CN107142219B - 一株产三萜类化合物的滴孔菌及其应用 - Google Patents

一株产三萜类化合物的滴孔菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产三萜类化合物的滴孔菌，该菌株名为滴孔菌(Piptoporus sp.)A‑9，菌株已于2017年5月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.13895。本发明还公开了所述滴孔菌在制备三萜类化合物中的应用。实验证实利用本发明所述滴孔菌发酵生产三萜类化合物的产量最高可达2.1g/L以上，其为液体发酵生产三萜类化合物探索了新的方向与途径，具有较高的应用价值，工业化应用前景广阔。

Description

一株产三萜类化合物的滴孔菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产三萜类化合物的滴孔菌及其在制备三萜化合物中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，食药用高等真菌越来越受到广泛关注，不仅因为它具有极高的营养价值，更重要的是其能够产生具有各种生物活性的次级代谢产物。高等真菌次级代谢产物中，药理作用研究较清楚的是三萜类化合物，近年的研究表明，三萜类化合物具有抗肿瘤、抗艾滋病病毒HIV-1、解毒保肝、抗菌和抑制前列腺增生等功能。
目前对三萜类化合物产生菌的研究主要集中在灵芝菌科Ganodermatoideae和多孔菌科Polyporaceae。由于高等真菌的子实体培养周期较长，三萜的产量受外界因素影响较大，因此，从子实体中提取三萜酸成分具有较大的局限性。通过液体深层发酵技术生产三萜类化合物具有生产周期短、不受季节影响、可以大批量生产、三萜类化合物含量相对稳定，适合工厂化生产等特点，有望成为生产三萜类化合物的主要方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株可产三萜类化合物的滴孔菌菌株及其在制备三萜类化合物中的应用。利用本发明所述菌株可以产生三萜类化合物，实现通过微生物液体发酵法获得以三萜类化合物为主要目的产物的愿望。
本发明所述产三萜类化合物的滴孔菌A-9属于多孔菌科滴孔菌属，其特征在于：该菌株名为滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9，菌株已于2017年5月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.13895。
上述产γ-癸内酯及三萜类化合物的滴孔菌A-9是一株发明人自主野外采摘分离纯化得到的滴孔菌，其生物学特征是：子实体无柄，呈现半圆形，大小约20×15cm，单片菌盖厚度约0.5-1.5cm，菌盖覆瓦状排列。子实体正面呈现淡黄色至橙色，边缘颜色较深，呈现波浪状或瓣状，较圆滑，子实体背面呈现白色，边缘黄色，布满菌孔。菌丝系统二体型，具有生殖菌丝和骨架菌丝。生殖菌丝具有担子菌菌丝的显著特点，即锁状联合。同时该菌生殖菌丝还具有简单隔膜，但是简单隔膜的数量较少，且往往出现于菌丝的前端。生殖菌丝的直径从2-3μm到5-7μm不等。
对本发明所述产三萜类化合物的滴孔菌A-9CGMCC N0.13895测定18S rRNA 以及ITS的基因序列的结果显示，其18S rDNA序列长度为1679bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其ITS序列片段大小为727bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过形态观察和18SrRNA以及ITS的基因序列比对，初步鉴定为Piptoporus sp.。
本发明所述产三萜类化合物的滴孔菌A-9菌种选育的基本方法是：
菌种系采自于野外的担子菌子实体。将新鲜的子实体以无菌手术刀切开，用眼科镊子撕取少许菌肉接种于PDA平板，30℃培养。待菌丝垫直径达2-3厘米时，从菌丝边缘挑取少许菌丝接种于新的PDA平板，经反复多次转接，直至分离得到纯菌种。将该菌株命名为滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9，该菌株已于2017年5月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.13895。
本发明所述产三萜类化合物的滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9在制备三萜类化合物中的应用。
其中，所述应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9CGMCC N0.13895；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30～35℃条件下，静止培养96～102小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100mL液体种子培养基中，置旋转转速为160～180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，27～33℃培养72～96小时，得种子液；
(4)以三萜类化合物为目的产物发酵培养：
摇瓶发酵：以8～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80～100mL发酵培养基的摇瓶中，27～33℃，转速为150～180转/分钟，pH为6.0±0.5，摇瓶发酵144～168小时，即获得含三萜类化合物的发酵产物；
其中：上述斜面培养基组成为：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1L，pH自然；固体培养基加1.5％琼脂粉，即PDA；
上述液体种子培养基组成：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1L，pH自然；
