CN115354042A - 一种启动子及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种启动子及其制备方法与应用，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；b、在严格条件下能够与a所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；c、与a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本发明方案得到的启动子能够在植物中调控基因表达，同时还能驱动基因在植物的种子中表达，为植物的遗传改造提供了一种新的工具和选择。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种启动子及其制备方法与应用。
背景技术
启动子是指基因中一段可与RNA聚合酶及其它一些影响转录的反式因子结合实现精确有效起始转录的DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。植物基因表达(转录)的起始时间和表达的程度受启动子的控制，启动子的克隆及功能分析是植物基因表达调控研究的重要内容，也是植物基因工程研究的一个重要方面。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种启动子，所述启动子能够用于调节植物中目的基因的表达。
本发明还提出一种含有上述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还提出一种上述启动子的制备方法。
本发明还提出一种上述启动子的应用。
本发明还提出一种利用上述启动子调控植物中基因表达的方法。
本发明还提出一种转基因植物的制备方法。
根据本发明的一个方面，提出了一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：
a、SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
b、在严格条件下能够与a所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
c、与a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，上述严格条件为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在温度60～70℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1～3次。
在本发明的一些实施方式中，所述上述核苷酸序列再制备启动子中的应用。
本发明的第二方面提供了一种含有上述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为植物表达载体、植物病毒载体的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为pBI121载体、Ti质粒、Ri质粒的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述宿主菌为DH5α、农杆菌。
一组用于扩增上述启动子的引物对，所述引物对包括核苷酸序列SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列SEQ ID NO.3所示的下游引物。
根据本发明的第三方面提出一种上述SEQ ID NO.1启动子的制备方法，所述方法包括如下步骤：以拟南芥基因组DNA为模板，使用上述引物对进行扩增。
根据本发明第四方面实施方式，提出了上述启动子的应用，所述应用包括在植物育种中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述启动子在调控植物中目的基因表达中的应用。
一种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括如下步骤：将包括目的基因和上述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌导入植物细胞；优选导入植物愈伤组织；进一步优选的，所述植物愈伤组织是通过上述启动子或重组表达载体或重组农杆菌转化的。
在本发明的一些实施方式中，所述启动子位于所述目的基因的上游。
在本发明的一些实施方式中，所述植物为十字花科植物。
在本发明的一些实施方式中，所述植物为拟南芥或油菜。
一种转基因植物的制备方法，所述方法包括如下步骤：将包括目的基因和上述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌导入植物细胞。
根据本发明实施方式的一种启动子及其制备方法与应用，至少具有以下有益效果：本发明方案提供的启动子能够在植物中调控基因表达，同时还能驱动基因在植物的种子中表达。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物特别是十字花科的产油作物的遗传改造提供了一种新的工具和选择。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例2中的重组质粒pBI121-LBD42pro-GUS的结构示意图；
图2为本发明测试例中的转基因拟南芥的角果染色图；
图3为本发明测试例中的有野生型拟南芥的角果染色图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1 LBD42启动子片段的PCR扩增和pBI121-LBD42pro重组载体的构建。
一、LBD42启动子片段的获得，包括如下过程：LBD42启动子片段的PCR扩增。
使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒)提取拟南芥叶片的基因组DNA，根据该启动子在拟南芥gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物，引物核苷酸序列如表1所示。以上述提取的拟南芥gDNA为模板，使用高保真Ex Taq聚合酶(TaKaRa，DRR100B)进行PCR扩增。PCR反应体系如表2所示。LBD42启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
表1引物核苷酸序列
表2 PCR反应体系
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸2min，进行30个反应循环，最后72℃延伸7min。
通过琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段。
取50μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，胶回收试剂盒购自广州美基生物有限公司。
二、pBI121-LBD42pro-GUS重组载体的构建
1、酶切pBI121表达载体
质粒pBI121，用HindⅢ和XmaI进行双酶切，酶切体系如表2所示。
表3质粒的双酶切体系
