CN115820689B - 一种多基因串联法提高蔬菜中nmn含量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多基因串联法提高蔬菜中NMN含量的方法及其应用，涉及生物基因工程技术领域。本发明提供了将AgPRS3基因和Nampt基因结合，经密码子优化后分别构建基因表达盒，而后将两个基因表达盒以串联的方式连接入植物表达载体中，获得重组植物转化载体；利用所述重组植物转化载体转化蔬菜作物，可显著提高蔬菜中NMN含量。经转化后获得的转基因蔬菜合成NMN的能力显著提高，在转基因蔬菜中检测出了NMN的含量是野生型蔬菜的5.68倍。转基因蔬菜既可以作为生产NMN的原材料，还大大增加了蔬菜附加价值，具有重要的生产应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种多基因串联法提高蔬菜中NMN含量的方法及其应用。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的前体物质。研究表明，NMN在延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、调控mRNA的表达等方面具有医疗保健效果。近年研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，可以修复脑损伤、改善胰岛功能、保护心脏免于缺血再灌注损伤、修复脑线粒体呼吸缺陷，对急性肾损伤、视网膜退行性疾病等均具有一定治疗作用。
目前，NMN的化学合成法研究较为成熟，但耗时长、成本高、收率低，且在合成中使用大量有机溶剂，造成环境污染，难以实现工厂化大规模生产，大大限制了NMN的应用，因此，低成本、高效率合成NMN成为目前亟待解决的难题。
尽管NMN广泛存在于天然食物中，但是通过食用天然食物摄入NMN的量，远不能达到对人体健康造成关键性影响的水平。我国对于NMN的应用现阶段仍集中在医学方面，在食品的应用处于空白阶段，NMN作为活性物质在功能食品领域开发中具有广阔前景，但是目前并没有NMN含量较高的蔬菜。
本发明利用合成生物学技术，将NMN生物合成途径中的两个基因AgPRS3和Nampt基因结合，优化后在生菜中完全表达，大大提高合成NMN的效率，从而获得富含NMN的转基因生菜，可作为生产NMN的生菜新种质，更可以创造良好的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多基因串联法提高蔬菜中NMN含量的方法及其应用，可在蔬菜作物中将所述基因组合串联表达，从而提高合成NMN的效率，获得富含NMN的转基因蔬菜，作为NMN合成的新原料，创造良好的经济效益。
本发明提供了一种提高蔬菜作物中NMN含量的基因组合，包括AgPRS3基因和Nampt基因。
优选的，所述AgPRS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Nampt基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一组提高蔬菜作物中NMN含量的基因表达盒，包括将密码子优化后的AgPRS3基因与35S启动子和NOS终止子融合形成的AgPRS3S基因表达盒；
和将密码子优化后的Nampt基因与35S启动子和NOS终止子融合形成的NamptS基因表达盒。
优选的，密码子优化后的AgPRS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
密码子优化后的Nampt基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述35S启动子来源于花椰菜花叶病毒，NOS终止子来源于根农杆菌。
本发明还提供了一种将上述基因表达盒串联表达的重组植物转化载体。
优选的，所述重组植物转化载体的基础载体包括pCAMBIA1301。
本发明还提供了上述重组植物转化载体的构建方法，包括以下步骤：将上述基因表达盒中的AgPRS3S基因表达盒和NamptS基因表达盒按AgPRS3S-NamptS顺序依次连接，然后插入基础载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间，获得pCAMBIA1301-AgPRS3S-NamptS重组植物转化载体；
本发明还提供了根据上述基因组合或上述基因表达盒或上述重组植物转化载体在提高蔬菜作物中NMN含量中的应用。
优选的，所述蔬菜作物包括生菜。
本发明还提供了根据上述基因组合或上述基因表达盒或上述重组植物转化载体在培育高NMN含量的蔬菜新品种中的应用。
有益效果：本发明提供了一种提高蔬菜作物中NMN含量的基因组合，将AgPRS3基因和Nampt基因结合，经密码子优化后分别构建基因表达盒，而后将两个基因表达盒以串联的方式连接入植物表达载体中，获得重组植物转化载体；利用所述重组植物转化载体转化蔬菜作物，可显著提高蔬菜中NMN含量。本发明实施例中以生菜为例进行说明，经转化后获得的转基因蔬菜合成NMN的能力显著提高，在转基因蔬菜中检测出了NMN的含量是野生型蔬菜的5.68倍。转基因蔬菜既可以作为生产NMN的原材料，还大大增加了蔬菜附加价值，具有重要的生产应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为AgPRS3S基因和NamptS基因植物转化载体结构示意图；
