CN112626132A - 西柏烷二萜的微生物生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物合成技术领域。针对现有的西柏烷二萜化学合成方法工艺复杂、污染环境，烟草直接提取资源有限、产率低，以及共同存在的目标产物得率低、成本高等问题，本发明提供一种西柏烷二萜的微生物生产方法，通过构建两种关键酶基因的酵母表达载体，转化到酿酒酵母中，通过发酵提取，最终获得西柏烷二萜。本发明有效地避免了化学合成工艺复杂、污染环境、目标产物得率低，以及直接从植物中提取西柏烷二萜效率低，纯化步骤繁琐，需要消耗大量的人力物力等问题。本发明具有专一性强、生长周期短、反应条件温和、副产物少等优点。

Description

西柏烷二萜的微生物生产方法
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种西柏烷二萜的微生物生产方法。
背景技术
西柏烷是在自然界中广泛存在的一类天然二萜化合物，首次报道的西柏烷类化合物是在松树树干分泌的树脂中发现的。烟草是西柏烷含量最丰富的陆生植物，西柏烷二萜主要分布于烟草植物叶片表面腺毛以及烟花分泌物中。烟草中最主要的两种西柏烷二萜是西柏三烯一醇和西柏三烯二醇，这两种西柏烷二萜有α-和β-两种异构体。西柏烷二萜类具有抗菌、抗癌、抗炎、神经保护等一系列生物活性，使其在食品、化妆品、保健品、植物源农药制剂以及医药领域广泛应用。
西柏烷二萜在植物体内的含量并不高，直接从植物中提取西柏烷二萜效率低，纯化步骤繁琐，需要消耗大量的人力物力，也只能提取到西柏烷二萜粗提样品。而化学合成西柏烷二萜具有合成工艺复杂、成本高、毒性大、产率低等缺陷，难以实现工业化生产。
发明内容
针对现有的西柏烷二萜化学合成方法工艺复杂、污染环境，烟草直接提取资源有限、产率低，以及共同存在的目标产物得率低、成本高等问题，本发明提供一种西柏烷二萜的微生物生产方法，通过构建两种关键酶基因的酵母表达载体，转化到酿酒酵母中，通过发酵提取，最终获得西柏烷二萜。
本发明是通过以下技术方案实现的：
西柏烷二萜的微生物生产方法，包括以下步骤：
(1)微生物表达载体构建：以含有西柏烷合成酶基因CBTS1的pUC18-Cemb2-1质粒为模板，利用特异性引物通过PCR扩增出CBTS1片段，将扩增出的CBTS1基因片段和通过分子修饰添加了翻译引导肽(GD)的pGAD载体分别用限制性核酸内切酶进行双酶切2h，回收纯化的载体和片段，通过酶切链接以及转化DH5α获得微生物表达载体；
或者，以含有细胞色素加氧酶CYP450基因的pUC18-Cemb2质粒为模板，利用特异性引物通过PCR扩增出CYP450片段，将扩增出的CYP450基因片段和通过分子修饰添加了翻译引导肽(GD)的pGBK载体分别用限制性核酸内切酶进行双酶切2h，回收纯化的载体和片段，通过酶切链接以及转化DH5α获得微生物表达载体；
(2)宿主菌株的选择：选用GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)产量较高的BY-T20酿酒酵母，其基因型为：
BY-T20(MATα-trp1Δ0-leu2Δ0-ura3Δ0,trp1::HIS3-PPGK1-BTS1/ERG20-TADH1-PTDH3-SaGGPS- TTPI1-PTEF1-tHMG1-TCYC1)；
(3)制备微生物感受态：挑取酿酒酵母BY-T20单菌于YPDA培养基活化并逐级扩大培养，得到纯而壮的种子，离心、收集菌体于离心管中，用ddH2O洗涤，离心，最后用1×TE/LiAc 重悬菌落；
(4)外源基因共转化微生物感受态：采用LiAc/PEG carrier DNA多质粒转化法将带有 CBTS1基因的载体以及带有CYP450基因的载体以不同组合形式，分别共转化到氨基酸缺陷型微生物菌株中，转化后将菌液涂布在营养缺陷培养基SD/-Leu/-Trp上，30℃培养2-3d，获得重组微生物菌株；
