KR20140050262A - 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 식물 바이러스 유전자에 삽입된 GDS 카세트 및 역전사효소 (reverse transcriptase)를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 이용하면 조직 배양 없이 식물체를 신속하고 용이하게 형질전환할 수 있다. 또한, 본 발명의 GDS 카세트는 다양한 바이러스 유전자에 적용하여 작동할 수 있으므로 바이러스의 감염이 가능한 다양한 기주식물의 형질전환체를 생산할 수 있다.

Description

식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도 {Gene delivery system for transformation of plant using plant virus and uses thereof}
본 발명은 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (Left border), 프로모터, MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (Right border) 및 tRNA Met 결합 서열을 포함하는 식물체 형질전환용 카세트, 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역에 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 식물체 형질전환용 카세트에 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터 및 역전사효소 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.
지구의 온난화로 인한 기후변화 및 재배환경 변화는 식물체에 질병, 수분, 온도 및 토양 스트레스 등을 심화시키기 때문에 스트레스에 적응하거나 스트레스 저항성 및 수확량이 증가한 다양한 식물체의 개발이 필요하게 되었다. 기존의 육종방법으로는 환경 변화에 적응할 수 있는 식물체를 개발하기가 어려우며, 기존의 형질전환 방법 또한 급변하는 환경에 적응할 수 있는 새로운 식물체를 개발하는 과정은 시간, 비용 및 노동력의 소모가 크다.
일반적으로 외래 유전자가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능 단위 (replicon)를 형성하거나, 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합 (integration)되어 계속적인 복제가 가능하고 유전자 발현이 됨으로써 해로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 식물체의 형질전환을 위해, 기존에는 유전자 총 (particle bombardment)과 아그로박테리움을 이용한 방법이 주로 이용되어 왔으며, 유전자 총 매개 형질전환 방법의 고비용과 저효율로 인해 아그로박테리움을 이용한 방법이 더 많이 이용되고 있다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법은 조직배양을 통해 형질전환체를 완성할 수 있으나 소요되는 개발 시간이 매우 길고, 숙련된 연구자들만이 성공할 수 있는 방법이다. 또한, 상기 방법들은 형질전환체를 완성하기 위해 조직배양 시설 및 재분화 식물체를 키울 수 있는 온실 시설이 필요하여 비용적인 측면에서도 일반 연구자가 이용하기에는 어려움이 있다. 또한 조직배양기간 동안 유식물체의 진균 오염에 대한 주의가 필요하며, 다수의 노동력이 투입되어야 하는 단점이 있다.
식물 바이러스 기반 벡터는 식물체에서 목적 단백질을 효과적으로 발현시키기 위한 유용한 도구이다. 식물 바이러스 기반 발현 시스템은 재조합 단백질을 생산하기 위한 다른 방법들과 비교하여 상당한 이점을 갖는데, 그 이유는 조직배양 세포에 비해 소모 비용이 저렴하고 재배가 수월한 식물체에 직접 적용할 수 있는 방법이며, 외래 유전자의 발현이 빠르게 이루어지기 때문이다. 그러나 이 시스템은 식물체에서 외래 유전자를 일시적으로 발현시키는데 적합하다.
본 발명자는 기존의 형질전환 방법을 대체하기 위한 방법으로 식물 바이러스를 이용한 용이하고 신속한 유전자 전달 시스템 (gene delivery system)을 제공하여, 기후 및 환경 변화에 적응할 수 있는 작물 및 유용 형질이 도입된 다양한 작물을 제작할 수 있는 기술을 제공하고자 한다.