2、将双酶切后的载体与目的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用购自广州美基生物有限公司胶回收试剂盒进行胶回收。
3、目的基因片段和载体的连接
将回收纯化的目的片段与回收纯化的载体连接，连接产物命名为pBI121-LBD42pro-GUS。连接体系如表3所示如下：
表4连接体系
连接反应条件：25℃反应30min。
4、连接产物转化感受态细胞
取10μL连接产物转化100μL DH5α感受态细胞：将产物与感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的500μL LB培养基，180rpm，37℃恒温摇床培养1h，5000rpm离心3min，弃去500μL培养上清，剩余100μL用移液器混匀后均匀涂布于含50μg/mL卡那抗性的LB平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。
5、测序鉴定
挑选阳性单菌落送至擎科生物工程有限公司测序。
测序结果表明，获得的pBI121-LBD42pro-GUS克隆载体中LBD42pro启动子序列正确。LBD42pro启动子的序列如序列表中Seq ID No.1所示。
6、从测序正确的阳性菌株中提取质粒
对测序正确的阳性菌株进行扩大培养，加入含相应抗生素的20ml LB培养基中37℃过夜培养，提取质粒。
重组质粒pBI121-LBD42pro-GUS的结构示意图如图1所示。
实施例2转基因植株的获得
1、重组质粒的转化
将实施例2中构建好的重组质粒pBI121-LBD42pro-GUS电击转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌(Agrobacterium tumefaciens GV3101/pBI121-LBD42pro-GUS)，在kan和Rif抗性培养基上培养两天后，挑取单菌落，摇菌鉴定阳性克隆。
2、菌液的准备
将鉴定为阳性的农杆菌感受态细胞在28℃过夜培养，取5-6ml菌液于4000rpm离心5min后，去上清，使用含MES(10mM)，MgCl(10mM)，AS(150uM)的重悬液重悬至OD600值为0.8左右，28℃避光静置2～3h左右，得到侵染菌液。
3、侵染
通过花浸泡法(花浸在步骤2的菌液中30秒)将重组质粒pBI121-LBD42pro-GUS分别导入60株拟南芥(Columbia-0)，收获的种子即为T0代拟南芥的种子。
4、筛选
将T0代拟南芥的种子播种于含卡那霉素(20mg/L)的MS培养基上进行筛选，得到20株具有卡那霉素抗性的T1代拟南芥。
5、转基因植株的获得
待T1代拟南芥长至4-6片叶子时将其移栽到蛭石上生长45天(24℃；16小时/光照+8小时/黑暗)，分别提取20株T1代拟南芥叶子的DNA，用F2(LBD42pro的正向引物2)和R2(GUS的反向引物)组成引物对进行PCR鉴定，检测GUS基因是否整合到拟南芥中，结果显示得到约600bp的PCR扩增产物，即植株为转基因植株。
实验结果表明，20株T1代拟南芥均为转基因拟南芥。
测试例GUS染色分析
实验组采用实施例3获得的长至4-6片叶子的转基因拟南芥(Columbia-0)移栽到蛭石上生长45天(生长条件：24℃；16小时/光照+8小时/黑暗)，对照组采用野生型拟南芥生长条件与实验组一致。将实验组与对照组获得的拟南芥(20株)进行GUS(β-葡萄糖苷酸酶)染色分析。
实验结果如图2-3所示，图2为实验组转基因拟南芥的角果染色图，从图中可以看出20株转基因拟南芥种子均显示蓝色；图3为对照组野生拟南芥的角果染色图，从图中可以看出，20株野生型拟南芥种子均未被染色，结果表明，本发明方案获得的启动子可以驱动GUS基因在种子中表达。
LBD转录因子是含有保守LOB结构域的一类蛋白家族，植物特有的锌指DNA结合转录因子家族。在拟南芥中有43个LBD基因，这些基因在调控植物生长发育，次级代谢等方面都起着重要的作用。由于LBD42基因能在种子中高效表达，因此发明人猜测该基因表达的启动子序列应该也能调控其他基因在种子高效表达，通过核苷酸序列比对，以及大量的前期试验，筛选出可以用于作为启动子调控目的基因在种子中高效表达的核苷酸片段。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种启动子及其制备方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaatgttat tgccatatga ctagcatata tcatatttta gaacacaact aatacccaaa 60
cccacacgat cacagtttgt agtagtgaaa gagaaaagtt gaaaggaatt tatccatgtt 120
taatctatgc tcaaaacaaa aatcacatat gtttggaagt ttgatgttgg attttggccc 180
aagcagtatt cggatttaaa ctaactggat atcctaaata ttagtcaaaa aacattctaa 240
atttgggata gatagtatcg tgatctttcg gagagaaaca cactttaaag tagttttagt 300
acatttctat tgaaattaat caaatcagcc aatcaaacat attttttaaa aaacaaaatc 360
ccaaattata actagattaa tatcattcag ccaatttcct ctttcattat aattttctac 420
atcaaacttt gtaccggcct tgattacttg cgtgaacaaa aaaaaagtct actatttctt 480
tttaaacatt ttatattaac tattcaaaag ttatgataca acgtgatgtc ttttctaaac 540
catttctaaa ccactgaaat ttttgttttc aagaaaatca accaatttga tgaaaatggt 600
aacggtaatc ctatttttct gatgtcgata tgcgctatgg aactaatgta caactaaaaa 660
ctgagtatac tatcaatcac acgtcggttt tatcaatctt tctccatcac cttgaaaaag 720
tgaactcgga cgtggaccat ataacaaaaa catgttctta agttaaacat ttatatttct 780
tattaatgat gtaaaacgat gctaaaccag actcaagaaa aaaatacaaa aaaaaaaaga 840
ttccaaacct tttttgtaac aaacattttc tgaaaattaa ataatcctta aatcattttg 900
taagaaggct ataagccaat aaacatcaaa accccttttt cttataccag aacgagtggc 960
aaaattttcg acaggcagcc cctgttattt gttttcttcc cgaaaacaaa actgtaacgt 1020
ttgtaaattg taacttattt aacaatttta gaaattaaat tttgtttcac attagttgtt 1080
