CN108949852B - 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法，包括以下步骤：(1)含木糖还原酶基因XR和葡萄糖脱氢酶基因GDH的重组大肠杆菌在LB培养基中培养至OD为0.6‑0.8时，添加IPTG诱导木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达，离心得到全细胞；(2)含木糖和葡萄糖的水溶液、步骤(1)得到的全细胞和CaCO3形成生物催化体系，催化木糖发生还原反应生成木糖醇。本发明的方法可有效应用于秸秆的综合利用，将该反应体系应用于处理秸秆水解液，可在20h内将水解液的底物完全消耗。本方法省去了细胞中酶的提取和外源辅因子的添加，能够大大简化生物催化法生产木糖醇的工艺和成本。
Description
技术领域
本发明涉及木糖醇的制备方法，具体涉及一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法。
背景技术
木糖醇在化工、食品、医药等工业中应用广泛。例如，在药学领域，作为药剂的辅料的木糖醇类表面活性剂；在医学领域，作为优质的输液载体，并能与抗菌药、心脑血管用药、消化系统用药、抗肿瘤药等一起制成输液，还可用于肠道外营养用药、糖尿病的治疗、肝病治疗等。木糖醇是一种在水果及蔬菜中广泛存在的五碳糖醇，但含量极低，直接从其中提取不经济。2012年，木糖醇的市场规模达5.4亿美元左右，按2.4万元/吨计算，市场需求15万吨。我国年产量不足3万吨，对于木糖醇仍有很高的需求量。
化学催化加氢法是目前工业生产木糖醇的主要方法，但工艺要求以纯木糖为底物并且需要高温高压、昂贵的催化剂。目前，生物法具体包括微生物发酵和生物催化法。微生物发酵法主要是利用生长过程中的细菌、真菌等微生物细胞的代谢活动生产木糖醇，发酵最常用到的菌株是酿酒酵母和假丝酵母菌株(图1)。微生物发酵的好处是无需以纯木糖为底物，细胞作为生物催化剂其培养成本较低且反应条件温和。但是，发酵过程存在细胞优先摄取葡萄糖而非木糖的问题，同时由于细胞代谢途径的复杂性及细胞维持自身生命活动的需求，大量的底物会被用于产生杂醇和其他不可收益的代谢产物。此外，发酵过程往往还存在细胞代谢产生的辅因子NADH与木糖醇合成所需辅因NADPH不匹配的问题，因此发酵法导致木糖醇对总糖的得率较低。针对这些方面的不足，生物催化法体现出较为明显的优势。通常，生物催化法利用木糖还原酶(XR)以NADPH为辅因子还原木糖生成木糖醇，反应简单、高效，木糖对木糖醇的得率能够达到100％。生物催化需要利用葡萄糖脱氢酶(GDH)以葡萄糖为辅助底物构建偶联反应实现NADPH的再生。因此，生物催化能够同时利用葡萄糖和木糖联产木糖醇和葡萄糖酸，亦适合木质纤维素水解液等同时含有木糖和葡萄糖的廉价生物质的高值化转化，该方法可以使底物糖直接并最大限度转化为产物而不会被代谢消耗。然而，目前生物催化法均利用纯化的木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶，通过外源添加辅因子NAD(P)H的方式来制备木糖醇(Nidetzky B,Neuhauser W,Haltrich D,et al.Continuous enzymaticproduction of xylitol with simultaneous coenzyme regeneration in a chargedmembrane reactor[J].Biotechnology and bioengineering,1996,52(3):387-396；deFreitas Branco R,dos Santos J C,da Silva S S.A novel use for sugarcanebagasse hemicellulosic fraction:xylitol enzymatic production[J].Biomass andbioenergy,2011,35(7):3241-3246)。酶的制备或纯化以及昂贵的辅因子将会显著增加生产成本。为此，本研究发明了全细胞催化制备木糖醇的方法，省去了细胞中酶的提取和外源辅因子的添加，能够大大简化了生物催化法生产木糖醇的工艺和成本。
发明内容
发明目的：为了简化生物法制备木糖醇的工艺、降低生产成本，本发明提供了一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法。
技术方案：本发明所述一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法，包括以下步骤：
(1)构建重组大肠杆菌，其细胞内同时表达木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶；
(2)含木糖和葡萄糖的溶液、步骤(1)得到的重组大肠杆菌和pH稳定试剂形成生物催化体系，催化木糖发生还原反应生成木糖醇。