한편, 한국등록특허 제1122955호에는 '콩 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0013000호에는 'BCTV 레플리콘을 함유하는 식물 발현벡터'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (Left border), 프로모터, MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (Right border) 및 tRNA Met 결합 서열을 포함하는 식물 바이러스 유전자에 삽입할 수 있는 유전자 전달 시스템 (gene delivery system, GDS) 카세트 (cassette)를 개발하였고, 식물 바이러스 유전자에 삽입된 GDS 카세트 및 역전사효소 (reverse transcriptase)를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 GDS 카세트 내에 삽입된 목적 유전자가 식물의 염색체에 통합 (integration)되어 발현되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (Left border), 프로모터, MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (Right border) 및 tRNA Met 결합 서열을 포함하는 식물체 형질전환용 카세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역에 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 삽입하는 단계;
상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사 (in vitro transcription)를 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계;
상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하는 단계; 및
역전사효소 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 식물체 형질전환용 카세트 및 역전사효소 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 삽입하는 단계;
상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 식물 바이러스 유전자에 삽입된 GDS 카세트 및 역전사효소 (reverse transcriptase)를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 식물체 형질전환 방법에 따르면, 조직 배양 없이 식물체를 신속하고 용이하게 형질전환할 수 있다. 또한, 본 발명의 GDS 카세트는 다양한 바이러스 유전자에 적용하여 작동할 수 있으므로 바이러스의 기주식물을 이용하여 다양한 형질전환 식물체를 생산할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 5'에서 3' 방향으로 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (Left border), 프로모터, MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (Right border) 및 tRNA Met 결합 서열이 삽입된 카세트를 나타낸다.
도 2는 CaMV 역전사효소 및 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트를 포함하는 벡터를 나타낸다.
도 3은 합성된 CaMV 역전사효소 전사 개시 염기서열인 폴리퓨린 트랙 및 tRNA Met 결합 서열을 나타낸다.
도 4는 폴리퓨린 트랙과 tRNA Met 결합 서열 사이에 삽입되는 [LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB] 카세트를 나타낸다.
도 5는 eGFP가 삽입된 RNA 바이러스인 PVX 및 pCambia:CaMV RT로 형질전환된 아그로박테리움을 담배 식물체에 접종하여, eGFP cDNA의 생성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 SMV의 P1과 HC-Pro 사이에 CaMV 역전사효소가 삽입된 벡터 및 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트가 삽입된 SMV 감염성 클론을 식물체에 접종하여 CaMV 역전사효소 및 카세트 유전자의 삽입 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 알터난테라 모자이크 바이러스 (AltMV) 유전자에 삽입된 [polypurine tract-LB-CaMV35S-eGFP-NOSter-RB-tMet] 카세트 및 CaMV 역전사효소에 의해 애기장대에서 eGFP가 발현되는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (Left border), 프로모터, MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (Right border) 및 tRNA Met 결합 서열을 포함하는 식물체 형질전환용 카세트를 제공한다.
본 발명의 식물체 형질전환용 카세트란 식물체를 형질전환하여 발현시키고자 하는 단백질의 발현을 가능하게 하기 위한 DNA 세트를 말하며, 본 발명에서 사용되는 카세트는 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (Left border), 프로모터, 목적 유전자 삽입을 위한 MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (Right border) 및 tRNA Met 결합 서열로 구성된 DNA 염기서열을 포함한다. 상기 MCS는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된"은 프로모터 서열과 상기 프로모터 서열에 의해 조절되는 MCS 내에 삽입된 목적 유전자 사이의 기능성 연결을 가리킨다. 작동가능하게 연결된 프로모터는 목적 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 조절한다.
