CN111548399A - 一种调控烟草西柏三烯二醇积累的myb转录因子、编码基因及应用 - Google Patents

一种调控烟草西柏三烯二醇积累的myb转录因子、编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子、编码基因及应用。本发明通过实时荧光定量PCR技术检测NtMYB306a的表达特性，NtMYB306a在烟草各个组织中均有表达，尤其在烟草腺毛中优势表达。在栽培烟草中过表达NtMYB306a基因，结果发现，烟草类西柏烷代谢途径中的二个关键酶基因CBT、CYP71D16表达量明显增加，NtMYB306a基因过表达株系西柏三烯二醇含量显著高于对照组，这表明NtMYB306a参与烟草类西柏烷代谢的生物合成调控，同时积累西柏三烯二醇。本发明为阐述烟草类西柏烷生物合成的分子调控机制及种质改良提供了理论依据及应用基础。

Description

一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子、编码基因及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子、编码基因及应用。
背景技术
烟草西柏三烯二醇是烟草类西柏烷合成途径的主要代谢产物。采摘的烟叶经烘烤调制后，西柏三烯二醇可降解为茄酮等与人体感官密切相关的致香物质，这些物质是烟叶香气的重要来源，赋予了烟草的经济价值；此外，据文献报道，烟草西柏三烯二醇在制药领域具有潜在的应用价值，它的生物活性使其具有治疗肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、中风以及其它神经退行性疾病的潜力，近年来受到广泛关注。因此，开展烟草类西柏烷代谢调控分子机制研究及相关功能基因鉴定，具有十分重要意义。
烟草类西柏烷代谢途径由烟草叶面的长柄分泌型腺毛特异性合成和产生，其生物合成大致分为两步：(1)西柏三烯一醇合成酶将GGPP环化形成α-和β-CBT-ol(α-和β西柏三烯一醇)；(2)西柏三烯二醇羟化酶将CBT-ol的第6位碳发生羟化反应形成α-和β-CBT-diol(α-和β-西柏三烯二醇)，西柏三烯一醇合成酶及西柏三烯二醇羟化酶分别由CBT基因和CYP71D16基因编码。
MYB类转录子是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与了植物细胞形态建成、激素信号通路、生物及非生物胁迫、次生代谢等。转录因子对靶标基因的转录激活是调控植物次生代谢的重要环节，它能与该途径中1个或1个以上关键酶基因启动子区顺式作用元件相结合，激活或抑制下游基因的转录，具有“多点调控”的优势。
因此，鉴定出调控烟草类西柏烷代谢途径的MYB转录因子、增加西柏三烯二醇等代谢物生物产量，对于阐明烟草类西柏烷生物合成分子调控机制及种质资源创新具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子、编码基因及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子，所述转录因子的氨基酸序列SEQ ID No.2所示。
如上述的调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
如上述的编码基因在调控烟草类西柏烷合成中的应用。
进一步地，所述调控烟草类西柏烷合成通过调控烟草类西柏烷代谢途径中的二个关键酶基因CBT和CYP71D16的表达实现。
进一步地，所述烟草类西柏烷包括西柏三烯二醇。
如上述的编码基因在烟草育种中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明克隆了烟草NtMYB306a转录因子编码基因，并通过农杆菌介导法在烟草中过量表达NtMYB306a。NtMYB306a过表达后同时使烟草类西柏烷合成途径中二个关键酶基因CBT、CYP71D16表达量明显增加，同时该途径产物西柏三烯二醇含量明显增加。所述NtMYB306a转录因子可为烟草的分子育种提供新的基因资源。
(2)本发明利用生物化学与分子生物学以及转基因技术手段探讨NtMYB306a转录因子编码基因及其应用，为烟草种质改良提供了理论依据及应用基础。
附图说明
图1是实施例1中NtMYB306a基因克隆PCR凝胶电泳图；
图2是实施例2中NtMYB306a基因在烟草各组织中的表达特性分析；
图3是实施例3中所用植物过表达载体pBWA(V)HS-NtMYB306a的质粒图谱；
图4是实施例4中pBWA(V)HS-NtMYB306a过表达载体遗传转化烟草后NtMYB306a的基因表达结果图；
图5是实施例4中实时荧光定量PCR检测NtMYB306a过表达后类西柏烷合成关键酶基因CBT表达图；
图6是实施例4中实时荧光定量PCR检测NtMYB306a过表达后类西柏烷合成关键酶基因CYP71D16表达图；
图7是GC-MS检测实施例4中NtMYB306a过表达后烟草西柏三烯二醇的产量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子、编码基因及应用，具体如下实施例所示。
实施例1烟草NtMYB306a基因克隆