图2为PCR鉴定结果图(M:15000bp DNAmarker；WT:野生型生菜；1,2,3：转基因生菜)；
图3为NMN含量检测图谱(左图14-1为转基因生菜，右图57-1为野生型生菜)。
具体实施方式
本发明提供了一种提高蔬菜作物中NMN含量的基因组合，包括AgPRS3基因和Nampt基因。
本发明所述AgPRS3基因和Nampt基因为NMN合成途径中的两个基因，其中AgPRS3基因表达磷酸核糖焦磷酸合成酶，有助于合成更多的磷酸核糖焦磷酸，Nampt基因表达烟酰胺磷酸核糖转移酶，利用磷酸核糖焦磷酸和烟酰胺生成NMN。本发明所述AgPRS3基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，Nampt基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一组提高蔬菜作物中NMN含量的基因表达盒，包括将密码子优化后的AgPRS3基因与35S启动子和NOS终止子融合形成的AgPRS3S基因表达盒；
和将密码子优化后的Nampt基因与35S启动子和NOS终止子融合形成的NamptS基因表达盒。
本发明所述密码子优化优选根据目标作物的密码子偏好性进行，如在本发明的实施例中根据植物的密码子偏好性进行密码子优化，密码子优化后的AgPRS3基因(简称AgPRS3S基因)的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示；密码子优化后的Nampt基因(简称NamptS基因)的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示。本发明所述密码子优化，优选按照以下原则进行：(一)优化基因密码子，按照植物密码子偏爱，提高基因翻译效率；(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(四)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(五)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。
本发明利用密码子优化后的基因构建基因表达盒，具体包括将密码子优化后的基因分别与35S启动子和NOS终止子融合，其中所述35S启动子优选来源于花椰菜花叶病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述NOS终止子优选来源于根农杆菌，其核苷酸序列如SEQID NO.6所示。本发明对所述融合的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行即可。
本发明还提供了一种将上述基因表达盒串联表达的重组植物转化载体。
本发明所述重组植物转化载体的基础载体优选包括pCAMBIA1301。
本发明还提供了上述重组植物转化载体的构建方法，包括以下步骤将上述获得的AgPRS3S基因表达盒和NamptS基因表达盒按AgPRS3S-NamptS顺序依次连接，然后用EcoRI和BamHI酶切并连接到经同样酶切的pCAMBIA1301载体上获得AgPRS3S-NamptS重组质粒，即获得pCAMBIA1301-AgPRS3S-NamptS多基因植物转化载体。
本发明还提供了根据上述基因组合或上述基因表达盒或上述重组植物转化载体在提高蔬菜作物中NMN含量中的应用。
本发明所述蔬菜作物优选包括生菜，实施例中采用北生1号(购买于北京开心格林农业科技有限公司)进行转基因操作，该品种详细介绍参照何秉青等人发表的文章《生菜品种筛选试验》，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。经实施例证实，外源基因均完整整合进了生菜基因组中，并且在转基因植株中明显检测出了NMN的含量是野生型生菜的5.68倍。
本发明还提供了根据上述基因组合或上述基因表达盒或上述重组植物转化载体在培育高NMN含量的蔬菜新品种中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种多基因串联法提高蔬菜中NMN含量的方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1构建多基因植物表达载体
1、两基因的优化合成
分别以AgPRS3基因(GenBankNo.NM100946.3)和Nampt基因(GenBankNo.NM021524.2)，根据植物密码子偏好性，合成获得SEQ ID NO.2所示DNA序列AgPRS3S，SEQID NO.4所示DNA序列NamptS；以花椰菜花叶病毒的35S启动子为模板，合成获得SEQ IDNO.5所示DNA序列35S启动子，并测序确定其序列；以根农杆菌的NOS终止子为模板，合成获得SEQ ID NO.6所示DNA序列NOS终止子，并测序确定其序列。