본 발명의 식물체 형질전환용 카세트에서, 상기 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract)은 유전체 DNA의 일부 영역에 나타나는 편재된 염기서열로서, 한쪽의 DNA 가닥에 퓨린염기가 정렬하고 나머지 가닥은 피리미딘염기가 정렬하는 특성을 갖는 서열이며, 본 발명에서 폴리퓨린 트랙은 역전사효소 (reverse transcriptase)와 반응하여 전사 개시 염기서열로 작용할 수 있다. 상기 폴리퓨린 트랙은 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 식물체 형질전환용 카세트에 이용된 LB (Left border) 및 RB (Right border)는 목적 유전자가 삽입될 수 있는 부위인 MCS의 앞/뒤에 위치하여 목적 유전자가 식물체의 게놈에 통합될 수 있게 한다. 상기 LB는 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 또한, 상기 RB는 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 상기 MCS는 다양한 제한효소에 의해 인식되고 절단되는 부위인 제한 부위 (restriction site)를 갖는 DNA 단편을 의미하고, 상기 MCS는 특정 제한효소 (restriction enzyme)에 의해 인지되어 절단되므로 절단된 MCS의 부위에 목적 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 상기 MCS는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 공지된 MCS라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 MluI, BamHI 및 NheI 등의 제한효소를 포함하는 DNA 단편일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 MCS는 상기 기재된 3가지 종류의 제한효소 자리 외에도 당업계에서 일반적으로 이용할 수 있는 다른 제한효소 자리를 추가하는 것이 가능하다. 본 발명의 카세트의 MCS에 목적 유전자를 삽입하고자 할 때, 식물 바이러스 유전자에 존재하지 않는 제한효소 자리를 이용할 수 있다. 식물 바이러스 유전자는 각기 서열이 서로 상이하므로 식물 바이러스에 따라 이용하는 MCS 내의 제한효소 자리가 달라질 수 있는 것이다.
본 발명의 식물체 형질전환용 카세트에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 식물체 형질전환용 카세트에서, 상기 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 식물체 형질전환용 카세트에서, 상기 tRNA Met 결합 서열은 역전사효소의 프라이머 역할을 하여 역전사효소에 의한 cDNA 합성을 가능하게 한다. 상기 tRNA Met 결합 서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 역전사효소의 프라이머 역할을 할 수 있는 서열이라면 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체 형질전환용 카세트는 도 1에 기재된 카세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체 형질전환용 카세트는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역 (non coding region)에 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터는 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 식물체 형질전환용 카세트가 삽입되는 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역은 넌코딩 영역 중 전사 조절 영역 (Transcription regulation region)을 제외한 부분이며, 바람직하게는 3' 넌코딩 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 역전사효소 유전자가 삽입되는 식물 바이러스의 ORF 사이의 임의의 위치는 바이러스 단백질의 발현에 영향을 미치지 않으며, 역전사효소가 발현될 수 있는 부위로서, 바람직하게는 식물 바이러스의 프로테아제 1 (protease 1; P1) 코딩 유전자와 바이러스 감염 특이적 공여자 (helper component/protease; HC-Pro) 코딩 유전자 사이에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 재조합 식물 발현 벡터는 상기 식물체 형질전환용 카세트가 삽입된 식물 바이러스 유전자를 포함하는 벡터와 역전사효소가 삽입된 동일한 식물 바이러스 유전자를 포함하는 벡터를 별개로 포함할 수도 있거나, 또는 하나의 벡터에 식물 바이러스 유전자, 상기 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역에 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 유전자를 포함할 수도 있다. 상기 식물 바이러스는 기주식물에 감염하여 증식할 수 있는 식물 바이러스라면, 제한되지 않는다. 즉, 각 기주식물에 따라 식물 바이러스의 종류도 달라질 수 있는 것이다. 바람직하게는 상기 식물 바이러스는 콩 모자이크 바이러스 (soybean mosaic virus; SMV), 포텍스바이러스 (potexvirus)에 속하는 감자 바이러스 X (potato virus X; PVX) 또는 알터난테라 모자이크 바이러스 (Alternanthera mosaic virus; AltMV)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센트 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내에 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 식물체 형질전환용 카세트 또는 역전사효소 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.