使用常规试剂盒提取异源四倍体栽培烟草K326叶片总RNA，通过反转录合成cDNA。根据实验室建立的K326叶片腺毛转录组数据，用软件Primer primer 5.0设计特异引物并进行PCR扩增，引物序列如下：
Figure BDA0002493459340000031
以烟草腺毛cDNA为模板，扩增烟草NtMYB306a基因，PCR反应体系及反应条件如下：
PCR反应体系：Super Mix 10μL，上下游引物各10μM，cDNA 2μL，加ddH2O补至20μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；72延伸℃10min。
琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物，并连接至pEASY-Blunt Zero载体(该载体购自北京全世金生物技术有限公司，载体的使用参照说明书进行)，常规方法转化E.coli DH5α感受态，挑选阳性克隆，菌液PCR检测后测序。
注：实验所用RNA提取试剂盒、高保真PCR扩增试剂、pEASY-Blunt Zero载体均购自北京全世金生物技术有限公司；PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒购自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌DH5α由贵州省烟草科学研究院保存。
烟草NtMYB306a基因的cDNA全长为1095bp(图1)，编码364个氨基酸。NtMYB306a的基因编码序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸编码序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2烟草NtMYB306a基因的组织表达分析
2.1各个组织材料的采集
采集烟草根、茎、叶、花组织，采用冻刷法收集叶片腺毛用于不同组织的基因表达分析，样品采集后经液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用，每份样品取3个生物学重复。
2.2烟草总RNA提取及反转录成cDNA
RNA提取：采用北京全世金生物技术有限公司生产的RNA提取试剂盒，操作方法按说明书进行。
反转录成cDNA：用TAKARA宝生物工程(大连)有限公司生产的PrimeScript RTreagentKit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA。
(1)去除基因组DNA的反应：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，烟草总RNA 7μL，42℃反应2min，获得反应液I。
(2)反转录反应：(1)中的反应液I10μL，5×Primescript Buffer 4μL，RT PrimerMix 4μL，Prime Script RT Erzyme Mix I 1μL，RNase Free H2O 1μL；37℃15min，85℃5s。反应液经ddH2O稀释10倍后用于实时荧光定量PCR反应。
2.3实时荧光定量PCR
荧光定量PCR采用β-Actin为内参基因。引物序列如下表：
Figure BDA0002493459340000041
反应体系：Mix 10μL，Rox Reference Dye II 0.4μL，上下游引物各10μM，cDNA模板2μL，加ddH2O补至20μL；反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。反应结束后，用2-ΔΔCT法计算NtMYB306a基因在不同组织中的相对表达量。
注：荧光定量PCR仪为美国ABI公司生产的ViiA 7；实时荧光定量PCR试剂盒TBGreenTM Premix DimerEraserTM购自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司。
通过实时荧光定量PCR分析NtMYB306a基因的组织表达模式，结果如图2所示，NtMYB306a在3月或6月龄烟草根、茎、叶、花等组织中均有表达，其中6月龄叶片腺毛的表达量最高，相对表达量为15.39；3月龄叶及茎中的相对表达量分别为1和0.66；6月龄花及叶中的相对表达量分别为0.61和2.02；在根部表达量最少，相对表达量为0.03。结果说明NtMYB306a在烟草根、茎、叶、花中均起着一定的生物学功能，尤其在叶片腺毛中，可能发挥着更为重要的生物学功能。
实施例3农杆菌介导NtMYB306a基因遗传转化烟草
3.1烟草NtMYB306a基因植物过表达载体的构建
根据NtMYB306a的CDS序列以及植物表达载体pBWA(V)HS酶切位点的分析，设计特异引物扩增目的片段，引物序列如下表：
Figure BDA0002493459340000042
注：载体构建由武汉伯远生物科技有限公司完成
构建好的载体用Eco32I酶进行酶切验证：质粒：3μl，Eco32I：0.5μl，Buffer：1μl，H2O：5.5μl，37℃酶切2小时后电泳，酶切片段大小为175bp，1134bp，1521bp，2691bp，5324bp，表明NtMYB306a基因的过表达植物载体构建成功。构建好的NtMYB306a过表达植物载体命名为pBWA(V)HS-NtMYB306a(图3)。