步骤(1)中，所述重组大肠杆菌，其胞内同时表达了：(a)一种能够催化木糖生成木糖醇的酶，此酶由SEQ ID NO:1所编码，或者在SEQ ID NO:1序列的基础上，经过一个或多个碱基的删除或替换或增加，与SEQ ID NO:1具有90％以上相似性的基因序列所编码；(b)一种能够催化葡萄糖生成葡萄糖酸的酶，此酶由与SEQ ID NO:2所编码，或者在SEQ ID NO:2序列的基础上，经过一个或多个碱基的删除或替换或增加，与SEQ ID NO:2具有90％以上相似性的基因序列所编码。
优选地，所述重组大肠杆菌的构建步骤如下：将木糖还原酶基因XR亚克隆到表达载体pETDuet-1的酶切位点Nco I和Sal I之间得到pETDuet-XR，葡萄糖脱氢酶基因GDH亚克隆到pETDuet-XR的酶切位点Bgl Ⅱ和Xho I之间，得到重组质粒pETDuet-XR-GDH；将重组质粒pETDuet-XR-GDH热激转化至E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。
步骤(1)中，含木糖还原酶基因XR和葡萄糖脱氢酶基因GDH的重组大肠杆菌在LB培养基中培养至OD为0.6-0.8时，添加IPTG诱导木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达，离心得到全细胞。诱导酶表达的条件如下：IPTG的终浓度为0.8-1.2mM，在20-30℃、150-250rpm下诱导表达8-16h。诱导表达后将细胞用50mM的Tris-HCl缓冲液洗涤2次，离心(4℃，8000rpm，10min)取沉淀用于全细胞催化。
优选地，编码木糖还原酶的基因XR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述编码葡萄糖脱氢酶的基因GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
步骤(2)中，优选所述含木糖和葡萄糖的溶液为秸秆水解液；所述木糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1-1.5M，所述葡萄糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1-1.5M。
所述重组大肠杆菌在生物催化体系中的初始浓度为0.05-0.3g/mL，此处的全细胞为离心后直接得到的湿细胞；所述pH稳定试剂为CaCO3，其在生物催化体系中的浓度为0.05-1g/mL；所述反应温度为23-27℃，反应时间为4-24h。
有益效果：(1)本发明首次利用共表达木糖还原酶(XR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)的大肠杆菌进行全细胞催化，通过胞内辅酶NADPH的循环再生有效催化木糖生产木糖醇，并联产葡萄糖生成葡萄糖酸；产物中木糖醇浓度为145.81g/L，得率为0.97(g/g)；葡萄糖酸浓度为184.85g/L，得率为1.03(g/g)；(2)本发明直接利用含有表达木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的细胞进行催化，省去了酶提取的过程，而且催化过程可循环使用细胞内存在的NADPH，省去了辅酶的添加，节省成本；与酶催化技术相比，存在于细胞内的酶由于细胞膜的保护，会比游离的酶更稳定，因此展现出很高的应用价值。(3)本发明的方法可有效应用于秸秆的综合利用，将该反应体系应用于处理秸秆水解液(葡萄糖：51.57g/L木糖：32.04g/L)，可在20h内将水解液的底物完全消耗。
附图说明
图1为酵母对木糖的代谢途径；
图2为本发明中木糖醇的生产及NADPH再生的代谢途径；
图3为重组质粒pETDuet-XR-GDH的图谱；
图4为重组质粒酶切的电泳图；
图5为重组大肠杆菌表达的木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的电泳图。
具体实施方式
实施例1重组大肠杆菌的构建
1、在NCBI数据库中查找到Candida tropicalis IFO 0618的木糖还原酶序列(GenBank:AB002105.2)和Bacillus cereus ATCC 14579的葡萄糖脱氢酶序列(GenBank:BC4715)，对应于大肠杆菌进行密码子优化，优化后的木糖还原酶基因XR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化后的葡萄糖脱氢酶基因GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。需要指出的是上述木糖还原酶基因XR和葡萄糖脱氢酶基因GDH还存在很多同源基因，包括直系同源基因和旁系同源基因。同源基因能够催化同一反应且在核苷酸序列上具有相似性(因此蛋白质序列上也具有相似性)。具体地，同源基因是指与所上述基因在序列上具有90％以上的相似性基因，更优地，同源基因相似性大于95％或者与上述基因序列完全一致，或者基因中的一个或几个碱基被删除、替换和增入。同源基因包括能够与目标基因中的一条链在严格条件下进行杂交的基因序列，可以通过BLAST和FASTA等同源基因检索工具从公共数据库中获取，也可以通过与目标基因具有部分相似性的探针或引物在严格条件下杂交或者进行聚合酶链式反应(PCR)的方法获得。此外，众所周知，根据密码子的简并性(即同一种氨基酸具有两个或更多个密码子)以及常规基因工程原理(比如在基因的某一端给所编码的蛋白质人工加上His-tag等标签)，此领域的技术人员可以很方便、可能地对上述基因进行一个或多个碱基的替换、删除或增添，从而在不严重影响所编码的蛋白质功能的前提下改变基因序列。
