CN113073089B - 一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法，涉及基因工程技术领域。本发明所述突变蛋白为利用FoldX和DeepDDG两款软件分析目标蛋白Nampt的结构，预测出的多个影响酶功能的关键位点，进行酶的半理性设计。在本发明实施例中，根据点突变原理，设计引物构建了10个突变菌株，有8个突变体的活性高于野生型菌株，其中Nampt‑V365L突变体的提高了62％，Nampt‑S248A、Nampt‑N164L、Nampt‑S382M、Nampt‑A245T和Nampt‑A208G的NMN产量分别提高了34％，27％，27％，22％和17％。

Description

一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide，NMN)是一种有机分子，也是一种核苷酸，具有逆转衰老和延长寿命的作用。
目前，多采用酶促反应来实现烟酰胺单核苷酸的合成，天然烟酰胺磷酸核糖转移酶(NiaciNamide phosphoribosyltransferase，Nampt)存在酶活性较低的问题，导致传统的酶促反应成本高昂、反应条件苛刻、生产工艺不稳定、每个批次产品指标相差大、反应产能低，难以实现工厂化大规模生产，限制了NMN的大规模应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法，具体在于提供一种编码Nampt的突变蛋白的重组表达载体及重组菌和Nampt突变蛋白，利用重组菌表达所述Nampt突变蛋白后，酶活显著提高，可实现工厂化大规模生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的突变蛋白，对烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的氨基酸序列进行点突变，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
所述点突变的位点包括：N67K，N164L，R166W，A208G，A245T，S248A，V365L或S382M。
本发明还提供了一种包括编码上述突变蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。
优选的，所述重组表达载体的基础载体包括pPSUMO载体。
本发明还提供了一种表达上述突变蛋白或包括上述重组表达载体的重组菌。
优选的，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。
本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：(1)对SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的编码基因进行密码子优化，得优化基因；
(2)以所述优化基因为模板，利用定点突变引物和高保真酶分别进行PCR扩增，得扩增产物；
(3)利用DpnI酶分别消化所述扩增产物后分别连接pPSUMO载体，得重组表达载体；
(4)将所述重组表达载体分别转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆子，得所述重组菌。
优选的，步骤(1)所述优化基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选的，步骤(2)所述定点突变引物包括：针对N67K点突变的定点突变引物N67K-F和N67K-R，所述N67K-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述N67K-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；
针对N164L点突变的定点突变引物N164L-F和N164L-R，所述N164L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述N164L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
针对R166W点突变的定点突变引物R166W-F和R166W-R，所述R166W-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述R166W-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
针对A208G点突变的定点突变引物A208G-F和A208G-R，所述A208G-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述A208G-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
针对A245T点突变的定点突变引物A245T-F和A245T-R，所述A245T-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述A245T-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
针对S248A点突变的定点突变引物S248A-F和S248A-R，所述S248A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述S248A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
针对V365L点突变的定点突变引物V365L-F和V365L-R，所述V365L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述V365L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
针对S382M点突变的定点突变引物S382M-F和S382M-R，所述S382MK-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述S382M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸4min，30循环；68℃延伸4min。