3.2pBWA(V)HS-NtMYB306a遗传转化烟草
(a)无菌苗培养：选取饱满的烟草种子，置于灭菌的1.5ml离心管中，用75％的乙醇消毒1min弃掉乙醇，10％的H2O2消毒10min，弃掉H2O2，无菌水冲洗5次后吸干种子表面水份，播种至MS培养基上，28℃培养60天左右作为遗传转化用的无菌苗。
(b)预培养：用镊子将无菌苗叶片夹取并放置到无菌滤纸上，切成0.5cm2的叶盘，正面朝下置于预培养基上，28℃培养3天。(预培养基配方：MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.1mg/L，pH5.8)
(c)农杆菌的摇菌与活化：在YEP固体平板(含50mg/L卡那霉素，25mg/L利福平)上挑取农杆菌单菌落，置于相应抗生素的YEP液体培养基，于28℃，180r/min摇床培养约12h，吸取50μl菌液于50mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素，25mg/L利福平)中，于28℃，180r/min摇床培养约12h，使菌液OD600在0.5-0.7之间。
(d)侵染：取50ml菌液于8000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，加入50ml液体MS培养基重悬菌体，将预培养的外植体浸入农杆菌菌液中浸泡15min。用灭菌滤纸吸干菌液，转到MS共培养基上，黑暗条件下28℃共培养2天。(共培养基配方：MS+6-BA 1.5mg/L+IAA0.1mg/L，pH5.8)
(e)分化筛选培养：将叶盘转到分化筛选培养基上培养，2周左右更换一次培养基。(分化筛选培养基配方：MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.1mg/L+Timentin 160mg/L+Hyg 10mg/L，pH5.8)
(f)生根培养：待分化出小芽约2-3cm时，用手术刀切下置于生根培养基中生根培养。待再生植株根系发育良好后，炼苗移栽。(生根培养基配方：1/2MS+NAA 0.1mg/L+Timentin160mg/L+Hyg 10mg/L，pH5.8)
3.3NtMYB306a过表达植株分子鉴定
采集上述移栽成活的小苗叶片，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取烟草基因组DNA，利用PCR方法检测NtMYB306a过表达的植株。20μL PCR反应体系：Mix 10μL，上下游引物各10μM，DNA 2μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；72延伸℃10min。扩增出的大小为444bp的条带即为NtMYB306a基因过表达的植株。PCR检测引物如下表：
Figure BDA0002493459340000061
注：植物基因组DNA提取试剂盒购自AXYGEN，PCR检测试剂购自TAKARA。
实施例4在烟草中过表达NtMYB306a对西柏三烯二醇积累的影响
4.1转基因植株中NtMYB306a基因的表达量分析
取野生型和T0代转基因植株叶片(6月龄)，采用实时荧光定量PCR方法对NtMYB306a基因的相对表达量进行分析，RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例2。
荧光定量PCR所用内参基因为β-Actin，引物序列参照实施例2；
荧光定量PCR目的基因NtMYB306a引物序列MYB306-Q-F1和MYB306-Q-R1同实施例2。
结果如图4所示，其中1和2是非转基因对照植株，OE-1、OE-5、OE-29分别是NtMYB306a过表达的转基因植株，可以看出，过表达NtMYB306a的植株，NtMYB306a基因的表达量明显上升。
4.2类西柏烷合成途径关键酶基因的表达量分析
取4.1中的植株，采用实时荧光定量PCR方法分别对烟草类西柏烷合成途径关键酶基因CBT、CYP71D16的相对表达量进行分析。RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例2。
荧光定量PCR所用内参基因为β-Actin，引物序列参照实施例2；
荧光定量PCR目的基因CBT、CYP71D16引物序列如下表：
Figure BDA0002493459340000062
结果如图5、图6所示，可以看出，NtMYB306a基因的过表达，明显提高了烟草类西柏烷合成途径中CBT和CYP71D16关键酶基因的表达量，说明NtMYB306a作为转录因子，可同时调控二个关键酶基因的表达，并使二个基因的表达量增加。
4.3GC-MS测定西柏三烯二醇含量
取4.1中的植株鲜烟叶冻干粉末20mg于2mL离心管中，加入1.5mL内标萃取液(含内标十七烷醇2.26mg·L-1)，涡旋6s后室温超声提取60min；将提取液静置，并于12000rpm下离心12min；取800μL上清液至1.5mL样品瓶中，用氮气吹干；加入200μL衍生化试剂(BSTFA/DMF，体积比1∶1)，70℃下反应60min；进样分析。