分别将基因XR和基因GDH亚克隆到质粒pETDuet-1的两个表达框中，XR亚克隆于酶切位点Nco I和Sal I之间，GDH亚克隆于酶切位点Bgl Ⅱ和Xho I之间，形成重组质粒pETDuet-XR-GDH，质粒交由金唯智公司合成。其中，pETDuet-1的Nco I、Sal I酶切反应体系见表1，pETDuet-XR的亚克隆体系及反应条件见表2和表3(使用一步克隆试剂盒，takaraR010A)，pETDuet-XR的Bgl Ⅱ、Xho I酶切反应体系见表4，pETDuet-XR-GDH的亚克隆体系及反应条件见表5和表6(使用一步克隆试剂盒，takara R010A)。
表1pETDuet的NcoI、SalI酶切反应体系
表2XR的PCR体系及反应条件
其中，XR-F5’-TAAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAGTACCACCCCTACCAT-3’
XR-R 5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACTTAAACAAAAATCGGAATGTTATCC-3’。
表3pETDuet-XR连接体系及反应条件
表4pETDuet-XR的Bgl Ⅱ、Xho I酶切反应体系
表5GDH的PCR体系及反应条件
其中，GDH-F 5’-AGATATACATATGGCAGATCTCATGTATAGCGATTTAGCCGGC-3’
GDH-R 5’-GTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAGCCACGACCAGCTTGAA-3’。
表6pETDuet-XR-GDH连接体系及反应条件
生成的重组质粒pETDuet-XR-GDH直接热激转化导入宿主细胞(E.coli DH5a)进行酶切(ApaI和XhoI)和测序验证，酶切结果见图4，1代表未酶切，2代表使用Apal酶和XhoI酶酶切，M代表marker；显示能酶切出4000bp和3000bp左右的条带，与预期结果相符，表明质粒导入成功。
2、将构建好的重组质粒pETDuet-XR-GDH通过热激转化导入E.coli BL21(DE3)(
Sangon Biotech Order NO.B528414)菌株中，具体步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中取出E.coli BL21(DE3)的感受态细胞，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上；
(2)加入重组质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μL)轻轻摇匀，冰上放置30min后，42℃水浴90s，热激后迅速置于冰上冷却5min；
(3)向管中加入1mL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达氨苄青霉素抗性基因；
(4)将上述菌液摇匀后取80μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，37℃培养12h，同时做两个对照：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其他操作与以上相同，正常情况下在含抗性的LB平板上应该不生长；以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
其中，LB液体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
含氨苄青霉素的筛选平板的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
3、重组大肠杆菌转接于5mL含抗性LB液体培养基，37℃，200rpm条件下培养10h，取2mL转接于200mL含抗性LB液体培养基，37℃，200rpm条件下培养2h至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度1mM IPTG，分别在20℃，25℃，30℃，2000rpm培养12h进行酶的诱导表达。
其中，含抗性LB液体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
4、将步骤3得到的菌体超声破碎，超声条件：200W，15min；然后离心(4℃，8000rpm，20min)取上清即为粗酶液。