(5)重组微生物菌株发酵：挑取重组菌株单菌落接种于SD/-Trp/-Leu营养缺陷液体培养基中，先用30℃，220r/min预培养48h作为种子液，将种子液按照5％的比例接种于YPDA 液体培养基进行摇瓶发酵，在30℃，220r/min条件下培养72h；
(6)微生物工程菌产物提取：摇瓶发酵结束后，将发酵液离心，分离上清发酵液和菌体；上清发酵液用等体积的乙酸乙酯充分萃取，离心，吸取上层有机相，根据需要可多次萃取，合并提取物；利用液氮将离心后的菌体进行研磨，研磨粉末溶于20mL ddH2O中，采用超声波细胞破碎仪将酵母充分破壁20min，在加入等体积的乙酸乙酯萃取，静置30min，离心，吸取上层有机相；采用旋转蒸发仪分别从上清液和菌体提取物中蒸馏出乙酸乙酯。
进一步的，所述步骤(3)挑取酿酒酵母BY-T20单菌落于5mL YPDA培养基中，220rpm/30℃过夜，将摇好的菌液加入到50mL YPDA培养基中，220rpm/30℃摇6h；3000rm 离心5min，收集菌体与1.5mL离心管中，用1mL ddH2O洗涤2次，3000rpm/5min离心，最后用1mL1×TE/LiAc重悬菌落。
进一步的，所述步骤(6)微生物工程菌产物提取：上清发酵液用等体积的乙酸乙酯，30℃， 220r/min充分萃取30min，离心，吸取上层有机相，抽提2次，合并提取物。
引导肽GD编码序列：
ATGGACAACTTCAACCAGTCTGGTAACATCGCGGACTCTTCTCTGTCTTTCACCTTCACCAACTCTTCTAACGGTCCGAACCTGATCACCACCCAGACCAACTCTCAGGCGCTGTCTCAGCCGATCGCGTCTTCTA ACGTTCACGACAACTTCATGAACAACGAAATCACCGCGTCTAAAATCGACGACGGTAACAACTCTAA ACCGCTGTCTCCGGGTTGGACCGACCAGACCGCGTACAACGCGTTCGGTATCACCACCGGTATGTTCA ACACCACCACCATGGACGACGTTTACAACTACCTGTTCGACGACGAAGACACCCCGCCGAACCCGAA AAAAGAA
CBTS1基因序列：
ATGTCTCAATCTATTTCTCCTCTTATTTGTTCACATTTTGCTAAGTTTCAATCTAATATTTGGAGGTGTAA TACTTCACAACTTAGAGTTATTCATTCTTCTTATGCTTCTTTTGGAGGTAGAAGAAAGGAAAGGGTTAG AAGGATGAATAGAGCTATGGATCTTTCTTCTTCTTCAAGGCACTTAGCTGATTTTCCTTCTACAATTTGG GGAGATCATTTTCTATCATATAATTCTGAAATTACTGAAATAACTACTCAAGAAAAGAATGAGCATGAA ATGCTTAAGGAAATTGTTAGAAAGATGCTTGTTGAAACACCTGATAATAGTACACAAAAACTTGTTTT GATTGATACAATTCAAAGACTTGGTTTGGCTTATCATTTTAATGATGAGATTGAAAATTCAATTCAAAAT ATTTTTAATTTGTCACAAAATAGTGAGGATGATGATGAGCATAACCTTTATGTTGCTGCATTGAGGTTTA GACTTGCTAGACAGCAAGGTTATTACATGAGTTCTGATGTTTTTAAACAATTCACTAATCATGATGGAA AGTTCAAAGAAAATCACACTAATGATGTGCAAGGACTTCTTTCTCTTTATGAAGCTGCACATATGAGA GTTCATGATGAAGAAATTCTTGAAGAAGCTCTGATTTTTACTACTACACATCTTGAAAGTGTTATTCCA AACCTTAGTAATTCATTGAAAGTTCAAGTGACTGAAGCTTTGAGTCATCCAATTAGAAAAGCAATTCC