상기 식물체 형질전환용 카세트 또는 역전사효소 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB와 LB를 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101 (Cat#: 6018-1, clontech, 미국), pBIN19 (Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 시험관 내 전사 또는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 터미네이터는 식물 세포에서 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 통상의 터미네이터로서, 노팔린 신타아제 (NOS) 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터 또는 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 삽입하는 단계;
상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사 (in vitro transcription)를 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계;
상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하는 단계; 및
역전사효소 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물체의 제조 방법에서, RNA 전사체 제조를 위한 시험관 내 전사는 예를 들면, T7 RNA 중합효소 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 식물체 형질전환용 카세트 및 역전사효소 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 삽입하는 단계;
상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 벡터에 도입될 수 있는 목적 유전자에는 어떠한 제한도 없다. 본 발명의 실시예에서는 목적유전자를 대신하여 리포터 유전자 (reporter gene)인 eGFP (enhanced green fluorescent protein) 유전자가 사용되고 있다. GFP는 장파장의 자외선 조사에 의해서 녹색 형광을 관찰할 수 있으므로, 형질전환된 식물체를 확인하는데 있어서 매우 유용하다.
본 발명의 바람직한 형질전환 식물체의 제조 방법은 상기 식물체 형질전환용 카세트가 삽입된 식물 바이러스 유전자를 포함하는 벡터와 역전사효소가 삽입된 동일한 식물 바이러스 유전자를 포함하는 벡터를 각각 형질전환시키거나, 또는 식물 바이러스 유전자, 상기 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역에 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 유전자를 포함하는 하나의 벡터를 형질전환시키는 방법일 수 있다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 식물체의 형질전환 방법을 구체적으로 설명하면, 재조합 식물 발현 벡터의 MCS에 발현하고자 하는 목적 유전자를 삽입하고, 상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사 (in vitro transcription)를 수행하여 RNA 전사체를 제조하여 상기 RNA 전사체를 식물체에 접종한다. 다음으로, 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하고, 형질전환된 아그로박테리움을 상기 RNA 전사체가 접종된 식물에 접종하면, 생성된 역전사효소가 상기 RNA 전사체 내에 존재하는 tRNA Met 결합 서열을 프라이머로 이용하여 cDNA를 합성하게 된다. 합성된 cDNA는 LB와 RB를 포함하고 있기 때문에 LB와 RB는 LB와 RB 사이의 목적 유전자를 포함하는 서열을 식물의 염색체 내로 삽입하게 하여 결국, 목적 유전자가 식물체 내로 형질전환될 수 있는 것이다.
이러한 과정은 역전사효소 유전자가 별개의 재조합 식물 발현 벡터에 포함될 수도 있지만, 본 발명의 식물체 형질전환용 카세트가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터 내에 삽입될 수도 있다. 후자의 경우에 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 식물체의 형질전환 방법을 구체적으로 설명하면, 재조합 식물 발현 벡터의 MCS에 발현하고자 하는 목적 유전자를 삽입하고, 상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환한 후, 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함한다.
상기 식물 바이러스는 기주식물에 감염하여 증식할 수 있는 식물 바이러스이며, 바람직하게는 형질전환하고자 하는 식물체에 감염하여 증식할 수 있는 식물 바이러스라면, 제한되지 않는다. 바람직하게는 콩 모자이크 바이러스 (soybean mosaic virus; SMV), 포텍스바이러스 (potexvirus)에 속하는 감자 바이러스 X (potato virus X; PVX) 또는 알터난테라 모자이크 바이러스 (Alternanthera mosaic virus; AltMV)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 형질전환 식물체의 제조 방법은 목적 유전자가 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트의 RNA 전사체 및 역전사효소 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 성숙한 식물체에 접종하거나, 역전사효소 유전자 및 목적 유전자가 삽입된 상기 식물체 형질전환용 카세트가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 성숙한 식물체에 접종하여 이루어질 수 있으므로 식물세포의 조직 배양이 불필요하며, 따라서 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 필요로 하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 식물 바이러스가 감염하여 증식할 수 있는 기주식물이라면, 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 콩, 감자 또는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. CaMV 전사 개시 염기서열의 평가
식물 내에서 이동이 자유로운 식물 바이러스를 이용하여, 작물 형질전환을 용이하게 할 수 있는 유전자 전달 시스템 (gene delivery system; GDS)을 개발하기 위한 실험을 수행하였다. 콩 형질전환을 위한 콩 모자이크 바이러스 (soybean mosaic virus; SMV), 채소류의 형질전환을 위한 감자 바이러스 (potexvirus; PVX), 알터난테라 모자이크 바이러스 (Alternanthera mosaic virus; AltMV) 및 CaMV (cauliflower mosaic virus)의 역전사효소 (reverse transcriptase)를 이용하여 GDS 벡터를 제작하였다.
