CN113913317A - 一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法 - Google Patents

一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法，属于基因工程技术领域，本发明以酿酒酵母EBY100作为载体，包含表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒；所述重组质粒以pYD1作为原始质粒。本发明的重组酿酒酵母为表面展示系统，通过锚定蛋白Aga1与Aga2，将葡萄糖脱氢酶携带到重组酿酒酵母的细胞表面上，可不经纯化直接进行全细胞催化。基于构建的重组酿酒酵母表面展示的系统，本发明提出通过优化诱导表达的温度、pH和半乳糖浓度，提高表面展示葡萄糖脱氢酶的表达量以及提高酶催化效率(Kcat/Km)的方法。

Description

一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢 酶的酶活性的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法。
背景技术
表面展示技术是通过锚定蛋白的特性，将酶携带到细胞表面上，可不经纯化直接进行全细胞催化。在细胞内到细胞壁这个过程，酶也会发生一定的折叠形变，使得酶催化效率(Kcat/Km)提高了。通常使用的表面展示系统分为噬菌体表面展示系统、细菌表面展示系统和酵母表面展示系统。其中，酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制(GPI锚定)使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。它利用细胞表面展示技术使外源蛋白固定化于细胞表面，从而生产微生物细胞表面蛋白。
葡萄糖脱氢酶：是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，经常用于生物传感器，生物燃料电池等方向，可以特异性的将催化D-葡萄糖生成β-D-葡萄糖酸内脂。现有技术中报道了利用重组毕赤酵母表达葡萄糖脱氢酶的技术，但是该技术得到的葡萄糖脱氢酶为胞内表达产物，酶催化效率不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法，本发明利用表面展示技术，使得葡萄糖脱氢酶能够携带到重组酿酒酵母表面上，实现葡萄糖脱氢酶胞外表达，得到的葡萄糖脱氢酶催化效率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种表面展示葡萄糖脱氢酶的重组酿酒酵母，以酿酒酵母EBY100作为载体，包含表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒；所述重组质粒以pYD1作为原始质粒。
优选的，所述葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入在EcoR I和BamH I之间。
本发明提供了上述方案所述重组酿酒酵母在制备葡萄糖脱氢酶中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组酿酒酵母的诱导表达方法，包括以下步骤：
将所述重组酿酒酵母接种于诱导培养基，进行诱导表达，得到诱导表达产物，所述诱导表达产物中包含葡萄糖脱氢酶；
所述诱导表达的温度为25～30℃；
所述诱导培养基包括以下组分：0.01M PBS、质量浓度为2％～4％的半乳糖、质量浓度为0.5％～2％的无氨基酸氮源培养基和质量浓度为0.5％～2％的酸水解酪蛋白。
优选的，所述诱导表达的时间以诱导表达的产物的OD600达到9～10为准。
优选的，所述诱导表达于震荡条件下进行，所述震荡的转速为150～200rpm。
本发明提供了一种表面展示葡萄糖脱氢酶的重组酿酒酵母，以酿酒酵母EBY100作为载体，包含表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒；所述重组质粒以pYD1作为原始质粒。EBY100是亮氨酸和色氨酸双缺陷型菌株，而pYD1含有色氨酸序列，可以单独提供色氨酸，EBY100菌株与pYD1质粒配合使用，可以便于后续的筛选。本发明的重组酿酒酵母为表面展示系统，通过锚定蛋白Aga1与Aga2，将葡萄糖脱氢酶携带到重组酿酒酵母的细胞表面上，可不经纯化直接进行全细胞催化。基于构建的重组酿酒酵母表面展示的系统，本发明还提出通过优化诱导表达的温度、pH和半乳糖浓度，提高表面展示葡萄糖脱氢酶的表达量以及提高酶催化效率(Kcat/Km)的方法。