优选的，步骤(4)所述挑选阳性克隆子，包括利用Nampt-F和Nampt-R进行菌液PCR，所述Nampt-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述Nampt-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示。
本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的突变蛋白，所述突变蛋白为利用FoldX和DeepDDG两款软件分析目标蛋白Nampt的结构，预测出的多个影响酶功能的关键位点，进行酶的半理性设计。在本发明实施例中，根据点突变原理，设计引物构建的10个突变菌株，经测序验证显示在设定的位点均成功突变，故10个突变菌株成功克隆。克隆的10个突变体中，有8个突变体的活性高于野生型(E.coli DH5α-ppsumo-Nampt)菌株，其中Nampt-V365L突变体的活性最高，NMN的产量为45.42mg/L，相对于野生型(28.11mg/L)提高了62％。突变株Nampt-S248A，Nampt-N164L，Nampt-S382M，Nampt-A245T，Nampt-A208G的NMN产量相对于野生型提高了34％，27％，27％，22％和17％，而Nampt-V467L和S155I的NMN产量分别下降了53％和31％。
附图说明
图1为菌落PCR验证结果，其中M：15000DL marker；1：N67K，2：S155I；3：N164L；4：R166W；5：A208G；6：A245T；7：S248A；8：V365L；9：S382M；10：V467L；11：阴性对照；
图2为突变菌株测序结果比对图，图中N为Nampt原始序列，1-10为突变菌株，其中1：N67K，2：S155I；3：N164L；4：R166W；5：A208G；6：A245T；7：S248A；8：V365L；9：S382M；10：V467L；红色序列中的白色缺失部位为突变位点的位置；
图3为Nampt定点突变的菌株对转化反应生成NMN的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的突变蛋白，对烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的氨基酸序列进行点突变，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列：GNAAAEAEFNILLATDSYKVTHYKQYPPNTSKVYSYFECREKKTENSKVRKVKYEETVFYGLQYILNKYLKGKVVTKEKIQEAKEVYREHFQDDVFNERGWNYILEKYDGHLPIEVKAVPEGSVIPRGNVLFTVENTDPECYWLTNWIETILVQSWYPITVATNSREQKKILAKYLLETSGNLDGLEYKLHDFGYRGVSSQETAGIGASAHLVNFKGTDTVAGIALIKKYYGTKDPVPGYSVPAAEHSTITAWGKDHEKDAFEHIVTQFSSVPVSVVSDSYDIYNACEKIWGEDLRHLIVSRSTEAPLIIRPDSGNPLDTVLKVLDILGKKFPVTENSKGYKLLPPYLRVIQGDGVDINTLQEIVEGMKQKKWSIENVSFGSGGALLQKLTRDLLNCSFKCSYVVTNGLGVNVFKDPVADPNKRSKKGRLSLHRTPAGNFVTLEEGKGDLEEYGHDLLHTVFKNGKVTKSYSFDEVRKNAQLNIEQDVAPH；
所述点突变的位点包括：N67K，N164L，R166W，A208G，A245T，S248A，V365L或S382M。
本发明优选通过综合使用基于序列保守性分析和基于结构吉布斯自由能变分析的方法，利用FoldX和DeepDDG两款软件，预测高质量突变位点；其中FoldX软件使用生物信息学方法来模拟突变位点对蛋白质解折叠自由能(ΔG)的影响，如果突变体ΔG(mutant)小于野生型ΔG(wild)，则说明该突变对蛋白质的热稳定性具有积极作用。如果突变后ΔG增加，则表明该突变位点不利于蛋白质的稳定性。蛋白质工程中DeepDDG软件可以准确预测由于点突变引起的蛋白质稳定性变化情况。DeepDDG分析是一种基于神经网络的方法，该神经网络已在5700多个手动计划的实验数据点上进行了测试。对于三个独立的测试集，皮尔逊相关系数为0.48～0.56。软件分析结果表明，突变残基溶解性，接触面积是最重要的特征，这表明掩埋的疏水面积是蛋白质稳定性的主要决定因素。利用上述方法，本申请实施例中共选定了10个突变位点，分别为N67K，S155I，N164L，R166W，A208G，A245T，S248A，V365L，S382M和V467L，且上述10个突变位点的氨基酸和核苷酸序列变化如表1所示。
表1点突变的氨基酸和核苷酸序列变化
Figure BDA0003044565990000051
本发明还提供了一种包括编码上述突变蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。
本发明所述重组表达载体的基础载体优选包括pPSUMO载体，且编码所述突变蛋白的核苷酸序列优选连接入pPSUMO载体的HindIII和NdeI酶切位点之间。
本发明还提供了一种表达上述突变蛋白或包括上述重组表达载体的重组菌。
本发明所述重组菌的基础菌株优选包括大肠杆菌。
本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：(1)对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的编码基因进行密码子优化，得优化基因；
(2)以所述优化基因为模板，分别利用定点突变引物和高保真酶进行PCR扩增，得扩增产物；
(3)利用DpnI酶消化分别所述扩增产物后分别连接pPSUMO载体，得重组表达载体；
(4)将所述重组表达载体分别转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆子，得所述重组菌。