气质条件：色谱柱HP-5MS 30m*0.25mm*0.25μm；进样口：270℃，分流比20:1，解析3min；载气为氦气，流速恒定为1.2mL/min；将柱温从50℃的初始温度(保持1分钟)，以10℃/分钟的速度上升至240℃，然后再以2℃/分钟的速度上升至280℃(保持2分钟)；后运行290℃(保持3min)。质谱条件：传输线温度250℃，离子源温度200℃。电离模式：EI 70eV，质量范围：45-500m/z。定量方法：内标相对含量法(内标物：十七烷醇)。
图7为NtMYB306a基因过表达后叶片中西柏三烯二醇的含量，可以看出NtMYB306a基因构建到植物表达载体，遗传转化烟草后，NtMYB306a基因过表达植株中α-和β-CBT-diol(α-和β-西柏三烯二醇)的含量显著增加：对照1及对照2的α-CBT-diol含量分别为443.16、476.12mg/kg DW，OE-1、OE-5、OE-29的α-CBT-diol含量分别为2283.13、2449.49、1572.84mg/kg DW；对照1及对照2的β-CBT-diol含量分别为242.00、258.92mg/kg DW，OE-1、OE-5、OE-29的β-CBT-diol含量分别为868.40、1027.22、704.32mg/kg DW；)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州省烟草科学研究院
<120> 一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子、编码基因及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 核苷酸序列(NtMYB306a)
<400> 1
atgggaaggc caccttgctg tgaaaaaact ggggttaaga aaggaccatg gacgccagaa 60
gaagatatca ttttggtttc atatattcaa gaacatggtc ctggaaactg gagagctgtt 120
cccactaata ctggtttgct aagatgcagc aaaagttgta gactgcgatg gactaattat 180
cttcgtccgg ggattaaacg tggaaatttc acagaacatg aagagaagat gattattcac 240
ctccaagctc ttcttgggaa tagatgggca gccatagctt cataccttcc acaaagaaca 300
gacaatgata taaagaatta ctggaatact catttgaaaa agaagcttaa caagaaactt 360
gaaggccatg atcaagaggg aaaatcatca tcatcttcat catctcaatc aaaaatctca 420
aaaggacaat gggaaaaaag gcttcaaaca gacattcaca tggctaaaca agctctttgt 480
gaagctttgt cacttgacat tccttcaact ggcgattctc caaataataa taataattcc 540
actcctaatc ttcctgtgca agaaccagtc caaacatcta ctacctatgc atccagtgct 600
gaaaatattg ctaagttgct tcaaaattgg atgaaaaatt cacctaaatc atcttctcaa 660
tgtcgatcta gttcaaaaac gactcaaatg tcgtccttca actttccatc aatcggtgct 720
gtttcgagtt ctagccctag cgaaggaaca ataaataatg caactacaca agaaggtttg 780
gactcgctct ttcattttaa ctcatcaaat aattcggatg tgtcacaatc catgtcggtc 840
gatgagggtg gtaattttac acctgagaat aataatgctg caattttcca agttgaaagc 900
aagcaaaatt tgcctaatta taatttcaag gcagaaatca atggaagttt tcatcaagag 960
gagagcaagc caaatttgga gacacaagtg cctttaacat ttttggaaaa gtggctgctt 1020
gatgataata ctaatgcaca agcacaagaa gagctaatgg gaatggcctt aagtgaaact 1080
gcagatttgt tttga 1095
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(NtMYB306a)
<400> 2
Met Gly Ala Pro Pro Cys Cys Gly Leu Thr Gly Val Leu Leu Gly Pro
1 5 10 15
Thr Thr Pro Gly Gly Ala Ile Ile Leu Val Ser Thr Ile Gly Gly His
20 25 30
Gly Pro Gly Ala Thr Ala Ala Val Pro Thr Ala Thr Gly Leu Leu Ala