5、粗酶液和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，电泳结果见图5，与预期结果相符，表明蛋白的诱导表达成功。其中，M代表marker，1代表pETDuet-1在20℃诱导培养上清液的电泳图；2代表pETDuet-1在20℃诱导培养沉淀的电泳图；3，5，7代表重组大肠杆菌BL21-XR-GDH在20℃、25℃、30℃诱导培养上清液的电泳图；4，6，8代表重组大肠杆菌BL21-XR-GDH在20℃、25℃、30℃诱导培养沉淀的电泳图。
6、取30℃条件下诱导的细胞用50mM的Tris-HCl缓冲液洗涤2次，离心取沉淀用于全细胞催化。
实施例2全细胞催化
按照如下体系添加进行全细胞催化反应：
表5全细胞催化体系
产物加热使酶失活，经水系滤膜过滤后液相检测产物成分，液相条件：①层析柱为Aminex HPX-87C，流动相为超纯水,流速0.6mL/min，柱温80℃。用折光检测仪RID检测。结果显示24h内木糖和葡萄糖已经完全转化。②层析柱为Aminex HPX-87H，流动相为5mM H2SO4，流速0.4mL/min,柱温45℃，用折光检测仪RID检测木糖醇含量。产物中木糖醇的得率约为0.97(g/g)，浓度可达145.81g/L，葡萄糖酸的得率约为1.03(g/g)，浓度可达184.85g/L。
实施例3全细胞催化在秸秆水解液的利用
将玉米秸秆粉碎(来源于江苏淮安)然后干燥，在反应釜中进行处理：10g干重玉米秸秆加入60vt.％乙醇水溶液，还有4wt.％的NaOH水溶液作为催化剂，反应控制在110℃，90min。反应结束后，固体用25mL纯水清洗两次，105℃干燥至质量恒定，用粉碎机粉碎。1kg预处理后玉米秸秆加入到20L水解釜中，加入去离子水至10L，用硫酸调pH为4.8后按15FPU/g添加量加入纤维素酶(来源于河南南阳天冠集团，其滤纸酶活力为245FPU/mL)，50℃，150rpm，恒温水解24h，得到的秸秆水解液葡萄糖含量为：51.57g/L，木糖含量为32.04g/L，pH约为4.6；用NaOH调节pH为7用于全细胞催化反应。
表6秸秆水解液催化体系
产物的检测方法同上述液相方法，20h内水解液的底物完全消耗，产物中木糖醇浓度为30.88g/L，葡萄糖酸浓度为50.89g/L。
实施例4全细胞催化在秸秆水解液的利用
方法同实施例3，不同的是全细胞催化体系如下：
表7秸秆水解液催化体系
产物的检测方法同上述液相方法，4h内水解液的底物完全消耗，产物中木糖醇浓度为30.79g/L，葡萄糖酸浓度为50.82g/L。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtacca cccctaccat cccgaccatc aaactgaaca gcggctatga gatgccgctg 60
gtgggttttg gctgttggaa ggtgaccaat gcaaccgccg ccgaccagat ctacaacgca 120
atcaagaccg gctatcgttt atttgatggc gccgaggatt acggcaatga gaaagaagtg 180
ggcgagggta ttaaccgcgc aatcaaggaa ggtttagtga agcgcgagga gctgttcatt 240
accagcaaac tgtggaacaa ctttcatgat ccgaagaacg tggagaccgc actgaataaa 300
actttaagcg atctgaattt agactatgtg gatttatttt taattcattt tccgattgcc 360
tttaaatttg tgccgattga ggaaaagtac ccgccgggct tttattgcgg cgatggcgac 420
aacttccatt acgaagatgt gccgctgctg gatacttgga aagcactgga gaagctggtg 480
gaagctggta agatcaaaag catcggcatc agcaacttta ccggcgcttt aatttacgat 540
ctgatccgcg gcgccaccat caaaccggca gtgctgcaga ttgagcatca cccgtactta 600
cagcagccga aactgatcga gtacgtgcag aaggccggta ttgcaatcac cggttacagc 660
agctttggcc cgcagagctt tctggagctg gaaagcaaac gcgcactgaa caccccgact 720
ttattcgagc atgaaacaat taaactgatt gccgataaac atggcaaaag cccggcacaa 780
gttctgctgc gttgggccac acagcgcaat atcgccgtta tcccgaaaag caacaatccg 840
gaacgtttag cccagaatct gagcgttgtg gactttgatt taaccaagga cgatttagac 900
aatatcgcca agctggacat tggtctgcgc ttcaatgacc cgtgggactg ggataacatt 960
ccgatttttg tt 972
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtatagcg atttagccgg caaagtggtg gttattactg gtagcgcaac cggcttaggc 60