gtcttgttaa attattaacg cttctttaat ttgtcatttc tttttgagag aaaaaaatct 1140
taaatttgtc ttttcatact aaatattgta ttttccccca agtaaatata cggtccaatt 1200
ccgtatagcc tccctaaaac ctggagtaga aatatgcttg aagatgaaca aggagttttg 1260
tctcgcgtgt gtgtaattca cgtgcctcat ttttgcttaa tatttttatt ttctctttca 1320
gaagatttta agacttaaag attttctttt ggtttttttt tttttgtcgg tatcatctct 1380
gtgggtggtt ctcgtgcatg tctcccactt ttcatctcca aagtttcctc gtatctccac 1440
ccctctgaac atctgctaac attcaattac gtaaacaccc tcacattttc atctcttatc 1500
ttatggtttt catgctttaa tttgaatttc aaaagtagct tgcactgcat agagagtcat 1560
aagaccttgg aatcaatgtt gatatgatga ggattgagaa acgagcgttg aagaagaggt 1620
ttgtcattgg gtgagacgta attaattact atactataga taaaggtgac taggtgagtg 1680
gtaaaagtcg taatattgga atgcatggat ggcaaatccc atagaagaaa aaaaagtgta 1740
agagagagaa gttggtattc ccgaagaagg aactccccaa cttttgccaa aacaaaatgc 1800
caacttcact gaaacacaca acctccttcc cctcatttct tggccttttc tctatctttt 1860
gagaaatcta tacaaatatt ttactaattt ctctcttgag aaagtaatta tctttaatgt 1920
atttgtttta taaaagcctg gactgcacca gtttttttcc accactttct ccaagaacac 1980
acaaaagttg aaaaatacca gctcattcac ttatgactca tgagtaactt cttccttata 2040
aattcaaatt gttcacaact tccttgagtt ccatttccga acacaaacac acatcatacg 2100
tatatttgtc actaataaac atataaagga at 2132
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccaagctta aaatgttatt gccatatga 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacccggga ttcctttata tgtttatta 29
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gataaaggtg actaggtgag tggta 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacgggttgg ggtttctaca g 21
Claims (10)
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：
a、SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
b、在严格条件下能够与a所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
c、与a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列在制备启动子中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.一组用于扩增权利要求1所述启动子的引物对，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列SEQ ID NO.3所示的下游引物。
5.一种制备权利要求1所述的启动子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以拟南芥基因组DNA为模板，使用权利要求4所述的引物对进行扩增。
6.根据权利要求1所述的启动子在植物育种中的应用。
7.根据权利要求1所述的启动子在调控植物中目的基因表达中的应用。
8.一种调控植物中基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将包括目的基因和权利要求3所述的启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌导入植物细胞；优选导入植物愈伤组织；进一步优选的，所述植物愈伤组织是通过上述启动子或重组表达载体或重组农杆菌转化的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为十字花科植物，优选地，所述植物为拟南芥或油菜。
10.一种转基因植物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将包括目的基因和权利要求3所述的启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌导入植物细胞。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116200390A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-06-02 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种Ghicr24CRU_D08启动子及其应用 |
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| US20100154077A1 (en) * | 2007-04-09 | 2010-06-17 | Evogene Ltd. | Polynucleotides, polypeptides and methods for increasing oil content, growth rate and biomass of plants |
| CN104862333A (zh) * | 2007-05-03 | 2015-08-26 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
-
2021
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Patent Citations (2)
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