2、多基因植物转化载体构建：优化后的两个基因分别与35S启动子和NOS终止子融合，分别构建两个基因表达盒；再将构建的两个基因表达盒应用ClonExpress MultiS多片段一步无缝快速克隆试剂盒(诺唯赞)按顺序依次连接(AgPRS3S-NamptS)，构成一个含多基因表达盒的完整序列；在完整序列两端分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，完整序列由生工生物工程(上海)股份公司进行核苷酸全序列分析测定。最后将测序正确的完整合成片段经EcoRI和BamHI双酶切后，连入相同酶切载体pCAMBIA1301中，即获得含有两基因的多基因植物转化载体AgPRS3S-NamptS(图1)。
基因与35S启动子和NOS终止子融合采用改良重叠延伸PCR技术，该改良重叠延伸PCR技术具体参考文献：(Rihe Peng,Aisheng Xiong,QuanhongYao；A direct andefficient PAGE-mediated overlap extension PCR method for gene multiple-sitemulagenesis,Applied Microbiology Biotechnology.2006,73:234-40)，使用南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的适合长基因高保真扩增的PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase。PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性45s，56-72℃退火45s，72℃延伸5-20min(1000bp/min)，扩增25-35个循环；72℃终延伸10min。
实施例2生菜的转化
1、转基因生菜的获得及鉴定
1.1农杆菌的准备及电击
1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养20h。
2)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD600≈1.5。
3)8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5wt％蔗糖，0.05wt％Silwet L-77)并稀释至OD600≈0.8。
4)再用0.5倍体积4℃下预冷的无菌水重新充分悬浮菌体，3500g离心10分钟，小心倒去上清。重新充分悬浮菌体于1-2mL经4℃预冷的无菌的10％甘油中，该菌液可立即使用或冻于-70℃存放。
5)在1.5mL的eppendorf中，加入40μL菌液和1-2μL的质粒DNA(0.4pg-0.3μg)，在0.2cm直径的电击杯中混匀，冰上放置1分钟左右。调节电击参数为25μF，2.5kV/cm，400Ω。电击，放电时间为4-5msec。
6)电击转化后，即在菌体中加入1.0mL表达培养液，在29℃下培养1小时，涂于加入抗菌素的YEB平板(利福平(50μg/mL)+卡那霉素(50μg/mL))。利用以上转化程序，将植物表达载体AgPRS3S-NamptS电击转入根癌农杆菌EHA105，获得根癌农杆菌菌株EHA105(AgPRS3S-NamptS)。
1.2农杆菌侵染及与生菜愈伤组织的共培养
1)生菜愈伤组织诱导：
选取北生1号生菜成熟种子(去壳)先用70％乙醇浸泡1min，灭菌水冲洗干净，再用2％次氯酸纳浸泡20min消毒后，以灭菌水反复冲洗干净，置于超净台上的无菌培养皿中，用消毒的滤纸吸干水份，再用解破刀剥取成熟胚，盾片朝上将其接种到培养基上，将胚放置于愈伤诱导培养基(包括MS 4.4g/L、2,4-D2.5mg/L、干酪素600mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶5g/L，用KOH调pH至5.8，高压灭菌)上进行愈伤培养，25-28℃下暗培养8-10天诱导愈伤组织，待胚芽长成1cm，严格筛选质量好的盾片愈伤组织于NBD2(包括NB及2,4-D 2mg/L)培养基上，25-28℃下暗培养4-7天进行继代培养。
2)侵染用根癌农杆菌培养：
从YEB平板上挑取带有植物表达载体(AgPRS3S-NamptS)的农杆菌EHA105，接种到5mL含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃下在摇床上以每分钟200转的速度振荡培养至OD600＝0.5，然后以1：100的比例重新接种到新鲜的YEB培养基中振荡培养，YEB培养基中所含抗生素和培养条件同前。当OD600＝0.5时，将菌液以相对离心力6000×g，4℃下离心10分钟，收集农杆菌菌体，用2/3MS+1/3YEB重悬农杆菌至OD600＝0.5，备用。
3)根癌农杆菌的共培养：
取生长旺盛的生菜胚性愈伤组织，分割成2mm的小块，至于灭菌培养皿中，加入含有100μmol/L乙酰丁香酮的OD600＝0.5的根癌农杆菌菌液，浸泡25min后，用无菌滤纸吸干表面菌液后，将生菜愈伤组织接种于共培养培养基上，28℃下暗培养2-3天。
