CN116200390A - 一种Ghicr24CRU_D08启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，提供一种Ghicr24CRU_D08启动子及其应用，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的启动子能够驱动目的基因在植物在种子发育后期(10‑15DPA)、萌发时期(吸胀0‑24h)和幼苗(0‑14d)子叶和根中特异性表达。

Description

一种Ghicr24CRU_D08启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，主要涉及一种来源于棉花的启动子及其在植物中的应用。

背景技术

基因启动子(Promoter)是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，虽然启动子本身不被转录，但它是基因(Gene)的一个重要组成部分。启动子能控制基因表达的水平、起始时间和部位，是基因表达调控的关键“开关”。不同启动子决定了基因千差万别的表达特性，运用基因工程技术，克隆一些已知调控功能的启动子到目的基因，可以按照人们的需求达到改变特定基因的表达模式，调控特定基因表达的目的。随着基因工程技术的不断发展，启动子的作用也将不断发挥出来，为基因工程技术提供重要的技术支持。

种子(Seed)，是裸子植物和被子植物特有的繁殖体，它由胚珠经过传粉受精形成，对延续物种起着重要作用。同时种子也是重要的农业生产资料，与人类生活密切相关，除日常生活必需的粮、油、棉外，一些药用(如杏仁)、调味(如胡椒)、饮料(如咖啡、可可)原料都来自种子。鉴定和利用在植物种子发育和萌发中特异性高量表达的启动子对植物学研究和种植业生产都有重要意义，具有不可忽视的生物学和经济价值。但是在转基因工作中，不分时期过表达外源基因会给生物本身造成很大的负担，也给科研工作带来许多不可控的影响，这对深入研究十分不利。现有技术中还未发现能驱动目的基因在植物种子发育和萌发时期特异性高表达的启动子。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种启动子及其应用，该启动子能够驱动目的基因在植物种子发育后期、萌发时期和幼苗中特异性表达。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列。

所述SEQ ID NO：1的序列如下：

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在本发明中，将SEQ ID NO：1所示的启动子序列称为启动子Ghicr24CRU_D08。带有该启动子和棉花Ghicr24CRU_D08基因以及β-葡萄糖苷酸酶(β-g lUcUronidase，GUS)基因的拟南芥经GUS染色后，所述拟南芥在成熟的根、茎、叶、花(除花药外)、0-6DPA的角果中均未有蓝色表达，在花药和莲座叶叶柄中有少量蓝色表达，而在10-15DPA的角果、成熟干种子、萌发期间的种胚、7d幼苗、14d幼苗(子叶、下胚轴、根)中蓝色稳定高量表达。

本发明的另一方面涉及一种核酸构建体，其包含本发明所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。在本发明的一个实施方案中，所述基因为GUS报告基因。

本发明的另一方面涉及一种载体，所述载体含有本发明所述的启动子或核酸构建体，所述载体可以通过例如将上述启动子核苷酸序列或核酸构建体插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于pBI121。

在本发明的一个实施方案中，所述载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将过表达载体pBI121进行酶切，得到酶切载体；

2)将本发明所述的启动子重组到步骤1)得到的酶切载体中，得到融合载体。

实现步骤1)酶切使用的酶包括但不限于限制性内切酶Hind III和BamH I。在本发明中，所述酶切去除过表达载体pBI121中的35S启动子。本发明对酶切的条件没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。

本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于重组大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

本发明的还一方面涉及制备SEQ I D NO：1所示的启动子的方法，包括以棉花基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在棉花gDNA中的序列分别针对首尾进行设计。

在本发明的一个实施方案中，所述扩增引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：

5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTttactacaaacaagactgaagtgc-3’；

所述扩增引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

5’-GGACTGACCACCCGGGGATCCcatatctacgtgttgaaatgg-3’。

在本发明的一个实施方案中，所述扩增的体系包括：

在本发明的一个实施方案中，所述扩增的的程序包括:

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本发明的还一方面涉及一种调控植物中目的基因表达的方法，所述方法包括将本发明的启动子核苷酸序列和/或核酸构建体和/或载体转化入植物愈伤组织或外植体中的步骤，或用本发明的重组细胞感染植物或植物的愈伤组织或外植体的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述目的基因为棉花基因和/或GUS基因。

在本发明的一个实施方案中，将含有重组载体pBI121::Pro Ghicr24CRU_D08的重组细胞转化入拟南芥植物中，筛选T2代转基因拟南芥植株，在花药和莲座叶叶柄、10-15DPA的角果、成熟干种子、萌发期间的种胚、7d幼苗、14d幼苗经GUS染色均证明GUS基因已表达，而在成熟的根、茎、叶、花(除花药外)、0-6DPA的角果中GUS基因均未有表达。

为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用。

在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

本发明的还一方面涉及本发明的启动子核苷酸序列和/或核酸构建体和/或载体和/或重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，所述调控为调控目的基因在植物种子发育后期、萌发时期和幼苗中的特异性表达。特别的，所述调控为调控目的基因在植物种子10-15DPA发育期、萌发时期和0-14d幼苗的子叶、胚轴和根中特异性表达。

本发明的有益效果

本发明的启动子可用于在种子发育后期、萌发时期和幼苗中特异性表达外源目的基因，以便研究这些目的基因对种子发育和活力的影响，也可用于特异性表达某些对种子发育和活力有利的基因，实现种质资源的改良和增产。本发明的启动子调控目的基因在特定时期的表达，减少转基因对植物造成的负担，避免由于不分时期过表达外源基因而对植物的生长发育造成不良影响，使研究更具有可控性。