本发明对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的编码基因进行密码子优化，得优化基因。本发明优选遵循大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，所得优化基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列(1482bp)：CATATGAACGCTGCTGCTGAGGCCGAGTTCAATATATTGTTAGCGACCGACTCGTACAAGGTCACGCATTATAAACAGTATCCTCCTAACACATCAAAGGTCTACTCATATTTCGAGTGCCGCGAGAAGAAGACGGAGAACTCGAAAGTCCGAAAGGTGAAGTATGAAGAAACAGTGTTCTACGGGCTTCAGTATATTCTTAACAAATATCTTAAAGGCAAAGTTGTTACAAAGGAGAAGATCCAGGAAGCTAAAGAAGTTTATCGCGAACATTTCCAAGACGATGTCTTCAATGAGCGCGGCTGGAACTATATTCTTGAGAAGTACGACGGCCATCTTCCTATTGAAGTTAAAGCTGTTCCTGAAGGCTCAGTTATTCCTCGCGGCAACGTCCTGTTTACCGTCGAGAATACGGATCCTGAATGTTATTGGCTTACAAACTGGATTGAAACAATTCTTGTTCAGTCATGGTATCCTATTACAGTTGCTACAAACTCACGCGAACAGAAGAAGATCCTAGCTAAATATCTTCTTGAAACATCAGGCAACCTTGATGGCCTTGAATATAAACTTCATGATTTCGGGTACCGCGGCGTTTCATCACAGGAAACAGCTGGCATTGGCGCTTCAGCTCATCTTGTTAACTTTAAAGGCACAGATACAGTTGCTGGCATTGCTCTTATTAAGAAGTACTACGGCACAAAGGACCCAGTTCCTGGTTATTCAGTTCCTGCTGCTGAACATTCAACAATTACAGCTTGGGGAAAGGATCATGAGAAGGACGCGTTCGAGCACATTGTTACACAGTTCAGTAGTGTTCCTGTTTCAGTTGTTTCAGATTCTTATGATATTTATAACGCTTGTGAGAAGATCTGGGGAGAGGACCTTCGCCATCTTATTGTTTCACGCTCAACAGAAGCTCCTCTTATTATTCGCCCTGATTCAGGCAACCCTCTTGATACAGTTCTTAAAGTTCTTGATATTCTTGGCAAGAAGTTCCCGGTTACCGAGAATTCCAAGGGTTATAAACTTCTTCCTCCTTATCTTCGCGTTATTCAGGGCGATGGCGTTGATATTAACACACTTCAGGAAATTGTTGAAGGCATGAAACAGAAGAAGTGGTCCATTGAGAATGTCTCATTTGGCTCAGGCGGCGCTCTTCTTCAGAAACTTACACGCGATCTTCTTAACTGTTCATTTAAATGTTCTTATGTTGTTACAAACGGCCTTGGCGTTAACGTGTTCAAAGATCCCGTAGCAGACCCTAACAAACGCTCAAAGAAGGGTCGACTTTCACTTCATCGCACACCTGCTGGCAACTTTGTTACACTTGAAGAAGGCAAAGGCGATCTTGAAGAATATGGCCATGATCTTCTTCATACAGTGTTCAAGAATGGCAAGGTAACGAAGTCCTACTCATTTGATGAAGTTCGCAAGAATGCGCAGCTTAACATTGAACAGGATGTTGCTCCTCATAAGCTT。
得优化基因后，本发明以所述优化基因为模板，利用定点突变引物和高保真酶进行PCR扩增，得扩增产物。本发明所述高保真酶优选包括KOD-Plus-Neo酶，购自东洋纺(上 海)生物科技有限公司。
本发明所述定点突变引物的信息优选如表2所示：
表2定点突变的引物信息
Figure BDA0003044565990000071
Figure BDA0003044565990000081
本发明所述引物在设计时，优选的设置突变位点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游，紧邻重叠区，反向突变引物5’端，引物包括5’端重叠区和3’端延伸区，除了突变位点之外，每条引物的长度大约为25～30bp，5’端的重叠区包含15～20个碱基，3’端延伸区至少含有10个碱基。
本发明所述PCR扩增的体系以50μL计，优选包括突变引物F/R(10μM)各1.5μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO43μL，DNA模板＜1ng，KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL，ddH2O补足50μL。本发明在配制所述体系时，优选在冰上操作，且KOD-Plus-Neo酶最后加入，以保证酶的活性。本发明所述PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸4min，30循环；68℃延伸4min。
得扩增产物后，本发明利用DpnI酶分别消化所述扩增产物后分别连接pPSUMO载体，得重组表达载体。本发明优选使用Takara公司的DpnI快切酶去除模板DNA(未突变)中的甲基化，且酶切体系以50μL计，优选包括：DpnI酶1μL，10×Quickcut Buffer 5μL，扩增产物＜1μL，ddH2O补足50μL。本发明所述消化优选包括将所述酶切体系放置37℃恒温培养箱中静置酶切3h，于85℃金属浴中加热5min，使酶失活后，4℃短暂储存。
本发明将DpnI酶消化后的扩增产物连接入pPSUMO载体，得所述重组表达载体，所述连接优选包括连接入pPSUMO载体的HindIII和NdeI酶切位点之间。本发明对所述连接的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行连接即可。
得重组表达载体后，本发明将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆子，得所述重组菌。
本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规转化方法进行转化即可。本发明在筛选阳性克隆子时，优选用无菌牙签挑取平板中的单菌落于20μL无菌的ddH2O中，于95℃金属浴中加热5min，13000rmp高速离心2min，上清即可作为验证PCR模板，而后利用引物Nampt-F(SEQ ID NO.23：taatccttattcagtggtggtggtggtggtgctc)和Nampt-R(SEQ ID NO.24：aggaagcttgcatatgaacgctgctgctg)进行菌液PCR。