上述以三萜类化合物为目的产物的发酵培养基的组成为：蔗糖10～40g/L，豆粕粉10～40g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.46g/L，十二水合磷酸氢二钠1.2g/L；去离子水1L；pH6，灭菌117℃，30min。
上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选30℃。
上述的应用中，步骤(2)所述培养时间优选100小时。
上述的应用中，步骤(3)所述培养时间优选80小时。
上述的应用中，步骤(4)所述培养时间优选150～160小时。
上述的应用中，步骤(4)所述发酵培养基初始蔗糖浓度优选20g/L～30g/L。
上述的应用中，步骤(4)所述发酵过程中摇瓶发酵的pH优选6.0。
上述三萜类化合物按下述方法测定：
三萜类化合物提取：干燥至恒重的滴孔菌A-9菌体粉碎，置于50ml离心管中，加无水乙醇50ml，超声处理(400W,55kHz)30min,滤过，滤渣重复上述操作1次，合并滤液。滤液旋转蒸发仪60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的样品用于分析。将离心后的发酵液，加2倍无水乙醇，醇沉，离心，8000rpm，10min，除去沉淀多糖，之后得到的乙醇与发酵液混合液利用旋转蒸发仪60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的样品用于分析。
吸光度检测：将所得样品分别摇匀，用移液枪吸取适量溶液，水浴蒸干后各加入0.3ml 5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸轻轻震荡后密封，于70℃水浴加热25min，取出后立即冰水冷却至30℃后加冰醋酸5ml，快速摇匀，放置20min，在540nm处测量吸光度。
本发明公开了一株产三萜类化合物的滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9，作为自主采摘分离鉴定的新菌株，发明人未检索到有关利用滴孔菌A-9以生产三萜类化合物为目的产物的文献报道。实验证实利用本发明所述滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9CGMCC N0.13895可直接发酵生成并获得目的产物三萜类化合物，菌种发酵性能稳定，是一株极具研究开发价值的三帖类化合物生产菌株。其为液体发酵生产三萜类化合物探索了新的方向与途径，为将来进行发酵生产打下基础。
本发明采用生物发酵的方法，以蔗糖、豆粕粉等为原料生产三萜类化合物，具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富，生产成本低等特点，发酵生产的三萜类化合物产量最高可达2.1g/L以上，具有较高的应用价值，极具工业化应用前景。
具体实施方式
实施例1产三萜类化合物的滴孔菌菌株分离纯化
菌种系采自于野外的担子菌子实体。将新鲜的子实体以无菌手术刀切开，用眼科镊子撕取少许菌肉接种于PDA平板，30℃培养。待菌丝垫直径达2-3厘米时，从菌丝边缘挑取少许菌丝接种于新的PDA平板，经反复多次转接，直至分离得到纯菌种。将目的菌株再经摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，得到一株性能稳定的三萜类化合物产生菌，该菌株命名为滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9。
上述菌株滴孔菌A-9已于2017年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC N0.13895。
上述液体种子培养基组成(g/L)：铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1L，pH自然。
上述斜面培养基组成为(g/L)：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1L，pH自然。固体培养基加1.5％琼脂粉，即PDA。
实施例2滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9CGMCC N0.13895菌株18S rDNA及ITS序列测序
将实施例1分离纯化得到的产三萜类化合物菌株即CGMCC N0.13895菌株委托博尚生物公司进行18S rDNA测序。
实验方法是：挑取斜面培养物,提取基因组作为模板，分别以通用引物NS1，NS8扩增18srRNA基因，片段大小为约1.8kb，以通用引物ITS1，ITS4扩增ITS序列，片段大小约为750bp。
取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片断，对上述回收产物进行DNA测序。
测序结果：CGMCC N0.13895菌株18S rDNA序列长度为1679bp，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；CGMCC N0.13895菌株ITS序列片段大小为727bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。所用引物如表1所示。
表1所用引物列表
Figure BDA0001330616350000041
实施例3滴孔菌A-9CGMCC N0.13895在制备三萜类化合物中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9CGMCC N0.13895；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30℃条件下，静止培养100小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100mL(500mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为160转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30℃培养80小时，得种子液；