4)生菜愈伤组织分化和植株再生
收集共培养后的生菜愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸去多余水份。
将愈伤组织转入筛选培养基(包括NB medium、2,4-D 0.5mg/L、头孢(cefotaxime)600mg/L和潮霉素25mg/L)中培养12-15天，其中前6-7天进行黑暗培养，后8-9天进行光照培养，光照强度为45-55mmoL·m-2·S-1。随后将已经分化出不定芽的愈伤组织转移到分化培养基RE2-H中培养15天，可使不定芽长成2-4cm的小苗，其中，分化培养基RE2-H包括MS、蔗糖30g/L、山梨糖10-20g/L、水解酪蛋白500mg/L、6-苄胺基嘌呤1mg/L、萘乙酸0.5mg/L、激动素0.5mg/L、玉米素0.2mg/L、潮霉素50mg/L和琼脂粉8mg/L，pH5.8。
最后将这些小苗转移到生根培养基中，2周后生根，移栽到长试管中培养20-30天，将较大的生菜植株，移栽于营养钵中继续培养。
培养生菜所用培养基配方参照王维鹏的上海交通大学硕士论文《拟南芥GDPMPPASE和GALPPASE基因转化生菜研究》第二章。
2、转基因生菜的鉴定
2.1转化植株基因组DNAPCR检测
取获得的转基因生菜植株叶片，用SDS法抽提基因组DNA作为模版，用PCR扩增方法，分别检测外源基因AgPRS3S和NamptS。所用引物如下：
AgPRS3S：F(SEQ ID No.7):5’-GTG,GCA,CCA,GAC,CGA,CTC,GAC-3’；
R(SEQ ID No.9):5’-TGA,TAG,GTG,CAC,GTG,ACT,TGT-3’。
NamptS：F(SEQ ID No.8):5’-GTT,CAA,CAC,AGT,AAA,CCA,AAA-3’；
R(SEQ ID No.10):5’-AGT,AAG,CCA,AAA,GAA,ATC,AGA-3’。
所用扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性45s；56-72℃退火45s，72℃延伸5-20min(1000bp/min)，扩增25-35个循环；72℃终延伸10min。结果参见图2。
由图2可见，转基因的三个株系都能扩增出上述两个基因，表明外源基因均完整整合进了生菜基因组中。
实施例3转基因生菜植株NMN含量检测
转基因生菜植株中NMN的质谱分析及含量测定：取0.1g生菜植株在冰上研磨成粉末，加入提取液甲醇：乙腈：水(V：V：V＝2：2：1)1mL，涡旋5min后，4℃13000rpm离心10min取上清，将收集的上清过0.22μm的有机滤膜，再注入到进样瓶，进样量20μL，采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)进行分析。
UPLC参数：流动相A：水+0.1％甲酸，流动相B：MeOH+0.1％甲酸，柱温/℃：35，样品盘温度/℃：8，进样体积/μL：1；梯度洗脱程序如下：
| 时间/min | 流速mL/min | B％ |
| 0 | 0.3 | 20 |
| 0.5 | 0.3 | 20 |
| 1.5 | 0.3 | 80 |
| 1.8 | 0.3 | 20 |
| 2.0 | 0.3 | 20 |
MS参数：离子源模式：ESI+，毛细管电压/kV：2.3，离子源温度/℃：150，脱溶剂气温度/℃：500，脱溶剂气流速/(L/hour)：800，锥孔气流速/(L/hour)：20；
检测结果如图3所示，从质谱图中可以看出，在转基因植株中检测出了NMN的含量是野生型生菜的5.68倍。
Claims (4)
1.一种重组植物转化载体，其特征在于，所述重组植物转化载体的构建方法，包括以下步骤：将提高蔬菜作物中NMN含量的基因表达盒中的AgPRS3S基因表达盒和NamptS基因表达盒按AgPRS3S-NamptS依次连接，然后插入pCAMBIA1301的EcoRI和BamHI酶切位点之间，获得pCAMBIA1301-AgPRS3S-NamptS重组植物转化载体；
将密码子优化后的AgPRS3基因与35S启动子和NOS终止子融合形成AgPRS3S基因表达盒；密码子优化后的AgPRS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
将密码子优化后的Nampt基因与35S启动子和NOS终止子融合形成NamptS基因表达盒；密码子优化后的Nampt基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述35S启动子来源于花椰菜花叶病毒，NOS终止子来源于根农杆菌。
2.权利要求1所述重组植物转化载体在提高蔬菜作物中NMN含量中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述蔬菜作物包括生菜。
4.权利要求1重组植物转化载体在培育高NMN含量的蔬菜新品种中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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