本发明所述菌液PCR的体系以50μL计，优选包括：Premix Taq 25μL，Nampt-F/R各1μL，模板＜1ng，ddH2O补足50μL。本发明所述菌液PCR的程序优选包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30循环；72℃延伸2min。本发明对利用所述菌液PCR挑选出来的阳性克隆子优选再进行验证测序，测序正确的即为所述重组菌。
本发明在得到所述重组菌后，优选以烟酰胺单核苷酸(NMN)的产量作为筛选烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)正向突变菌株的依据，且产生NMN的转化体系以25μL计，优选包括：12.5μL粗酶液、12.5μL母液(1mM NAM，1mM PRPP，1mM MnCl2，1mM MgCl2)。本发明将上述转化体系混合均匀，于37℃，180rmp摇床中反应15min后，在95℃的金属浴中加热1min，使酶失活从而终止反应；然后用pH为6.0的PBS缓冲液稀释到500μL，10000rmp，离心5min，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，转移至液相小瓶中采用HPLC法测量NMN的产量。经验证，本发明获得的10个突变体中，具有比野生型Nampt菌株(E.coli DH5α-ppsumo-Nampt)更高催化活性的突变体为N67K，N164L，R166W，A208G，A245T，S248A，V365L和S382M；催化活性降低的菌株为S155I和V476L。
本发明对所述野生型Nampt菌株(E.coli DH5α-ppsumo-Nampt)的构建方法并没有特殊限定，优选以双酶切的方法进行构建，更优选由苏州金唯智公司合成的来源于小鼠的烟酰胺磷酸转移酶(mNampt)序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并且将其构建到载体pET-30a中克隆到细胞E.coli-DH5α和E.coli BL21(DE3)中，目的基因两端含有酶切位点Hind III和Nde I，并在末尾处加上6×His标签，即构建得到E.coli DH5α-ppsumo-Nampt。
下面结合实施例对本发明提供的一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)用移液枪吸取200μL甘油保藏的菌株E.coliDH5α-ppsumo-Nampt接种于20mLLB培养基(含卡那霉素50μg/mL)，在37℃，200rpm的条件下恒温摇床振荡过夜培养；利用Plasimid Mini Kit I(100)试剂盒(购自OMEGA)抽提质粒；
(2)在冰上配制PCR扩增反应体系(50μL)，最后加入KOD-Plus-Neo酶，以保证酶的活性：突变引物F/R(10μM)各1.5μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO43μL，DNA模板＜1ng，KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL，ddH2O补足50μL；
所涉及的突变引物为表2所示的引物，且由艾基生物技术有限公司合成；
PCR扩增程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸4min，30循环；68℃延伸4min；4℃保存。
(3)取5μL上述PCR反应产物，加1μL 6×Loading Buffer，用点样吸头转入琼脂糖凝胶胶孔中电泳中，于120V电压，室温下运行25min；
(4)使用Takara公司的DpnI快切酶去除模板DNA(未突变)中的甲基化，酶切体系(50μL)：DpnI酶1μL，10×QuickcutBuffer 5μL，(2)中扩增产物＜1μL，ddH2O补足50μL。本发明所述消化优选包括将所述酶切体系放置37℃恒温培养箱中静置酶切3h，于85℃金属浴中加热5min，使酶失活后，4℃短暂储存，利用双酶切的方法连接入pPSUMO载体的Hind III和Nde I多酶切位点之间，而后转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞；
(5)将上述重组菌导入具有卡那霉素(50μg/mL)抗性的固体琼脂培养基中，用无菌牙签挑取平板中的单菌落于20μl无菌的ddH2O中，于95℃金属浴中加热5min，13000rmp高速离心2min，上清即可作为验证PCR模板：PremixTaq25μL，Nampt-F/R各1μL，模板＜1ng，ddH2O补足50μL；
程序优选包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30循环；72℃延伸2min；4℃保存。
(6)将验证出来条带的阳性克隆子(至少3个/平板，图1)，1％接种于含有LB卡那霉素(50μg/mL)抗性液体培养基的锥形瓶(20mL/50mL)中，37℃，180rmp的恒温摇床中振荡培养12h，次日，每个瓶子取1mL送于艾基生物技术有限公司测序，测序结果(图2)与原始Nampt酶进行比对，将成功突变成与设计一致的菌株进行甘油管保菌。
测序所用的引物列于表3。
表3各突变位点的测序引物
Figure BDA0003044565990000111
实施例2
对实施例1中得到的10个突变体进行SDS-PAGE电泳表达验证
1、诱导表达
(1)种子培养：按1％的接种量，从甘油管中取100μL菌液接种到含有Kana(50μg/mL)的LB液体培养基的锥形瓶(10mL/50mL)中，于条件设置为37℃，200rmp的恒温摇床中振荡培养12h。
(2)发酵培养：按2％的接种量，将种子液接种到含有Kana抗性的LB液体培养基的锥形瓶(100mL/500mL)中，37℃，180rmp恒温摇床中培养2～3h至光密度值OD600为0.5～0.6时，加入0.25mM的IPTG，在30℃，180rmp的条件下进行诱导表达12h。
2、样品前处理
(1)取1mL菌液于1.5mL EP管中，6000rmp，25℃，离心3min，弃上清。
(2)加入1mLpH值为7.4的PBS缓冲溶液重悬菌体。
(3)调光密度值OD600为1.0，取10μL的4×Protein Loading Buffer加入30μL的(2)中菌溶液，振荡混合均匀。
(4)沸水煮10min。