附图说明
图1为实施例1中构建葡萄糖脱氢酶表面展示系统的流程图；
图2表示生长曲线及半乳糖利用率；其中GDH为葡萄糖脱氢酶；
图3表示不同半乳糖浓度下酿酒酵母的生长曲线及半乳糖利用率；
图4表示酵母在不同pH下的生长曲线；
图5表示不同pH值对葡萄糖脱氢酶酶活的影响；
图6表示不同温度对葡萄糖脱氢酶酶活的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种表面展示葡萄糖脱氢酶的重组酿酒酵母，以酿酒酵母EBY100作为载体，包含表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒；所述重组质粒以pYD1作为原始质粒。其中Aga1位于酿酒酵母的基因组上，而Aga2位于pYD1质粒上，当加入半乳糖后，则会使得乳糖启动子GAL1开关打开，使得Aga2以及目的基因(葡萄糖脱氢酶)进行表达。而加入葡萄糖的时候，会使得半乳糖操纵子GAL1关闭，抑制目的基因(葡萄糖脱氢酶)的表达。因此半乳糖在培养基体系中，半乳糖是作为碳源以及诱导剂成分的。当Aga1和Aga2进行表达时，它们会通过二硫桥键连接，实现表面展示。其中，Aga1锚定蛋白位于细胞壁上，Aga2锚定蛋白位于细胞壁外。二硫桥键可以通过二硫苏糖醇打断，实现蛋白回收的目的。
在本发明中，所述葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：
1 atgtatacag atttaaaagataaagtagta gttgtaacag gcggatcaaa aggattgggt
61 cgcgcaatgg ccgttcgttttggtcaagag cagtcaaaag tggttgtaaa ctaccgcagc
121 aatgaagaag aagcgctaga agtaaaaaaa gaaattgaac aagctggcgg ccaagcaatt
181 attgttcgag gcgacgtaac aaaagaggaa gacgttgtga atcttgtaga gacagctgtt
241 aaagagtttg gcacattaga cgttatgatt aacaatgctg gtgttgaaaa cccggttcct
301 tcacatgaat tatcgttaga aaactggaat caagtaatcg atacaaactt aacaggcgcg
361 tttttaggaa gccgcgaagc gattaaatattttgttgaaa atgatattaa aggaaacgtt
421 attaacatgt ccagcgttca cgagatgatt ccttggccac tatttgttca ctatgcagca
481 agtaaaggcg gtatgaaact aatgacagaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt
541 atccgcgtaa ataacattgg accaggcgcg atcgatacgc caatcaacgc tgaaaaattc
601 gcagatccgg aacagcgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggcta catcggcaac
661 ccggaagaaattgcatcagt tgcagcattc ttagcatcgt cacaagcaag ctacgtaaca
721 ggtattacac tatttgctgatggcggtatg acaaaatatc cttctttcca agcgggaaga
781 ggttaa。
在本发明中，所述葡萄糖脱氢酶编码基因来源于来源于Bacillus megateriumAS1.223。
在本发明中，所述葡萄糖脱氢酶编码基因优选的插入在EcoR I和BamH I之间。在本发明中，酿酒酵母具有蛋白修饰的作用，大分子的蛋白更容易表达在表面。EBY100是亮氨酸和色氨酸双缺陷型菌株，而pYD1含有色氨酸序列，可以单独提供色氨酸，EBY100菌株与pYD1质粒配合使用，可以便于后续的筛选。
在本发明中，所述重组酿酒酵母的构建方法优选的包括以下步骤：将表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒转入酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。在本发明中，所述转入的方式优选为电转化。其中电转化反应体系为：100μL感受态细胞和2μg/mL质粒，在1500V条件下进行电转，时间为5毫秒。