cgtgcaatgg gcgtgcgctt cgccaaagaa aaagccaaag tggtgatcaa ctatcgcagc 120
cgtgaaagtg aggccaatga cgtgctggag gagatcaaaa aggtgggcgg tgaagccatt 180
gcagtgaaag gcgatgtgac cgttgaaagc gacgtggtga atctgatcca gagtgccgtg 240
aaggagttcg gcactttaga tgtgatgatc aacaacgccg gcatcgagaa tgccgtgccg 300
agtcatgaaa tgccgctgga agactggaat cgcgtgatca acaccaattt aaccggtgca 360
tttctgggca gccgcgaagc catcaaatat tttgtggaac atgatattaa aggcagcgtt 420
attaacatga gcagcgtgca tgaaaaaatt ccgtggccgc tgttcgtgca ttatgccgcc 480
agcaaaggcg gcatcaaact gatgaccgag actttagctt tagagtatgc cccgaaaggc 540
atccgcgtga ataacattgg tccgggcgcc atcaacaccc cgatcaacgc cgagaagttc 600
gcagatccga aaaaacgcgc cgatgtggag agcatgatcc cgatgggcta tatcggtaac 660
cccgaagaga tcgccgccgt tgcaacatgg ctggccagca gcgaagccag ctacgtgact 720
ggtattactt tattcgccga cggtggtatg actttatatc cgagctttca agctggtcgt 780
ggc 783
Claims (7)
1.一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建重组大肠杆菌，其细胞内同时表达木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶；
所述重组大肠杆菌的构建步骤如下：将木糖还原酶基因XR亚克隆到表达载体pETDuet-1的酶切位点NcoⅠ和SalⅠ之间得到pETDuet-XR，葡萄糖脱氢酶基因GDH亚克隆到pETDuet-XR的酶切位点BglⅡ和XhoⅠ之间，得到重组质粒pETDuet-XR-GDH；将重组质粒pETDuet-XR-GDH热激转化至E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌；
所述木糖还原酶由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的基因序列所编码；所述葡萄糖脱氢酶由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的基因序列所编码；
(2)含木糖和葡萄糖的溶液、步骤(1)得到的重组大肠杆菌和pH稳定试剂形成生物催化体系，催化木糖发生还原反应生成木糖醇；
步骤(2)中所述pH稳定试剂为CaCO3，所述pH稳定试剂在生物催化体系中的浓度为0.05-1g/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述重组大肠杆菌在LB培养基中培养至OD为0.6-0.8时，添加IPTG诱导木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达，离心得到全细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导酶表达的条件如下：IPTG的终浓度为0.8-1.2mM，在20-30℃、150-250rpm下诱导表达8-16h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述含木糖和葡萄糖的溶液为秸秆水解液。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述木糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1-1.5M，所述葡萄糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1-1.5M。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述重组大肠杆菌在生物催化体系中的初始浓度为0.05-0.3g/mL。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述催化反应温度为23-27℃，反应时间为4-24h。
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