(5)瞬时离心3min，取上清20μL上样，SDS-PAGE凝胶电泳：90V运行30min，改调电压为120V运行1.5h。
3、突变后Nampt酶活测试
(1)粗酶液的准备：1)取10mL菌液于50mL离心管中，4℃，4000rpm，离心20min，弃上清。
2)加入10mLpH为7.4的PBS缓冲溶液吹打重悬菌体，放入冰盒内。
3)吸取200μL 2)中的细胞溶液至96孔酶标板中，调节细胞光密度值OD600至1.0。
4)取10mL上述3)进行4℃，4000rpm离心20min，用2mL PBS缓冲液重悬，将其浓缩5倍。
5)准备一个洁净的25mL的小烧杯，将细胞液倒入烧杯中，置于冰水浴中。
6)将超声细胞破碎仪参数设定为功率30％，工作5s，暂停5s，进行细胞超声破碎10min。
7)破碎完毕后，4℃，4000rpm的条件下，离心20min上清液即为粗酶液，可放置-20℃冰箱保存。
(2)转化反应：转化体系：12.5μl粗酶液、12.5μl母液(1mM NAM，1mM PRPP，1mMMnCl2，1mM MgCl2)，混合均匀，于37℃，180rmp摇床中反应15min后，在95℃的金属浴中加热1min，使酶失活从而终止反应。用pH为6.0的PBS缓冲液稀释到500μl，10000rmp，离心5min，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，转移至液相小瓶中采用HPLC法测量NMN的产量。
HPLC法测量条件：
①色谱柱：ChromCore C18反相色谱柱5μm，4.6×250mm。
流动相：A＝磷酸盐缓冲液(pH 3.5)，B＝100％甲醇。
柱温：25℃。
流速：1.0mL/min，波长260nm处紫外检测，进样量20μL。
②标准曲线的测定
称量10～15mg的烟酰胺单核苷酸标准品，用无菌的ddH2O定容至25mL，用ddH2O稀释10倍，作为100％NMN标准液，然后将100％NMN标准液稀释成浓度为1％，10％，20％，40％，60％，80％的NMN标准液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌，利用HPLC测定不用浓度NMN的出峰面积，以NMN浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制NMN标准曲线。
③HPLC测定反应液中的NMN
(1)上样前处理：反应后的转化液于1.5mL EP管中，稀释20倍至500μl，室温下，10000rpm离心3min，用无菌的1mL针头吸取离心后的上清液，通过一次性无菌的0.22μm的微孔滤膜过滤除菌并转移至HPLC专用的液相小瓶中，得到待测样品。
(2)将液相小瓶放入HPLC的自动加样器中，按照方法①设定HPLC的参数条件，测定酶转化反应后的NMN的产量。
结果如图3所示，设计的10个突变体中，具有比野生型Nampt菌株更高催化活性的突变体为N67K，N164L，R166W，A208G，A245T，S248A，V365L和S382M。催化活性降低的菌株为S155I和V476L。在突变体中，Nampt-V356L具有最高的活性。当将突变体Nampt-V356L用于催化时，所获得产物NMN的浓度为45.42mg/L，与野生型Nampt(约28.11mg/L)相比，增加了62％，该位点从中性非极性的缬氨酸突变为中性非极性亮氨酸。因此，在基因序列356的位置，亮氨酸对酶活性有正向作用。其次，突变体Nampt-S248A的催化活性比野生型Nampt菌株高34％，表明疏水性氨基酸(丝氨酸：中性极性亲水氨基酸，丙氨酸：中性非极性疏水氨基酸)改善该区域的环境以增加Nampt的稳定性是有益的。此外，突变体N164L，S382M，A245T和A208G的活性均略有提高，NMN产量分别提高到35.82mg/L，35.75mg/L，34.35mg/L和33.03mg/L。酶活性比原始菌株分别高27％，27％，22％，17％。研究结果也表明其他突变体具有不同程度降低活性的副作用。例如，Nampt-V467L从缬氨酸突变为酸性亮氨酸，酶活性大大降低，该菌株NMN产量仅为9.31mg/L；Nampt-V467L和Nampt-S155I的NMN产量分别下降了53％和31％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 泓博元生命科技（深圳）有限公司
<120> 一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Gly Asn Ala Ala Ala Glu Ala Glu Phe Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp
1 5 10 15
Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys
20 25 30
Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys
35 40 45
Val Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr
50 55 60
Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr Lys Glu Lys Ile
65 70 75 80
Gln Glu Ala Lys Glu Val Tyr Arg Glu His Phe Gln Asp Asp Val Phe
85 90 95
Asn Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu
100 105 110
Pro Ile Glu Val Lys Ala Val Pro Glu Gly Ser Val Ile Pro Arg Gly
115 120 125
Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu
130 135 140
Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu
165 170 175
Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp
180 185 190
Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala
195 200 205
Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Ile
210 215 220
Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp
245 250 255
His Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val Thr Gln Phe Ser Ser Val
260 265 270
Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu
275 280 285
Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr
290 295 300
Glu Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Pro Leu Asp Thr
305 310 315 320
Val Leu Lys Val Leu Asp Ile Leu Gly Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu
325 330 335
Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln
340 345 350
Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu Gln Glu Ile Val Glu Gly Met
355 360 365
Lys Gln Lys Lys Trp Ser Ile Glu Asn Val Ser Phe Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Ala Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu Leu Asn Cys Ser Phe Lys
385 390 395 400
Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Val Asn Val Phe Lys Asp
405 410 415
Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu
420 425 430
His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly
435 440 445
Asp Leu Glu Glu Tyr Gly His Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn
450 455 460
Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Val Arg Lys Asn Ala
465 470 475 480
Gln Leu Asn Ile Glu Gln Asp Val Ala Pro His
485 490
<210> 2
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
catatgaacg ctgctgctga ggccgagttc aatatattgt tagcgaccga ctcgtacaag 60
gtcacgcatt ataaacagta tcctcctaac acatcaaagg tctactcata tttcgagtgc 120
cgcgagaaga agacggagaa ctcgaaagtc cgaaaggtga agtatgaaga aacagtgttc 180
tacgggcttc agtatattct taacaaatat cttaaaggca aagttgttac aaaggagaag 240
atccaggaag ctaaagaagt ttatcgcgaa catttccaag acgatgtctt caatgagcgc 300
ggctggaact atattcttga gaagtacgac ggccatcttc ctattgaagt taaagctgtt 360
cctgaaggct cagttattcc tcgcggcaac gtcctgttta ccgtcgagaa tacggatcct 420
gaatgttatt ggcttacaaa ctggattgaa acaattcttg ttcagtcatg gtatcctatt 480
acagttgcta caaactcacg cgaacagaag aagatcctag ctaaatatct tcttgaaaca 540
tcaggcaacc ttgatggcct tgaatataaa cttcatgatt tcgggtaccg cggcgtttca 600
tcacaggaaa cagctggcat tggcgcttca gctcatcttg ttaactttaa aggcacagat 660
acagttgctg gcattgctct tattaagaag tactacggca caaaggaccc agttcctggt 720
tattcagttc ctgctgctga acattcaaca attacagctt ggggaaagga tcatgagaag 780
gacgcgttcg agcacattgt tacacagttc agtagtgttc ctgtttcagt tgtttcagat 840
tcttatgata tttataacgc ttgtgagaag atctggggag aggaccttcg ccatcttatt 900
gtttcacgct caacagaagc tcctcttatt attcgccctg attcaggcaa ccctcttgat 960
acagttctta aagttcttga tattcttggc aagaagttcc cggttaccga gaattccaag 1020
ggttataaac ttcttcctcc ttatcttcgc gttattcagg gcgatggcgt tgatattaac 1080
acacttcagg aaattgttga aggcatgaaa cagaagaagt ggtccattga gaatgtctca 1140
tttggctcag gcggcgctct tcttcagaaa cttacacgcg atcttcttaa ctgttcattt 1200