本发明对所述表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明还提供了上述方案所述重组酿酒酵母在制备葡萄糖脱氢酶中的应用；所述制备葡萄糖脱氢酶的方法优选为重组酿酒酵母经诱导表达得到葡萄糖脱氢酶。
本发明还提供了上述方案所述重组酿酒酵母的诱导表达方法，包括以下步骤：
将所述重组酿酒酵母接种于诱导培养基，进行诱导表达，得到诱导表达产物，所述诱导表达产物中包含葡萄糖脱氢酶；
所述诱导表达的温度为25～30℃；
所述诱导培养基包括以下组分：0.01M PBS、质量浓度为2％～4％的半乳糖、质量浓度为0.5％～2％的无氨基酸氮源培养基和质量浓度为0.5％～2％的酸水解酪蛋白。
在本发明中，所述PBS的pH值优选为7.2～7.4。
在本发明中，设置诱导表达的温度为25～30℃具有半乳糖利用率高以及葡萄糖脱氢酶表达量高。
在本发明中，质量体积浓度为2％～4％的半乳糖利用效率高。
在本发明中，所述诱导表达的时间优选的以诱导表达的产物的OD600达到9～10为准。
在本发明中，所述诱导表达于震荡条件下进行，所述震荡的转速优选为150～200rpm，在这一条件下进行震荡培养溶氧量更大，更有利酿酒酵母生长。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
流程图参见图1。
1、利用酶切法获得葡萄糖脱氢酶目的基因，利用双酶切(EcoRI/BamHI)将葡萄糖脱氢酶的基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)添加到质粒(pYD1)上，其中双酶切的条件为37℃，2h，将质粒pYD1线性化以及获得目的基因，进行DNA核酸电泳，条件为120V，30min。进行利用胶回收试剂盒(Omega)进行胶回收，获得纯化后的PCR产物。然后使用T4连接酶在16℃下进行过夜连接后，PCR产物经热激法转入大肠杆菌(DH5α)，进行大量克隆，提取质粒后，电转化进酿酒酵母EBY100中，在筛选平板上生长后，挑单菌落再进行预培养。
2、诱导表达的过程：先挑单菌落进行预培养，然后取1％的样于250mL锥形瓶进行正式培养(培养体系30mL)，然后各取9mL作三平行，进行重悬，用无菌水进行洗涤，用诱导培养基进行重悬，转入诱导培养基中进行诱导表达。诱导培养基的基础配方是：0.01M PBS、质量浓度为2％的半乳糖、质量浓度为0.67％的无氨基酸氮源培养基和质量浓度0.5％的酸水解酪蛋白。诱导条件是25℃，200rpm。对构建好的菌株进行生长曲线以及糖利用率进行测定。测定结果参见图2。由图2可知，酵母在25℃，200rpm下培养时，48h OD600达最高，为10左右，半乳糖利用率为80％～90％。每次实验均为不同批次，因此半乳糖利用率会受收菌时间，摇床等因素的影响。
2、诱导表达优化
1)温度优化
培养基方案与实施案例1相同。基于实施案例1对培养温度进行改变。
表1：不同温度下的半乳糖利用率
Figure BDA0003314052500000061
由表1可知，较低温度时，半乳糖利用率较低，且测不出酶活，因此较低温度会抑制表达。
2)不同半乳糖浓度下酿酒酵母的生长曲线及半乳糖利用率
培养基方案与条件与实施案例1相同。基于实施案例1，改变诱导剂的浓度：第一个为质量浓度为1％的半乳糖，第二个为质量浓度为2％的半乳糖。第三个是质量浓度为2％对半乳糖(添加了0.1mM IPTG)，第四个为质量浓度为4％的半乳糖。诱导培养方法同上。
结果参见图3。由图3可知，2％半乳糖浓度消耗速度比1％和4％快，菌在4％半乳糖浓度中，在60h达到最高生物量，但从酶活测定上可知，IPTG和高浓度半乳糖浓度抑制酵母的诱导表达。
3)酵母在不同pH下的生长曲线
培养基方案与培养条件与实施案例1相同，基于实施案例1，添加不同的物质调节培养基的pH，因此该实验设计了三组，一组为基础培养基，第二组添加了质量浓度为2％碳酸钙的基础培养基，第三组添加了1×磷酸盐缓冲液的基础培养基。
结果参见图4。由图4可知，不同pH下对酿酒酵母的生长无太大影响，但是对糖利用率有一定的影响。其中在培养基中添加了磷酸盐缓冲液下的酿酒酵母，糖利用率最高，达98％。