(4)摇瓶发酵：以8～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有90-100mL(500mL三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，30℃，转速为160转/分钟，摇瓶发酵160小时，即获得含三萜类化合物的发酵产物；
上述斜面培养基组成为：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1L，pH自然。固体培养基加1.5％琼脂粉，即PDA；
上述液体种子培养基组成：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1L，pH自然；
上述发酵培养基的组成为：蔗糖30g/L，豆粕粉30g/L，硫酸镁(七水合)0.5g/L，磷酸二氢钾0.46g/L，磷酸氢二钠(十二水合)1.2g/L。去离子水1L，pH6，灭菌117℃，30min。
(5)产物检测：取适量样品水浴蒸干后加入0.3ml 5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸轻轻震荡后密封，于70℃水浴加热25min，取出后立即冰水冷却至30℃后加冰醋酸5ml，快速摇匀，放置20min，在540nm处测量吸光度；
经检测发酵液中菌体和上清的总三萜类化合物的含量为2.1g/L。
上述三萜类化合物按下述方法测定：
三萜类化合物提取：取适量培养物离心3000rpm，10min，沉淀的菌体于100℃烘箱中干燥至恒重，粉碎成末，置于50ml离心管中，加无水乙醇50ml，超声处理(400W,55kHz)30min,滤过，滤渣重复上述操作1次，合并滤液。滤液旋转蒸发仪60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的样品用于分析。将离心后的上清液，加2倍无水乙醇，醇沉，离心，8000rpm，10min，除去沉淀多糖，之后得到的乙醇与发酵液混合液利用旋转蒸发仪60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的样品用于分析。
吸光度检测：将所得样品分别取适量于10ml离心管中，水浴蒸干后各加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸轻轻震荡后密封，于70℃水浴加热25min，取出后立即冰水冷却至30℃后加冰醋酸5ml，快速摇匀，放置20min，在540nm处测量吸光度。
序列表
<110>山东大学
<120>一株产三萜类化合物的滴孔菌及其应用
<141>2017-06-14
<160> 2
<210> 1
<211>1679
<212>rDNA
<213>滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9
<221>滴孔菌菌株CGMCC N0. 13895的18S rDNA序列
<222>（1）…（1679）
<400>1
cagtttgtac tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatggta 60
ccttgctaca tggataactg tggtaattct agagctaata catgcaatca aagccccgac 120
ttctggaagg ggtgtattta ttagataaaa aaccaacgcg gttcgccgct ccattggtga 180
ttcataataa cttctcgaat cgcatggcct tgtgccggcg atgcttcatt caaatatctg 240
ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg cctaccatgg tttcgacggg taacggggaa 300
taagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc 360
aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg acaataaata acaatatagg 420
gctcttttgg gtcttataat tggaatgagt acaatttaaa tcccttaaca aggaacaatt 480
ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaag 540
ttgttgcagt taaaacgctc gtagttgaac ttcagacctg gccgggtggt ctgcctaacg 600
gtatgtactg tctggctggg tcttacctct tggtgagccg gcatgccctt tactgggtgt 660
gtcggggaac caggactttt accttgagaa aattagagtg ttcaaagcag gcctatgccc 720
gaatacatta gcatggaata ataaaatagg acgtgcggtt ctattttgtt ggtttctaga 780
gtcgccgtaa tgattaatag ggatagttgg gggcattagt attcagttgc tagaggtgaa 840
attcttggat ttactgaaga ctaactactg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta 900
atcaagaacg aaggttaggg gatcgaaaac gatcagatac cgttgtagtc ttaacagtaa 960
actatgccga ctagggttcg ggcgatctca aatttatgtg tcgctcggca ccttacgaga 1020
aatcaaagtc tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag gctgaaactt aaaggaattg 1080
