CN113234726A - 一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用。启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。pNtTCP9a长度为1408bp，能够驱动目的基因在烟草腺毛中特异地表达，从而避免外源基因在烟草其他组织中持续表达带来的不利影响。本发明可用于烟草腺毛高效生产次生代谢产物，或为高香气烟草品种选育提供新的调控序列。

Description

一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用。

背景技术

启动子是位于基因5'端上游的DNA序列，它能活化RNA聚合酶，启动转录的起始，也是一些反式作用因子识别与结合的一段DNA序列。启动子是调控基因表达的重要元件，很大程度上决定了基因表达的强度与特异性。根据作用方式，启动子可分为组成性启动子、诱导性启动子和组织特异性启动子3种类型。在植物基因工程研究或育种中，基因的过表达通常用花椰菜花叶病毒的35S启动子来驱动靶标基因，35S为组成性启动子，对目的基因的驱动表现在不同组织、部位的表达水平没有明显差异，因此，组成性表达启动子在驱动目的基因合成次生代谢物时，次生代谢物的异位表达可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。植物特异性启动子可驱动目的基因在特定的器官或组织部位累积，可以避免植物营养的不必要浪费，目前，组织特异性启动子已经在植物生物学研究、以及植物遗传改良等方面得到了应用。

烟草(Nicotiana tabacum L.)是一种特殊的经济作物，其腺毛分泌物主要为类西柏烷、蔗糖酯及蜡质等与烟叶香气相关的物质。以类西柏烷为例，这种由烟草腺毛特异合成的次生代谢物，约占叶面腺毛分泌物的60％，采摘后的烟叶在调制和醇化过程中，大部分类西柏烷可降解产生茄酮等多种香气物，这些物质是烟叶香气的重要来源，赋予了烟草的经济价值。由此可见，基于腺毛与烟草香气之间的关系，腺毛分泌物的含量或种类可直接影响烟叶的香气品质。此外，类西柏烷还具有治疗阿尔茨海默病、帕金森病、中风及其它神经退行性疾病的潜力，在制药领域具有巨大的潜在应用价值。因此，采用基因工程技术提高烟草叶面分泌物的产量、或高香气烟草品种的选育、或将腺毛作为生物反应器以生产人类需要的次生代谢物质，研究腺毛特异启动子对烟草育种、腺毛次生代谢物的积累和应用具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a，所述启动子pNtTCP9a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述启动子的核苷酸序列为与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同的启动子活性的序列。

进一步地，扩增所述启动子的引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种重组载体、转基因细胞、重组菌或转基因植物，包含如上述的特异性启动子pNtTCP9a。

本发明还提供了如上述的一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a在驱动靶标基因在烟草腺毛中特异表达中的应用。

进一步地，将所述特异性启动子pNtTCP9a构建至表达载体中，将重组表达载体转化至感受态细胞中，获得重组质粒，将重组质粒转化至烟草中。

进一步地，通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将重组质粒转化至烟草中。

本发明还提供了如上述的一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a在烟草育种中的应用。

进一步地，所述烟草育种包括烟草香气品质育种。

进一步地，所述烟草香气品质育种包括调控烟草腺毛分泌物的表达。

pNtTCP9a长度为1408bp，能够驱动目的基因在烟草腺毛中特异地表达，从而避免外源基因在烟草其他组织中持续表达带来的不利影响。本发明可用于烟草腺毛高效生产次生代谢产物，或为高香气烟草品种选育提供新的调控序列。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明为烟草分子育种提供了一种新方法。这种方法包括将启动子pNtTCP9a与目标基因连接后转入烟草中，通过该启动子在腺毛中驱动基因的表达，提高烟草腺毛次生代谢物的合成和积累效率。将克隆的启动子连接目标基因转入烟草，可以避免植株过量表达目标基因而造成的不利影响。

附图说明

图1是pNtTCP9a启动子PCR扩增结果图；

图2是pNtTCP9a构建到带有潮霉素抗性及GUS(β-葡萄糖醛酸酶)报告基因的质粒中；

图3是启动子pNtTCP9a顺式作用元件分析；

图4是遗传转化植株中GUS的表达模式说明pNtTCP9a驱动目的基因在烟草腺毛中特异表达。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用。本发明所涉及的植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；高保真酶2×TransStart KDPlus PCR SuperMix、无缝克隆试剂盒