AAGAGTTGGAGCTAGAAAGTATATTCATATCTATGAAAATATTGGTACTCATAATGATTTGTTATTGAAA TTTGCTAAGCTTGATTTTAATATGTTGCAAAAACTTCATAGAAAGGAACTTAACGAACTTACATCTTGG TGGAAGGATCTTGATAGAGCTAACAAATTTCCTTATGCTAAAGATAGGTTGGTTGAAGCATATTTTTGG ACTGTTGGTATCTATTTTGAACCACAGTATTCTCGTAGTAGGTCACTTGTTACTAAAGTTGTGAAGATG AATTCTATTATCGATGATACATATGATGCTTACGCAACTTTTGATGAATTAGTTCTTTTCACTGATGCTAT TCAAAGGTGGGATGAAGGAGCTATGGATTTGCTTCCAACTTATTTGAGACCAATCTACCAAGGATTGC TTGATGTTTTTAATGAGATGGAAGAAGTTTTAGCTAAAGAGGGTAAAGCTGATCATATATATTATGCTAA GAAAGAGATGAAAAAAGTTGCTGAAGTTTACTTTAAGGAAGCTGAATGGCTTAATGCTAATTATATTC CAAAGTGTGAAGAATATATGAAGAACGGATTAGTTTCCTCAACTGGTCCTATGTACGGTATTATTTCCC TTGTTGTGATGGAAGAGATTATTACTAAAGAAGCATTTGAATGGCTTACTAATGAGCCACTTATCCTTA GGGCTGCTTCAACAATTTGTAGATTGATGGATGATATGGCTGATCATGAGGTTGAGCAACAAAGAGGT CATGTTGCATCATTTGTTGAATGTTATATGAAAGAATATGGAGTTTCTAAACAAGAAGCATATGTTGAA ATGAGGAAAAAGATTACTAATGCTTGGAAAGATATTAATAAGGAACTTTTGAGACCAACAGCTGTTCC AATGTTTATTCTTGAAAGATCATTGAATTTTAGTAGATTGGCTGATACATTTCTTAAGGATGATGATGGT TATACTAATCCTAAGTCTAAGGTTAAAGATCTTATTGCATCTTTGTTTGTTGAATCTGTTGATATATGA
CYP450基因序列：
ATGCAATTCTTTAATTTCTTTTCATTGTTTCTTTTTGTTTCATTTTTGTTTCTTTTTAAAAAGTGGAAAAATT CTAATTCTCAAACTAAGAGATTGCCACCAGGACCATGGAAGCTTCCAATTCTTGGTAGTATGCTTCATATGCTTGGAGGATTGCCACATCATGTTCTTAGAGATCTTGCTAAGAAGTATGGACCTATTATGCATTTGCAGTT GGGTGAGGTTTCTTTGGTTGTTATTTCTTCTCCAGGAATGGCTAAAGAGGTTTTGAAAACTCATGATCTTG CTTTTGCTAATAGACCACTTCTTGTGGCTGCTAAGATTTTTAGCTATAATTGTATGGATATTGCTCTTTCAC CATATGGTAATTATTGGAGACAAATGAGAAAAATTTGTTTGCTTGAACTTCTTTCTGCTAAAAATGTTAAG TCTTTTAATTCTATAAGACAGGATGAGGTTCATAGAATGATTAAGTTCTTTAGGTCATCTCCAGGTAAACC AGTTAACGTTACTAAAAGAATTTCTCTTTTTACAAATTCAATGACTTGTAGATCTGCTTTTGGTCAAGAAT ATAAGGAACAAGATGAATTTGTTCAACTTGTTAAAAAAGTTTCTAATTTGATTGAAGGATTTGATGTAGCT