35 40 45
Cys Ser Leu Ser Cys Ala Leu Ala Thr Thr Ala Thr Leu Ala Pro Gly
50 55 60
Ile Leu Ala Gly Ala Pro Thr Gly His Gly Gly Leu Met Ile Ile His
65 70 75 80
Leu Gly Ala Leu Leu Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Thr Leu
85 90 95
Pro Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ile Leu Ala Thr Thr Ala Thr His Leu
100 105 110
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Gly His Ala Gly Gly Gly Leu
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu Ile Ser Leu Gly Gly Thr
130 135 140
Gly Leu Ala Leu Gly Thr Ala Ile His Met Ala Leu Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Gly Ala Leu Ser Leu Ala Ile Pro Ser Thr Gly Ala Ser Pro Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ser Thr Pro Ala Leu Pro Val Gly Gly Pro Val Gly Thr
180 185 190
Ser Thr Thr Thr Ala Ser Ser Ala Gly Ala Ile Ala Leu Leu Leu Gly
195 200 205
Ala Thr Met Leu Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ser Gly Cys Ala Ser Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Thr Gly Met Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ser Ile Gly Ala
225 230 235 240
Val Ser Ser Ser Ser Pro Ser Gly Gly Thr Ile Ala Ala Ala Thr Thr
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Ala Ser Leu Pro His Pro Ala Ser Ser Ala Ala Ser
260 265 270
Ala Val Ser Gly Ser Met Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Pro Thr Pro
275 280 285
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ile Pro Gly Val Gly Ser Leu Gly Ala Leu
290 295 300
Pro Ala Thr Ala Pro Leu Ala Gly Ile Ala Gly Ser Pro His Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Leu Pro Ala Leu Gly Thr Gly Val Pro Leu Thr Pro Leu Gly
325 330 335
Leu Thr Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Leu
340 345 350
Met Gly Met Ala Leu Ser Gly Thr Ala Ala Leu Pro
355 360

Claims (6)

1.一种调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子，其特征在于：所述转录因子的氨基酸序列SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的调控烟草西柏三烯二醇积累的MYB转录因子的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求2所述的编码基因在调控烟草类西柏烷合成中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述调控烟草类西柏烷合成通过调控烟草类西柏烷代谢途径中的二个关键酶基因CBT和CYP71D16的表达实现。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述烟草类西柏烷包括西柏三烯二醇。
6.如权利要求2所述的编码基因在烟草育种中的应用。
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