GDS 벡터 제작에 앞서, CaMV 역전사효소 전사 개시 염기서열인 폴리퓨린 트랙 및 tRNA Met 결합 서열을 얻기 위해 합성 올리고머, Poly-P-Top (서열번호 6) 및 Poly-P-Bottom (서열번호 7)을 이용하여 95℃에서 5분간 처리한 후 상온에서 10분간 유지하여 이중가닥을 형성하게 하였고, 5' 및 3' 말단에 NcoI 자리 (nullified)를 추가하여 pUC-ALMCS 벡터의 NcoI 자리에 삽입하였다. 삽입한 염기서열을 확인하였고, 이를 pUC-Al-RT-In이라고 명명하였다 (도 3).
CaMV 역전사효소는 pGD-RT-MluI-F (서열번호 8)및 pGD-RT-XmaI-R (서열번호 9) 프라이머로 증폭한 후, pCAMBIA 바이너리 벡터에 클로닝하여 pCambia:CaMV RT를 제작하였다. 합성된 폴리퓨린 트랙을 평가하기 위해, eGFP를 eGFP-BamHI-F (서열번호 10) 및 eGFP-MluI-R (서열번호 11)로 증폭하여 pUC-Al-RT-In의 폴리퓨린 트랙과 tRNA Met 결합 서열 사이에 삽입한 후 포텍스바이러스 (potexvirus)인 PVX에 클로닝하였다 (도 5).
eGFP가 삽입된 RNA 바이러스인 PVX를 먼저 담배 식물체에 접종하였고, 2주 후에 pCambia:CaMV RT로 형질전환된 아그로박테리움을 아로박테리움 침윤 (agroinfiltration) 방법으로 접종하였다. eGFP의 cDNA 생성 여부를 확인하기 위해 식물체에서 DNA를 추출한 후, RNase로 모든 RNA를 제거하고 상기 eGFP 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. eGFP가 삽입된 PVX 및 pCambia:CaMV RT가 처리된 식물체에서 추출한 DNA에서는 eGFP가 증폭되는 것을 확인할 수 있었고, pCambia:CaMV RT가 처리되지 않은 대조구에서는 eGFP가 증폭되지 않았다 (도 5). RNA 바이러스 내에서 eGFP는 RNA로만 전사되나, CaMV 역전사효소 전사 개시 염기서열인 폴리퓨린 트랙과 tRNA Met 결합 서열 사이에 삽입된 eGFP는 CaMV 역전사효소의 도움으로 cDNA로 전환된 것이다. 이를 통해 합성된 폴리퓨린 트랙이 역전사를 가능하게 하는 구조인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 식물체 형질전환용 카세트 및 벡터 제작
CaMV 역전사효소가 폴리퓨린 트랙과 반응하는 것을 확인하였으므로, 폴리퓨린 트랙과 tRNA Met 결합 서열 사이에 LB (left border), CaMV35S 프로모터, MCS (multiple cloning site), NOS 터미네이터 및 RB (right border)[LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB] 서열이 삽입된 카세트를 포함하는 벡터를 제작하였다. 목적 유전자를 식물세포의 핵 내로 전달하는 식물 바이러스 및 CaMV 역전사효소를 이용하여 cDNA로 전환된 목적 유전자를 식물세포의 염색체에 삽입하기 위한 GDS 벡터는 목적 유전자의 클로닝을 위한 MCS, MCS의 앞/뒤에 LB (TGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAA: 서열번호 4) 및 RB (GTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTAT: 서열번호 5) 서열을 각각 삽입하여 제작되었다. 또한, 목적 유전자의 안정적인 발현을 위하여, CaMV35S 프로모터 및 NOS 터미네이터 서열을 추가하였다 (도 1).