GATATTTTTCCATCATTGAAATTTTTGCATGTTTTGACTGGTATGAAGGCTAAAGTGATGAATACTCATAA TGAGCTTGATGCTATTCTTGAAAATATTATTAATGAGCATAAGAAGACATCTAAATCAGATGGAGAATCT GGAGGTGAAGGTATTATAGGAGTTTTATTAAGATTGATGAAAGAAGGAGGACTTCAATTTCCAATTACTA ATGATAATATTAAGGCTATTATTTCAGATATTTTTGGTGGTGGTACTGAGACTTCTTCTACAACTATTAATT GGGCTATGGTTGAAATGATGAAAAATCCTTCTGTTTTTAGTAAAGCTCAGGCTGAAGTTAGAGAAATTCTT AGAGGTAAAGAAACTTTTGGTGAAATTGATGTTGAAGAGTTTAAATATCTTAAAATGGTTATTAAAGAAA CTTTTAGATTACATCCTCCTTTACCTCTTCTTCTTCCTAGAGAATGTAGAGAAGAAATTGATCTTAATGGTT ATACAATTCCACTTAAGACAAAGGTTGTTGTTAATGCTTGGGCTATGGGTAGAGATCCTAAGTATTGGGA TGATGTTGAATCTTTTAAGCCAGAAAGATTTGAACATAATTCTATGGATTATATAGGTAATAACTATGAAT ATCTTCCATTTGGTTCTGGTAGGAGGATTTGTCCAGGTATTTCTTTTGGACTTGCTAATGTTTATTTTCCTTT GGCTCAACTTCTTAATCATTTTGATTGGAAGCTTCCAACAGGAATTAATCCTAGAAATTGTGATTTGACAG AAGCTGCAGGTGCTGCTTGTGCTAGAAAGAATGATTTGCATTTGATAGCTACTGCATATCAACATTGTGAAGAATAA
有益效果：
本发明通过构建西柏烷二萜合成途径中两种关键酶基因的酵母表达载体，并通过不同形式转化微生物菌株，不影响其本身存在的代谢途径。通过对重组菌株发酵条件优化以及合适的提取方法，最终鉴定出重组菌株能够产出西柏烷二萜类化合物。本发明有效地避免了化学合成工艺复杂、污染环境、目标产物得率低，以及直接从植物中提取西柏烷二萜效率低，纯化步骤繁琐，需要消耗大量的人力物力等问题。本发明具有专一性强、生长周期短、反应条件温和、副产物少等优点。
附图说明
图1实施例1重组酿酒酵母发酵提取产物高效液相色谱图；注：A图为CBT-ol标准品，B 图为BY-T20-CA菌株发酵提取物；
图2实施例2重组酿酒酵母发酵提取产物高效液相色谱图；注：A图为CBT-ol标准品， B图为BY-T20-CA菌株发酵提取物。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
构建酵母表达载体pGAD-CBTS1：以含有西柏烷合成酶基因CBTS1的pUC18-Cemb2-1为模板，引物对为：
CBTS1-5：AAACCATGGTGTCTCAATCTATTTCTC
CBTS1-3：AAATCTAGATTATCATATATCAACAGATT
将pGAD-T7载体进行分子修饰，获得在启动子下游添加了翻译引导肽(GD)的修饰载体pGAD。
通过PCR扩增出西柏三烯合酶(CBTS1)片段，将扩增出的CBTS1片段和通过分子修饰添加了翻译引导肽(GD)的pGAD载体分别用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SmalⅠ进行双酶切2h，回收纯化的载体和片段，通过酶切链接以及转化DH5α获得酵母表达载体 pGAD-CBTS1。
宿主菌株的选择，选用GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)产量较高的BY-T20酿酒酵母，其基因型为：