-Basic Seamless Cloning and AssemblyKit、质粒提取试剂盒EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、胶回收试剂盒EasyPure QuickGel Extraction Kit购自北京全式金生物技术有限公司；烟草遗传转化及筛选相关培养基购自北京酷来搏科技有限公司；GUS染色液购自北京索莱宝科技有限公司；农杆菌GV3101、大肠杆菌DH5α、质粒pCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道获得。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1、启动子pNtTCP9a核苷酸片段的克隆

选取NtTCP9a(LOC 107820865)基因的起始密码子ATG位点上游1.5kb左右的长度作为候选启动子区域，设计特异引物进行PCR扩增，用ddH₂O将引物稀释至10μM备用。引物序列如下：

pNtTCP9a-F1:5'-accatgattacgccaTTTGTATCATTGGGTTAAAGTCACC-3'(SEQ ID NO：2)

pNtTCP9a-R1:5'-cagtgaattcccgggGTAGGACTTGTTAATTTTGTTGAT-3'(SEQ ID NO：3)

采用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书的方法，提取烟草K326的基因组DNA，采用高保真酶2×TransStart KD Plus PCRSuperMix从DNA中克隆目的片段，PCR反应体系：2×TransStart KD Plus PCR SuperMix 25μL，pNtTCP9a-F1引物1μL，pNtTCP9a-R1引物1μL，DNA模板2μL，加ddH₂O至50μL。反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，68℃90s，35循环；68℃10min。pNtTCP9a启动子PCR扩增结果如图1。

胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR产物，后用无缝克隆试剂盒

-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit将PCR产物构建到pCAMBIA1391Z植物表达载体(Hind III、BamH I双酶切，构建好的载体结构如图2所示)，将重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在抗性平板上过夜培养并挑取阳性克隆测序。经过序列比对，将测序正确的启动子序列命名为pNtTCP9a，序列信息见SEQ ID NO：1。构建好的载体即为pCAMBIA1391Z-pNtTCP9a::GUS(图2)。

采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线网站对所获得的启动子pNtTCP9a进行顺式作用元件预测(图3)，预测发现TATA框、CAAT框等启动子核心序列，以及脱落酸响应元件ABRE-motif；水杨酸响应元件TCA-element；光应答元件ACE-box、G-box、GT1-motif；分生组织表达元件CAT-box；厌氧诱导响应元件ARE-box；以及CAATTG、TAACCA等MYC、MYB转录因子结合元件。以上分析结果表明，启动子pNtTCP9a能响应多种激素及非生物胁迫的诱导。

实施例2、农杆菌介导的烟草遗传转化

1、烟草无菌苗的培养

将烟草K326种子用75％酒精消毒30s，10％H₂O₂浸泡10min，其间不断摇晃，无菌水清洗5次后吸干水分置入1/2MS培养基中，26-28℃培养，二个月后取无菌苗进行遗传转化。

2、烟草遗传转化

(1)将构建好的pCAMBIA1391Z-pNtTCP9a::GUS质粒导入农杆菌GV3101。

(2)K326无菌苗叶片切成约0.8cm×0.8cm的方块，接种到共培养基中预培养2d。

(3)取最佳对数生长期，OD₆₀₀值约为0.6的农杆菌菌液，离心收集菌体后用无菌水稀释，将叶盘置于菌液中侵染10min，取出叶片，用灭菌的滤纸吸干叶片表面的菌液，然后转移至共培养基，于25℃暗培养2d。