aaatgttctt atgttgttac aaacggcctt ggcgttaacg tgttcaaaga tcccgtagca 1260
gaccctaaca aacgctcaaa gaagggtcga ctttcacttc atcgcacacc tgctggcaac 1320
tttgttacac ttgaagaagg caaaggcgat cttgaagaat atggccatga tcttcttcat 1380
acagtgttca agaatggcaa ggtaacgaag tcctactcat ttgatgaagt tcgcaagaat 1440
gcgcagctta acattgaaca ggatgttgct cctcataagc tt 1482
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cgggcttcag tatattctta aaaaatatct taaagg 36
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tttaagaata tactgaagcc cgtagaacac tgt 33
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cctattacag ttgctacact gtcacgcgaa c 31
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
cagtgtagca actgtaatag gataccat 28
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
gttgctacaa actcatggga acagaagaag 30
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
ccatgagttt gtagcaactg taataggata cc 32
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ggaaacagct ggcattggcg gctcagctca tct 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
gccgccaatg ccagctgttt cctgtgatga aac 33
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
cctggttatt cagttcctgc taccgaacat tcaac 35
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
ggtagcagga actgaataac caggaactg 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
tcctgctgct gaacatgcga caattacag 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
actatgttca gcagcaggaa ctgaataac 29
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
attaacacac ttcaggaaat tctggaaggc atgaaac 37
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
cagaatttcc tgaagtgtgt taatatcaac g 31
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
attgagaatg tctcatttgg catgggcggc gctc 34
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
catgccaaat gagacattct caatggacc 29
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
ggattgaaac aattcttgtt cagatctggt atccta 36
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
gatctgaaca agaattgttt caatccagtt tg 32
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
agtgttcaag aatggcaagc tgacgaagtc ctactc 36
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
cagcttgcca ttcttgaaca ctgtatgaag aag 33
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
taatccttat tcagtggtgg tggtggtggt gctc 34
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
aggaagcttg catatgaacg ctgctgctg 29
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
aaaggtctac tcatatttcg agtgccg 27
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
tctgttcgcg tgagtttgta gca 23
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
gtacgacggc catcttccta ttga 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gaactgggtc ctttgtgccg tag 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
ggcgcttcag ctcatcttgt taa 23
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