BY-T20(MATα-trp1Δ0-leu2Δ0-ura3Δ0,trp1::HIS3-PPGK1-BTS1/ERG20-TADH1-PTDH3-SaGGPS- TTPI1-PTEF1-tHMG1-TCYC1)。(信息来源：Metabolic Engineering 60(2020)87-96)。
外源基因共转化酿酒酵母感受态：采用LiAc/PEG carrier DNA多质粒转化法将pGAD-CBTS1载体与pGBK空载体组合，共转化到氨基酸缺陷型酿酒酵母BY-T20菌株中，转化后将菌液涂布在营养缺陷培养基SD/-Leu/-Trp上，30℃培养2-3d，获得重组酵母 BY-T20-CA。
重组酿酒酵母发酵：挑取酵母重组菌株单菌落接种于5mL SD/-Trp/-Leu营养缺陷液体培养基中，先用30℃，220r/min预培养48h作为种子液。将种子液按照5％的比例接种于YPDA 液体培养基进行摇瓶发酵，在30℃，220r/min条件下培养72h。
酿酒酵母工程菌产物提取与检测：摇瓶发酵结束后，将发酵液离心，分离上清发酵液和菌体。上清发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，30℃，220r/min充分萃取30min，离心，吸取上层有机相，抽提2次，合并提取物。利用液氮将离心后的菌体进行研磨，研磨粉末溶于20mL ddH2O中，采用超声波细胞破碎仪将酵母充分破壁20min，在加入等体积的乙酸乙酯萃取，静置30min，离心，吸取上层有机相。采用旋转蒸发仪分别从上清液和菌体提取物中蒸馏出乙酸乙酯，分别用1mL乙酸乙酯和70％乙腈溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后，通过HPLC 进行检测鉴定，结果如图1所示，通过标曲计算生产西柏三烯一醇最终浓度为123.428mg/L。
实施例2
宿主菌株的选择，选用BY-T20酿酒酵母，基因结构为：
BY-T20(MATα-trp1Δ0-leu2Δ0-ura3Δ0,trp1::HIS3-PPGK1-BTS1/ERG20-TADH1-PTDH3-SaGGPS- TTPI1-PTEF1-tHMG1-TCYC1)。
构建pGBK-CYP450酵母表达载体：以含有细胞色素加氧酶CYP450基因的pUC18-Cemb2 为模板，通过引物对
CYP450-5：AAAGAATTCATGCAATTCTTTAATTTCTTT
CYP450-3：AAAGGATCCTTATTCTTCACAATGTTGAT
将pGBK-T7载体进行分子修饰，获得在启动子下游添加了翻译引导肽(GD)的修饰载体pGBK。
通过PCR扩增出细胞色素加氧酶CYP450片段，将扩增出的CYP450片段和通过分子修饰添加了翻译引导肽(GD)的pGBK载体分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切2h，回收纯化的载体和片段。通过酶切链接以及转化DH5α获得酵母表达载体pGBK-CYP450。
外源基因共转化酿酒酵母感受态：采用LiAc/PEG carrier DNA多质粒转化法将pGAD-CBTS1载体与pGBK-CYP450载体组合，共转化到氨基酸缺陷型酿酒酵母BY-T20菌株中，转化后将菌液涂布在营养缺陷培养基SD/-Leu/-Trp上，30℃培养2-3d，获得重组酵母 BY-T20-CAPB。
重组酿酒酵母发酵：挑取酵母重组菌株单菌落接种于5mL SD/-Trp/-Leu营养缺陷液体培养基中，先用30℃，220r/min预培养48h作为种子液。将种子液按照5％的比例接种于YPDA 液体培养基进行摇瓶发酵，在30℃，220r/min条件下培养72h。