3、酶活测定方法：利用酶标仪对步骤1中表达的葡萄糖脱氢酶进行了动力学参数测定，反应总体系220μL，光程为0.5cm，取10μL全细胞，底物D-葡萄糖20mM，NAD+1.0mM，0.2MpH7.0磷酸盐缓冲液，在波长340nm处测得NADH浓度的增加，一个单位的葡萄糖脱氢酶的酶活力定义为1min内生成1umol NADH所需的酶量。其测得结果与优化前相比，比酶活提高了52％以及Kcat/Km提高了19.4％。
表2：酶动力学参数的比较
Figure BDA0003314052500000071
*Enzyme：酶/Kcat:催化常数/Kcat/Km：酶催化效率。
4、对步骤1得到的表面展示葡萄糖脱氢酶进行了酶学性质的测定，测定结果参见图5和图6。由图5和图6可以看出，葡萄糖脱氢酶的最适pH和温度分别为7.0和35℃。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atgtatacag atttaaaaga taaagtagta gttgtaacag gcggatcaaa aggattgggt 60
cgcgcaatgg ccgttcgttt tggtcaagag cagtcaaaag tggttgtaaa ctaccgcagc 120
aatgaagaag aagcgctaga agtaaaaaaa gaaattgaac aagctggcgg ccaagcaatt 180
attgttcgag gcgacgtaac aaaagaggaa gacgttgtga atcttgtaga gacagctgtt 240
aaagagtttg gcacattaga cgttatgatt aacaatgctg gtgttgaaaa cccggttcct 300
tcacatgaat tatcgttaga aaactggaat caagtaatcg atacaaactt aacaggcgcg 360
tttttaggaa gccgcgaagc gattaaatat tttgttgaaa atgatattaa aggaaacgtt 420
attaacatgt ccagcgttca cgagatgatt ccttggccac tatttgttca ctatgcagca 480
agtaaaggcg gtatgaaact aatgacagaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540
atccgcgtaa ataacattgg accaggcgcg atcgatacgc caatcaacgc tgaaaaattc 600
gcagatccgg aacagcgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggcta catcggcaac 660
ccggaagaaa ttgcatcagt tgcagcattc ttagcatcgt cacaagcaag ctacgtaaca 720
ggtattacac tatttgctga tggcggtatg acaaaatatc cttctttcca agcgggaaga 780
ggttaa 786

Claims (7)

1.一种表面展示葡萄糖脱氢酶的重组酿酒酵母，以酿酒酵母EBY100作为载体，包含表达葡萄糖脱氢酶的重组质粒；所述重组质粒以pYD1作为原始质粒。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入在EcoR I和BamHI之间。
4.权利要求1～3中任意一项所述重组酿酒酵母在制备葡萄糖脱氢酶中的应用。
5.权利要求1～3中任意一项所述重组酿酒酵母的诱导表达方法，包括以下步骤：
将所述重组酿酒酵母接种于诱导培养基，进行诱导表达，得到诱导表达产物，所述诱导表达产物中包含葡萄糖脱氢酶；
所述诱导表达的温度为25～30℃；
所述诱导培养基包括以下组分：0.01M PBS、质量浓度为2％～4％的半乳糖、质量浓度为0.5％～2％的无氨基酸氮源培养基和质量浓度为0.5％～2％的酸水解酪蛋白。
6.根据权利要求5所述的诱导表达方法，其特征在于，所述诱导表达的时间以诱导表达的产物的OD600达到9～10为准。
7.根据权利要求5所述的诱导表达方法，其特征在于，所述诱导表达于震荡条件下进行，所述震荡的转速为150～200rpm。
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CN115786387A (zh) * 2022-09-19 2023-03-14 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用
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