tgaataacgc gaagataagg aggaag 26
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
agaggacctt cgccatctta ttg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
aggacttcgt taccttgcca ttc 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
gttcaaagat cccgtagcag acc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
gctagttatt gctcagcggt ggc 23

Claims (10)

1.一种烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的突变蛋白，对烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的氨基酸序列进行点突变，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述点突变为：N67K，N164L，R166W，A208G，A245T，S248A，V365L或S382M。
2.一种包括编码权利要求1所述突变蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基础载体包括pPSUMO载体。
4.一种表达权利要求1所述突变蛋白或包括权利要求2或3所述重组表达载体的重组菌。
5.根据权利要求4所述重组菌，其特征在于，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。
6.权利要求4或5所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的编码基因进行密码子优化，得优化基因；
（2）以所述优化基因为模板，分别利用定点突变引物和高保真酶进行PCR扩增，得扩增产物；
（3）利用DpnI酶分别消化所述扩增产物后分别连接pPSUMO载体，得重组表达载体；
（4）将所述重组表达载体分别转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆子，得所述重组菌。
7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤（1）所述优化基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
8.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤（2）所述定点突变引物包括：针对N67K点突变的定点突变引物N67K-F和N67K-R，所述N67K-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述N67K-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
针对N164L点突变的定点突变引物N164L-F和N164L-R，所述N164L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述N164L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
针对R166W点突变的定点突变引物R166W-F和R166W-R，所述R166W-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述R166W-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
针对A208G点突变的定点突变引物A208G-F和A208G-R，所述A208G-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述A208G-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
针对A245T点突变的定点突变引物A245T-F和A245T-R，所述A245T-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述A245T-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
针对S248A点突变的定点突变引物S248A-F和S248A-R，所述S248A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述S248A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
针对V365L点突变的定点突变引物V365L-F和V365L-R，所述V365L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述V365L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
针对S382M点突变的定点突变引物S382M-F和S382M-R，所述S382MK-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述S382M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
9.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，55~65℃退火30s，68℃延伸4min，30循环；68℃延伸4min。
10.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤（4）所述挑选阳性克隆子，包括利用Nampt-F和Nampt-R进行菌液PCR，所述Nampt-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述Nampt-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
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