酿酒酵母工程菌产物提取与检测：摇瓶发酵结束后，将发酵液离心，分离上清发酵液和菌体。上清发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，30℃，220r/min充分萃取30min，离心，吸取上层有机相，抽提2次，合并提取物。利用液氮将离心后的菌体进行研磨，研磨粉末溶于20mL ddH2O中，采用超声波细胞破碎仪将酵母充分破壁20min，在加入等体积的乙酸乙酯萃取，静置30min，离心，吸取上层有机相。采用旋转蒸发仪分别从上清液和菌体提取物中蒸馏出乙酸乙酯，分别用1mL乙酸乙酯和70％乙腈溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后，通过HPLC 进行检测鉴定，结果如图2所示，通过标曲计算生产西柏三烯二醇最终浓度为88.5mg/L。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.西柏烷二萜的微生物生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)微生物表达载体构建：以含有西柏烷合成酶基因CBTS1的pUC18-Cemb2-1质粒为模板，利用特异性引物通过PCR扩增出CBTS1片段，将扩增出的CBTS1基因片段和通过分子修饰添加了翻译引导肽GD的pGAD载体分别用限制性核酸内切酶进行双酶切2h，回收纯化的载体和片段，通过酶切链接以及转化DH5α获得微生物表达载体；
或者，以含有细胞色素加氧酶CYP450基因的pUC18-Cemb2质粒为模板，利用特异性引物通过PCR扩增出CYP450片段，将扩增出的CYP450基因片段和通过分子修饰添加了翻译引导肽GD的pGBK载体分别用限制性核酸内切酶进行双酶切2h，回收纯化的载体和片段，通过酶切链接以及转化DH5α获得微生物表达载体；
(2)宿主菌株选择：选用BY-T20酿酒酵母做为西柏烷合成酶表达载体的宿主菌；
(3)制备微生物感受态：挑取酿酒酵母BY-T20单菌于YPDA培养基活化并逐级扩大培养，得到纯而壮的种子，离心、收集菌体于离心管中，用ddH2O洗涤，离心，最后用1×TE/LiAc重悬菌落；
(4)外源基因共转化微生物感受态：采用LiAc/PEG carrier DNA多质粒转化法将带有CBTS1基因的载体以及带有CYP450基因的载体，分别共转化到氨基酸缺陷型微生物菌株中，转化后将菌液涂布在营养缺陷培养基SD/-Leu/-Trp上，30℃培养2-3d，获得重组微生物菌株；
(5)重组微生物菌株发酵：挑取重组菌株单菌落接种于SD/-Trp/-Leu营养缺陷液体培养基中，先用30℃，220r/min预培养48h作为种子液，将种子液按照5％的比例接种于YPDA液体培养基进行摇瓶发酵，在30℃，220r/min条件下培养72h；
(6)微生物工程菌产物提取：摇瓶发酵结束后，将发酵液离心，分离上清发酵液和菌体；上清发酵液用等体积的乙酸乙酯充分萃取，离心，吸取上层有机相，根据需要可多次萃取，合并提取物；利用液氮将离心后的菌体进行研磨，研磨粉末溶于20mL ddH2O中，采用超声波细胞破碎仪将酵母充分破壁20min，在加入等体积的乙酸乙酯萃取，静置30min，离心，吸取上层有机相；采用旋转蒸发仪分别从上清液和菌体提取物中蒸馏出乙酸乙酯，得到目标产物。
2.根据权利要求1所述的西柏烷二萜的微生物生产方法，其特征在于，所述步骤(3)挑取酿酒酵母BY-T20单菌落于5mL YPDA培养基中，220rpm/30℃过夜，将摇好的菌液加入到50mL YPDA培养基中，220rpm/30℃摇6h；3000rm离心5min，收集菌体与1.5mL离心管中，用1mL ddH2O洗涤2次，3000rpm/5min离心，最后用1mL 1×TE/LiAc重悬菌落。
3.根据权利要求1所述的西柏烷二萜的微生物生产方法，其特征在于，所述步骤(6)微生物工程菌产物提取：上清发酵液用等体积的乙酸乙酯，30℃，220r/min充分萃取30min，离心，吸取上层有机相，抽提2次，合并提取物。
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