(4)无菌水将叶盘清洗3次，吸干水分，转移到含有相应抗生素的筛选培养基，于25℃、16h/d光照条件下筛选培养，每15-20d更换一次培养基。

(5)将长至1cm以上的抗性芽沿基部切下，转移至含有相应抗生素的1/2MS培养基，小苗生根后炼苗移栽。

注：

共培养基：MS培养基+1.5mg/L 6-BA

筛选培养基：MS培养+1.5mg/L 6-BA+10mg/L Hyg+160mg/L Timentin

生根培养基：1/2MS培养基+0.1mg/L NAA+10mg/L Hyg+160mg/L Timentin

以上培养基配制好后，将pH值调至5.8-5.9，121℃高温高压灭菌20min。

实施例3、启动子pNtTCP9a驱动腺毛细胞特异表达GUS

在T0代的阳性转基因植株中，取叶片进行GUS染色。具体操作如下：迅速将烟草叶片加入预冷的90％(v/v)丙酮固定20min，用ddH₂O冲洗丙酮，加入配制好的GUS染液并使之没过叶片，置于37℃恒温箱中过夜染色。染色后分别用50％、75％、100％乙醇将叶片脱色至溶液为无色，以排除颜色干扰，用体式显微镜观察并进行拍照。染色结果如图4所示，烟草腺毛中可见明显的蓝色(即图中黑灰色点状部分，说明GUS基因表达)，而叶片的非腺毛组织中未观察到蓝色，说明启动子pNtTCP9a能驱动靶标基因在烟草腺毛中特异表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1408

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum L.)

<400> 1

tttgtatcat tgggttaaag tcacctacaa ctaaagggat tcgtctatgt aagtttaatt 60

tgataacttc aaaaataatt aaataacttc ttcgaaccga ttataataca atgataatat 120

aaatatttct aaaaaacgtg gcttagctag ggtttgtagt gggggtacaa acactctttg 180

ggaccattta gaagaggaat ttgtagaggg cctagagggg tacgtccccc ctcctcctct 240

agtctcctag gaaggagttt ggtcttgtag ctgtaggtga ggcatagtcc tatatataga 300

tttaggtggc atttggattt ggtttaattt aagatttgat ttttgtaaaa aaaatcgatt 360

caaaatttgc tttaaaagaa agtgtttaga ctaaatatta tatgtgcata agtatctata 420

aaaaaatggt aaccgtacgt tggttggggt tgttttgtat tatcacattg gtttccaaga 480

ccaacacagg cttattaaaa ccaacttggt ttggttacaa atccaaaacg atagaaacca 540

tgcaacgagc tatgcatgat ctaagttaca agctaattga ttcacaaatt taactcgaat 600

gcttgccatt cttaatcaaa ctttagatca attggacctg tttccatcac atgaaagcac 660

taaggtccac cacctactaa ctcattacta cagtagccca acttgtgcca ctgccctact 720

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ccctaattca ggggtatgta ttctaaaaca gttccctaat cccattcaca gttaggatag 840

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tttatgggtt cctacaaaaa tctgagttaa tatacgatac taactagatg aacggactga 960

attccaagct aaatattctt atatatttaa tggatttttc aatacaaata caggttatag 1020

atcacaaaag ctactggatt cacggaacct gtagctattg aattgaatcc gcgtgctcgc 1080

gtgtataatt ttaggagtat gtttaattat gattagataa tatgtatttt ctctttcatt 1140

tgcgatttga tcttaagatt aaattacatg atttgatata aataatacgt atagaaggta 1200

cgtagaacta accccctcaa tcaacgtgtt gacatttatt ggttctaccc aaattaaaat 1260

taaagcatgg tcacactaaa gcccctcttt tggagcgcag ctatgagtaa tgagtggcgt 1320

tctatatata agcaatggaa gcagcacaaa cacatgactc catccccata gaatctatat 1380

aaacatcaac aaaattaaca agtcctac 1408

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accatgatta cgccatttgt atcattgggt taaagtcacc 40

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtgaattc ccggggtagg acttgttaat tttgttgat 39

Claims (10)

1.一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a，其特征在于：所述启动子pNtTCP9a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列为与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同的启动子活性的序列。

3.根据权利要求1所述的一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a，其特征在于：扩增所述启动子的引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

4.一种重组载体、转基因细胞、重组菌或转基因植物，其特征在于：包含如权利要求1中所述的特异性启动子pNtTCP9a。

5.如权利要求1所述的一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a在驱动靶标基因在烟草腺毛中特异表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述特异性启动子pNtTCP9a构建至表达载体中，将重组表达载体转化至感受态细胞中，获得重组质粒，将重组质粒转化至烟草中。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将重组质粒转化至烟草中。

8.如权利要求1所述的一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a在烟草育种中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述烟草育种包括烟草香气品质育种。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述烟草香气品质育种包括调控烟草腺毛分泌物的表达。

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