폴리퓨린 트랙 염기서열에 LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB를 추가하기 위하여 Mlu-F-LB (서열번호 12) 및 NheI-R-RB (서열번호 13) 프라이머를 이용하여 바이너리 벡터의 LB부터 RB까지 증폭하였으며, 이를 pUC-Al-RT-In (도 3)에 클로닝하여 pUC-LB-MCS-RB를 제작하였다 (도 4). MCS는 바이너리 벡터에 존재하는 XhoI, BglII, HindII 및 BamHI을 유지하여 목적 유전자를 용이하게 클로닝할 수 있게 하였다.
제작된 GDS 벡터는 CaMV 역전사효소 전사 개시 염기서열인 폴리퓨린 트랙, LB, CaMV35S 프로모터, MCS, NOS 터미네이터, RB 및 CaMV 역전사 효소의 프라이머 역할을 하는 tRNA Met 결합 서열 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet]이 삽입된 카세트 (도 1)를 포함한다. 상기 카세트 서열은 약 1.3 kb이며, 콩 모자이크 바이러스 (SMV)뿐만 아니라 포텍스 바이러스 (potexvirus) 또는 알터난테라 모자이크 바이러스 (AltMV) 등에 삽입되어 다양한 작물에 적용할 수 있게 제작되었다.
실시예 3. 콩 모자이크 바이러스 GDS 벡터 제작
CaMV 역전사효소 및 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트를 콩 모자이크 바이러스 (SMV) 유전자 내에서 발현시키기 위하여, SMV 감염성 클론을 이용하여 SMV GDS 벡터를 제작하였다.
CaMV 역전사효소를 SMV의 프로테아제 1 (protease 1; P1) 코딩 유전자와 바이러스 감염 특이적 공여자 (helper component/protease; HC-Pro) 코딩 유전자 사이에 삽입하기 위해, SMV-MluI-F-RT (서열번호 14) 및 SMV-MluI-R-RT (서열번호 15) 프라이머로 CaMV 역전사효소를 증폭하였다. P1과 HC-Pro 사이에 삽입한 CaMV 역전사효소는 바이너리 벡터인 pGD 벡터에 클로닝하였다 (SMV-CaMV-RT, 도 2). RNA 바이러스인 SMV는 다중단백질 (polyprotein)을 생산하며, 바이러스의 프로테아제가 다중단백질을 절단해야 기능성 단백질로 전환될 수 있기 때문에, P1과 HC-Pro 사이에 삽입된 CaMV 역전사효소에는 SMV 프로테아제의 인식 아미노산인 트레오닌-아르기닌 (Threonine-Arginine) 서열을 포함시켰다.
[polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트는 SMV-LB-XbaI-F (서열번호 16) 및 SMV-RB-XbaI-R (서열번호 17) 프라이머로 증폭하여 SMV의 3' 넌코딩 영역의 XbaI 자리에 삽입하였고, pTOP V2 벡터에 클로닝하였다. [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트가 삽입된 SMV 감염성 클론은 DNA 접종을 배제하고, 시험관 내 전사 (in vitro transcription)로 얻어진 RNA 전사체로 접종하기 위해, pTOP V2 벡터의 CaMV35S 프로모터를 제거한 후, T7 프로모터로 대체하였다 (SMV-LB-MCS-RB, 도 2).
제작된 SMV-CaMV-RT 및 SMV-LB-MCS-RB는 각각 플라스미드 DNA 및 RNA 전사체 형태로 콩 품종 (Jack cultivar)에 접종한 후, 바이러스 병징과 삽입된 유전자가 발현되는 것을 확인하였다 (도 6). 이는 바이러스에서 역전사효소가 발현되는 것을 증명할뿐만 아니라 LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB가 식물 바이러스에서 작동할 수 있음을 증명한다.
실시예 4. AltMV 를 이용한 애기장대용 GDS 벡터 제작
모델식물인 애기장대용 유전자 전달 시스템을 개발하기 위해, 다양한 채소류가 기주식물인 알터난테라 모자이크 바이러스 (Alternanthera mosaic virus; AltMV) 유전자 (GenBank No. GQ179646)에 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트를 삽입한 GDS 벡터를 제작하였다.
AltMV-LB-NcoI (서열번호 18) 및 AltMV-RB-NcoI (서열번호 19) 프라이머로 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트 서열을 증폭한 후, pUC-AltMV-MCS　NcoI 자리에 클로닝하여 pUC-AltMV-LB-MCS-RB를 제작하였다. 제작한 pUC-AltMV-LB-MCS-RB를 애기장대에 접종하여 PCR로 전염성을 확인하였다. eGFP를 LB-eGFP-XhoI-F (서열번호 20) 및 RB-eGFP-BamHI-R (서열번호 21)로 증폭하고, MCS의 XhoI과 BamHI 자리에 클로닝하여 최종적으로 pUC-LB-eGFP-RB를 제작하였다. LB-eGFP-RB는 AltMV-LB-MluI-F (서열번호 22) 및 AltMV-RB-NcoI (서열번호 23) 프라이머로 증폭하여 pGD-AltMV-MCS의 NcoI과 MluI 자리에 클로닝하였다. 역전사효소를 이용한 eGFP cDNA 합성을 확인하기 위하여, [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트는 반대 방향으로 삽입되었다 (도 7). AltMV-inverted LB-eGFP-RB는 XbaI으로 직선화시켜 시험관 내 전사를 수행하였고, 얻어진 RNA 전사체를 애기장대에 접종하였다. 접종 2주 후 병징이 발생한 잎에 CaMV RT를 아그로박테리움 침윤 (agroinfiltration) 방법으로 발현시켰다. 형광 현미경을 이용하여 애기장대 잎에서 eGFP가 발현되는 것을 확인하였다 (도 7). 이 결과는 [polypurine tract-LB-CaMV35S-MCS-NOSter-RB-tMet] 카세트가 애기장대 잎 세포의 염색체에 삽입되었음을 증명한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yeungnam University <120> Gene delivery system for transformation of plant using plant virus and uses thereof <130> PN12268 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypurine tract <400> 1 ccatgaaaga gtggggggga 20 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA met binding sequence <400> 2 aaaaattggt atcagagcca tgaatcg 27 <210> 3 <211> 1336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDS cassette <400> 3 ccatgaaaga gtggggggga ttacgcgtgt tggctggctg gtggcaggat atattgtggt 60 gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga 120 attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg ttttaggaat 180 tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg gtttcttata 240 tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg gaactactca 300 cacattatta tggagaaact cgaattcgag ctccaccgcg gctgagtggc tccttcaacg 360 ttgcggttct gtcagttcca aacgtaaaac ggcttgtccc gcgtcatcgg cgggggtcat 420 aacgtgactc ccttaattct ccgctcatga tccggggaat taattccgat cctatctgtc 480 acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata 540 aaggaaaggc tatcattcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 600 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 660 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 720 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc 780 tctctacaag atctcgagct caagcttcga attcttaagg atccggatcc taatcagcca 840 taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct 900 gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt tgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt 960 tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc 1020 ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt 1080 aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt 1140 aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt 1200 catctatgtt actagatcgg gaattaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 1260 aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacgggcta gcaaatcaga aaaattggta 1320 tcagagccat gaatcg 1336 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Left border <400> 4 tggtggcagg atatattgtg gtgtaaacaa 30 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right border <400> 5 gtaaacctaa gagaaaagag cgttat 26 <210> 6 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 catgaaagag tgggggggat tacgcgtcat aaggatccat aagctagcaa atcagaaaaa 60 ttggtatcag agccatgaat cga 83 <210> 7 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tcgattcatg gctctgatac caatttttct gatttgctag cttatgggat ccttatgacg 60 cgtaaacccc cccactcttt catg 84 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gagaatgcgt gctaagactc agcaacctga g 31 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gagacccggg tgcggaatta accttattg 29 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gagaggattc atggtgagca agggcgagga gct 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gagaacgcgt ttaaaaccta agccaaagca gag 33 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gagaacgcgt gttggctggc tggt 24 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gagagctagc ccgttattct aataaacgct ctttct 36 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gagaacgcgt gctaagactc agcaacctga g 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gagaacgcgt tgcggaatta accttattg 29 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gagatctaga ttatcctatt gtcatcctag tt 32 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gagatctaga gccctgatgg tctcacaggt ggc 33 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gagaccatgg ttatcctatt gtcatcctag tt 32 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gagaccatgg gccctgatgg tctctggtgg c 31 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gagactcgag atggtgagca agggcgagga gct 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gagaggatcc aataaaccta agccaaagca gag 33 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gagaacgcgt ttatcctatt gtcatcctag tt 32 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gagaccatgg gccctgatgg tctctggtgg c 31

Claims (11)

  1. 5'에서 3' 방향으로 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract), LB (left border), 프로모터, MCS (multiple cloning site), 터미네이터, RB (right border) 및 tRNA Met 결합 서열을 포함하는 식물체 형질전환용 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract)은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, tRNA Met 결합 서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체 형질전환용 카세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카세트는 도 1에 기재된 카세트인 것을 특징으로 하는 식물체 형질전환용 카세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체 형질전환용 카세트.
  5. 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 넌코딩 영역에 삽입된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 식물체 형질전환용 카세트를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 식물 발현 벡터.
  7. 식물 바이러스 유전자 및 상기 식물 바이러스 유전자의 각 ORF (open reading frame) 사이의 임의의 위치에 삽입된 역전사효소 (reverse transcriptase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  8. 제5항의 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 삽입하는 단계;
    상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사 (in vitro transcription)를 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계;
    상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하는 단계; 및
    제7항의 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
  9. 제6항의 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 삽입하는 단계;
    상기 목적 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 접종하는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
  10. 제8항 또는 제9항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체.
  11. 제10항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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BR112019018059A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, método para produzir um polipeptídeo, método de controle de ervas daninhas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
CA3055389A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Hppd variants and methods of use
JP6850041B2 (ja) 2017-05-31 2021-03-31 国立大学法人 筑波大学 植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用
US20210040472A1 (en) 2019-08-09 2021-02-11 Nutcracker Therapeutics, Inc. Methods and apparatuses for manufacturing for removing material from a therapeutic composition
CN112011552A (zh) * 2020-08-27 2020-12-01 鲁东大学 微型月季次生发育关键基因RhSND2的克隆及表达载体的构建方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5850023A (en) * 1992-11-30 1998-12-15 Monsanto Company Modified plant viral replicase genes
GB9621680D0 (en) 1996-10-17 1996-12-11 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
ATE405658T1 (de) * 2002-07-26 2008-09-15 Basf Plant Science Gmbh Neue selektionsverfahren
US20050048652A1 (en) * 2003-08-19 2005-03-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Retroelement vector system for amplification and delivery of nucleotide sequences in plants
EP2363483A3 (en) * 2004-03-05 2014-07-16 Benitec, Inc. Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of RNAi agents
EP3502256A3 (en) * 2008-09-26 2019-09-25 Tocagen Inc. Recombinant vectors

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