附图说明

图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为过表达载体pBI121的结构图；

图3为pBI121::Pro Ghicr24CRU_D08载体的PCR鉴定电泳图；

图4为部分T2代转基因拟南芥植株的PCR鉴定电泳图；

图5为转pBI121::Pro Ghicr24CRU_D08拟南芥的GUS染色结果图；其中，A、干种子；B、吸胀12h的种子；C、吸胀12h的种胚；D、吸胀12h的种皮；E、吸胀24h的种子；F、7d幼苗；G、14d幼苗；H、根；I、茎和茎生叶；J、花；K、花药；L、3DPA角果；M、6DPA角果；N、10DPA角果；O、12DPA角果；P、15DPA角果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

Ghicr24CRU_D08启动子克隆和测序

1、以中棉24(ZM24)的基因组DNA为模板，采用Ghicr24CRU_D08p-Hind III-F和Ghicr24CRU_D08p-BamH I-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2003bp。引物序列如下：

Ghicr24CRU_D08p-Hind III-F(SEQ ID No.2):

5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTttactacaaacaagactgaagtgc-3’；

Ghicr24CRU_D08p-BamH I-R(SEQ ID No.3):

5’-GGACTGACCACCCGGGGATCCcatatctacgtgttgaaatgg-3’。

扩增的体系包括：

扩增的的程序包括:

2、对步骤1获得的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化。

3、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(泳道Marker为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1、2为PCR扩增产物，大小约为2003bp，产物序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2

pBI121::Pro Ghicr24CRU_D08载体构建

1、使用限制性内切酶Hind III与BamH I酶切过表达载体pBI121(该载体的结构如图2所示)，得到切去35S启动子的线性载体序列。

酶切体系：

酶切条件：37℃，2h；65℃，20min。

2、将扩增纯化后的实施例1的启动子序列和酶切后的pBI121载体使用重组试剂盒(诺唯赞公司)进行重组。再将重组产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。将其涂布于含卡那霉素的LB抗性平板上，在37℃下培养12h，筛选阳性克隆并测序。由于启动子本身结构复杂，用启动子全长加上载体部分序列从转基因拟南芥中扩增的难度较大，给检测带来不便，所以本实验设计启动子中间设计引物与载体引物一起扩增，减少扩增产物长度，方便检测。用引物Ghicr24CRU_D08p-1284F(SEQ ID No.4)(5’-TGCGTAGGTTCTTCACGTCC-3’)和GUS-R(SEQ ID No.5)(5’-GCGAACTGATCGTTAAAACTGC-3’)进行菌落PCR检测和测序。鉴定结果表明：PCR扩增得到大小约为910bp的条带的载体为正确连接的pBI121::Pro Ghicr24CRU_D08载体(图3)。

实施例3

转基因拟南芥的获得

将实施例2构建好的pBI121::ProGhicr24CRU_D08载体导入到农杆菌GV3101感受态细胞，采用Floral-dip方法得到转基因拟南芥。

转基因植株鉴定

提取经过抗性筛选后的T2代转基因拟南芥植株的叶片的基因组DNA，用ProGhicr24CRU_D08-1284F和GUS-R引物对T2代转基因拟南芥植株的基因组DNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转pBI121::ProGhicr24CRU_D08拟南芥植株。部分T2代转基因拟南芥植株的PCR鉴定电泳图见图4。泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1、4、8、9、12为T2代转基因阳性拟南芥的PCR扩增产物，大小约为910bp。

转pBI121::ProGhicr24CRU_D08拟南芥的GUS染色

取经过PCR鉴定为阳性的T2代转pBI121::ProGhicr24CRU_D08拟南芥植株的成熟干种子、吸胀12h的种子(种皮和种胚)、吸胀2h小时的种子、7d幼苗、14d幼苗，成熟的叶、茎、根、花器官和3DPA、6DPA、10DPA、12DPA、15DPA的角果进行GUS染色分析。GUS染色分析的具体步骤如下：将植株的各组织在GUS染色液中37℃浸泡12小时，然后用75％的乙醇溶液脱色2-3次，在体式显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点(图5)。该结果表明Ghicr24CRU_D08基因的启动子在成熟的根、茎、叶、花(除花药外)、0-6DPA的角果中均未有表达，在花药和莲座叶叶柄中有少量表达，而在10-15DPA的角果、成熟干种子、萌发期间的种胚、7d幼苗、14d幼苗(子叶、下胚轴、根)稳定高量表达。由此可知，Ghicr24CRU_D08启动子是一个在种子发育后期(10-15DPA)、萌发时期和幼苗(0-14d)的子叶、胚轴和根中特异表达的启动子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子由选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列组成：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列。

2.一种核酸构建体，其特征在于，包含权利要求1的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。

3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述基因为GUS报告基因。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1的启动子或权利要求2或3所述的核酸构建体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为权利要求1所述的启动子或权利要求2或3所述的核酸构建体与pBI121质粒经重组得到的重组载体。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求2或3的核酸构建体或权利要求4或5的载体，其为重组大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

7.权利要求1所示的启动子的制备方法，其特征在于，包括

以棉花基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在棉花gDNA中的序列分别针对首尾进行设计。

8.一种调控植物中基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括，将权利要求1的启动子、或权利要求2或3的核酸构建体、或权利要求4或5的载体、或权利要求6的重组细胞导入植物或植物愈伤组织。

9.权利要求1的启动子、或者权利要求2或3的核酸构建体、或者权利要求3或4的载体、或者权利要求6的重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，其特征在于，所述调控为调控目的基因在植物种子发育后期、萌发时期和幼苗中的特异性表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述调控为调控目的基因在植物种子10-15DPA发育期、萌发时期和0-14d幼苗的子叶、胚轴和根中特异性表达。

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