acggaagggc accaccaggt gtggagcctg cggcttaatt tgactcaaca cggggaaact 1140
caccaggtcc agacataact aggattgaca gattgatagc tctttcataa ttttatgggt 1200
ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc tggttaattc cgataacgaa 1260
cgagacctta acctgcttaa tagccaggcc ggcttttgct ggtctccggc ttcttagagg 1320
gactgtctgt gtctaacaga tggaagtttg aggcaataac aggtctgtga tgcccttaga 1380
tgttctgggc cgcacgcgcg ctacactgac agaaccagcg agtttttttc tcccttggcc 1440
ggaaggtctg ggtaatcttg tgaaactctg tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt 1500
gctcttcaac gaggaatacc tagtaagcgc gagtcatcag ctcgcgttga ttacgtccct 1560
gccctttgta cacaccgccc gtcgctacta ccgattgaat ggtttagtga ggtcttggga 1620
ttggcttcgg ggagccggca acggcacctt gctgctgaga acttgatcaa acttggtca 1679
<210> 2
<211>727
<212>DNA
<213>滴孔菌(Piptoporus sp.)A-9
<221>滴孔菌菌株CGMCC N0. 13895的ITS序列
<222>（1）…（727）
<400>2
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgaattttg aattgggttg tagctggcct 60
ccgggcatgt gcacatcctt ttctttaaca cacacacaca cacacacctt gtgcactcac 120
tgtaggctgg ggttgaaaag ggttgttggg ttgccttcgg gttctaactc ctaaccccag 180
tttatgtttt tatatctacc cactccaagt catagaatgt cattgatgcg tctaacgcaa 240
tgttgggaat aatataactt tcagcaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaagaacg 300
cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac 360
gcaccttgcg ctccttggta ttccgaggag catacctgtt tgagtatcat ggaactctca 420
actcattcat tcttgttata tagtgtgagt gggcttggac ttggaggctt tgctggtgca 480
tgaaatggca tcggctcctc ttgaatgcat tagcttgaac ctatgtgggg tggatcggct 540
atcggtgtga taatatttgt ctatgccggg ttgtgaaaga gccctgggtt acccttctgt 600
ttgggggggg atttcaagct tctaatctct gagttgggac cattttcttg ggaccatttc 660
ttcttacctc tgatctcaaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca tatcaataag 720
cggagga 727

Claims (1)

1.一株产三萜类化合物的滴孔菌在制备三萜类化合物中的应用，其涉及的步骤顺序如下：
（1）菌种选择：选用滴孔菌(Piptoporussp.) A-9，该菌株已于2017 年5 月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.13895；
（2）斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，27～33℃条件下，静止培养96～102小时，备用；其中：所述斜面培养基组成为：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L；pH自然；固体培养基加15 g /L琼脂粉，即PDA；
（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100mL液体种子培养基中，置旋转转速为160～180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，27～33℃培养72～96小时，得种子液；其中：所述液体种子培养基组成：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1L；pH自然；
（4）以三萜类化合物为目的产物发酵培养：
摇瓶发酵：以8～10%的体积比的接种量，将种子液接种于装有80～100 mL发酵培养基的摇瓶中，27～33℃，转速为150～180转/分钟，pH为6.0±0.5，摇瓶发酵144～168小时，即获得含三萜类化合物的发酵产物；
其特征是：
所述以三萜类化合物为目的产物的发酵培养基的组成为：蔗糖10～40g/L，豆粕粉10～40g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.46g/L，十二水合磷酸氢二钠1.2g/L；去离子水1L；pH6，灭菌117℃，30min。
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