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111712570B (zh) 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
ES2424240T3 (es) Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono
WO2022095591A1 (zh) 复合酶及其在制备麦角硫因中的应用
JP2012507992A (ja) １，２−プロパンジオールの発酵製造のための基質としてのスクロースの使用
CN108588149B (zh) 一种阿果糖浆及其制备方法
JP6961713B2 (ja) タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法
CN108949852B (zh) 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法
KR20100061460A (ko) 에탄올 생산을 위한 호열성 미생물
CN112852796A (zh) 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在制备乳果糖中的应用
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
JP3557288B2 (ja) 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素
CN111394410B (zh) 一种高催化活性神经氨酸合酶及应用
CN111455003A (zh) 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法
KR101219685B1 (ko) 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법
JP3650632B2 (ja) マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素
CN114921392B (zh) 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法
CN116769808A (zh) 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用
CN107995929B (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶1
JP6026494B2 (ja) １，２−プロパンジオールの発酵製造のための基質としてのスクロースの使用
CN112575022A (zh) 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法
CN113957065B (zh) 一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用
CN116064456B (zh) 一种低聚糖脱支酶突变体及其在葡萄糖母液中的应用
KR101237857B1 (ko) 신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법
CN114134136B (zh) 一种高反应浓度下的异麦芽酮糖快速制备方法及其蔗糖异构酶
WO2023169200A1 (zh) 重组酵母菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151228

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161228

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee