CN101933460B - 一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。采用的技术方案是：桦褐孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)，CCTCC M209280。利用此桦褐孔菌提取三萜类物质的方法如下：经活化，制备种子液；以发酵液体积2％的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵，将发酵液抽滤，45℃干燥，抽滤出菌丝体，将菌丝体倒入研钵研磨成粉末状，加入10倍体积的有机溶剂，浸泡24小时；于50℃，77KHz下超声破碎60分钟；于5000转/分钟条件下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩，得目标产物。本发明提取的三萜类物质含量高，回收率高，为大规模生产提供了可行性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。
本发明所称的桦褐孔菌命名为：桦褐孔菌(Inonqqus obliquusLNUF008)，已于2009年11月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 209280。
背景技术
桦褐孔菌Inonqqus obliquus，国内还称为桦癌褐孔菌、斜生纤孔菌。属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、刺革菌科。
桦褐孔菌的形态：它的子实体呈现肿瘤状(不育性的块状物)，直径25～40cm，深色，表面深裂，很硬，时脆。孢子阔椭圆状至卵状，光滑，有刚毛。菌丝为二系菌丝系统，具有生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝，黄褐色，具有刚毛状菌丝和稀少刚毛；基内菌丝多为生殖菌丝，淡黄褐色，有隔，无锁状联合。
桦褐孔菌在俄罗斯、波兰、芬兰等地是一种应用很广泛的药用真菌，英文名chaga。1955年，chaga被俄罗斯医学研究院用来治疗肿瘤，特别是消化系统和肺部肿瘤。16世纪至今，东欧一些国家的民间就是用这种菌的菌核来防治癌症。西伯利亚的Khhanty人用这种真菌来预防和治疗心脏病、肝病、胃病和食道疾病等。近期研究表明，桦褐孔菌能抑制艾滋病等病毒(HIV-1)，抗辐射、并通过抑制蛋白质生物合成、抗有丝分裂及消除自由基活性等作用机制来抑制或延缓肿瘤细胞的生长和防治0-157大肠杆菌中毒。
但是，目前桦褐孔菌的使用主要以野生为主。野生的桦褐孔菌主要生长在俄罗斯的西伯利亚地区、日本北海道、芬兰等地。在我国吉林长白上地区和黑龙江大小兴安岭地区有野生桦褐孔菌生长。而采用野生直接使用，其有效成分利用率低。三萜类物质在医学上具有很高的应用价值，现有从桦褐孔菌中提取三萜类物质，提取率较低。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种桦褐孔菌(Inonqqusobliquus LNUF008)，于中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M209280。以下简称桦褐孔菌LNUF008。采用此菌，三萜类物质的提取率高。
本发明的另一目的是提供一种从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种桦褐孔菌，其特征在于：桦褐孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)，2009年11月24日于中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 209280。
本发明提供的桦褐孔菌LNUF008的筛选方法为：
自长白山野生林区采摘新鲜的桦褐孔菌子实体(直径22.5cm)，在无菌间内分离菌丝体。首先，从子实体上剜下直径5cm的块，以75％的酒精表面消毒10min，用无菌水冲洗5～6次，0.1％的氯化汞表面消毒1～2min，用无菌水冲洗。用无菌刀将子实体块劈开，用无菌剪从中心菌肉处剜取直径0.5cm小块，移至平皿培养基中，28℃培养5天。
待长出菌落后，将菌落挑入斜面培养基中，培养7天，至斜面长满，得菌株LNUF008，将斜面于4℃冰箱保存。
菌株LNUF008的鉴定如下：
A.菌丝体外部形态观察结果
将斜面中菌丝体接种至固体培养基平皿中央，28℃恒温培养10天，肉眼逐日观察菌丝体外观形态变化。培养3天后，平皿中央菌块周围有白色绒状菌丝出现；培养5天后，菌落不断扩展，菌丝白色但逐渐加粗；培养7天后，菌落扩展到平皿1/2，菌丝体逐渐匍匐于培养基上，由白色逐渐变黄；培养10天后，菌落继续扩展，菌丝体由黄色向棕色转变，并有模糊的环纹出现，菌落表面有菌孔，并出现黄褐色液珠，如图1。从表面形态观察，此菌株LNUF008与桦褐孔菌极为相似。
B.菌丝体显微结构观察
利用载玻片培养观察法对菌株LNUF008菌丝体进行观察。菌丝为二系菌丝系统，具有生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝，初为白色，宽2.5～4.0μm，具有刚毛状菌丝；基内菌丝体多为生殖菌丝，淡黄褐色，宽3.0～5.0μm，有隔，无锁状联合，如图1。
C.菌株LNUF008的测序及进化树的制作：
菌丝体的DNA提取：取0.1g菌株LNUF008的菌丝体，在1.5mL的Eppendorf管中用研杵充分研磨后加入600μL 2×CTAB提取缓冲液(EDTA20mmol/L，Tris-HCl 100mmol/L，pH 8.0，NaCl 0.7mol/L，CTAB 20g/L)，65℃水浴放置30min。加入等体积氯仿、异戊醇混合液(V∶V＝24∶1)充分摇匀，4℃下10,000r/min离心10min，转移上清液至新的1.5mL的离心管中，加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(V∶V∶V＝25∶24∶1)。本步骤需重复多次，直至处于中间的蛋白质相消失为止。移取上清液至一新的Eppendorf管中，加入10％体积的3mol/L NaAc溶液(pH 6.0)以及2.5倍体积的冰冻乙醇，4℃下10,000r/min离心5min，沉淀用70％的酒精洗2～3次。晾干，加TE(含10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH 8.0)缓冲液，充分溶解后在-20℃下保存备用。
测得的菌株LNUF008的ITS序列如下所示：
TCGAGGGGCCTGTGCTGGCACGGAAACGTTTGCATGTGCACGGCCTTTCGTGCTCAAATCCAACTCTCAAACCCCTGTGCACCTATACAAGTTGAAGGTCTTAGTAGTTTCTGTAATCGAACGGCAAGTCAAGTACGTCGAGTAATCAAGTACGAGGGTTTCGGGCCTTGGAAAGTGTGAAAGATGGAAAGGCAAGCTTCAGAGACAAGGAGACGAAAAGCTTTTGGCTTCATTACAAACACCAATATAATTGTTATGTGAATGAAATGCTCCTTGTGGGCGATAATAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTAATCTCAAATCGCTCGTCTATTCTTAATTGAAGTGGCTTTCGATTTGGACTTGGAGGTTTTGCTGGCCCGGGCGACTTTGGTTGCCCTTGGTTTGTCGGCTCCTCTCAAATACATTAGCTGGACTTTGGTTCGCGTTTACGGTGTAATAATGTAATGTTCACCAAGACGCTTGCCTAACAAGTCTGCTTCTAATAGTCCTTAAGTTGGACAAGGATCCCTTCGTTGGGCCTTCTT
以上为PCR扩增后产物的测序结果，其全长为686个bp
将测得的菌株LNUF008的ITS序列在GenBank序列库中做BLAST比对。结果显示，本实验鉴定菌株LNUF008与Inonotus Obliquus DQ103883及Basidiomycete sp FJ190414相似度为100％。在GenBank中搜索具有与之相似的序列的16株菌株如下：
D.菌株LNUF008系统进化树分析：
将与菌株LNUF008相似的16株菌株的ITS序列，用DNAStar商用软件包SeqMan进行序列拼接，截去测序引物及头尾多余序列，与菌株LNUF008的ITS序列一同构建系统进化树，所得结果如图2。
将测得的基因序列与GenBank中保存的基因序列进行比对，得到序列相似性图谱，并做系统进化树如图2，实验分离出的菌株LNUF008与Inonotus_Obliquus在整个属中的位置从树状图看到，菌株LNUF008与其他菌株有很高的相似性，从分子角度来说其属于桦褐孔菌。
F.结论：从桦褐孔菌子实体中分离出的菌株LNUF008，通过生理生化反应，并利用PCR反应扩增该菌株的16S rDNA，经过测序鉴定，利用生物软件MegAlign制作进化树进行同源性分析及进化分析，确定菌株LNUF008为桦褐孔菌，我们命名为桦褐孔菌(Inonotus Obliquus LNUF008)，2009年11月24日送中国典型培养物保藏中心保藏，其编号为CCTCC M 209280。
利用桦褐孔菌LNUF008提取三萜类物质的方法如下：
1)菌种活化：将桦褐孔菌LNUF008接到PDA斜面培养基上，在28℃恒温箱里培养5-7天；
2)种子液制备：将活化的菌种，用接种环挑接到含有200毫升PDA液体培养基的500毫升三角瓶中，在28℃，180转/分钟下培养10-12天；
3)发酵液制备：种子液以发酵液体积2％的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵温度为26～30℃，发酵时间为70～74小时，pH为6.8～7.2，通气量为0.5～1.0立方米/小时，转速为400转/分钟，罐压为0.1～0.2兆帕；
4)提取：将发酵液抽滤，45℃干燥，抽滤出菌丝体，将菌丝体倒入研钵中，研磨成粉末状，加入8～12倍体积的有机溶剂，浸泡24小时；于50℃，77KHz下超声破碎50～70分钟；然后将混合液于5000转/分钟条件下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩，得目标产物。
本发明的有益效果是：本发明的桦褐孔菌LNUF008，从桦褐孔菌LNUF008中提取三萜类物质含量为5.61％，回收率为11.6％。为大规模生产提取提供了可行性。
附图说明：
图1是桦褐孔菌LNUF008的显微镜下观察照片；
图2是利用MegAlign软件制作的桦褐孔菌LNUF008的进化树。
具体实施方式：
从桦褐孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)提取三萜类物质的方法：
1)菌种活化：将桦褐孔菌(Inonotus Obliquus LNUF008)CCTCC M209280接到PDA斜面培养基上，在28℃恒温箱里培养5～7天；
PDA斜面培养基组成为：土豆200克、葡萄糖20克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.5克、琼脂2g、去离子水1000毫升、pH自然；
2)种子液制备：将活化的菌种，用接种环挑接到2个含有200毫升PDA液体培养基的500毫升三角瓶中，在28℃，180转/分钟条件下培养10～12天；
PDA液体培养基：葡萄糖20克、蛋白胨0.2克、VB10.005克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.5克、去离子水1000毫升、pH为6.5；
3)发酵液制备：种子液以发酵液体积2％的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵温度为28℃，发酵时间为72小时，pH为7.0，通气量为0.5～1.0立方米/小时，转速为400转/分钟，罐压为0.1～0.2兆帕；
发酵罐液体综合培养基：葡萄糖20克，蛋白胨0.2克，土豆200克，去离子水1000毫升，pH为6.5。
4)提取：将发酵液抽滤，45℃干燥，抽滤出菌丝体，将菌丝体倒入研钵中，研磨成粉末状，加入10倍体积的无水乙醇，浸泡24小时；于50℃，77KHz下超声破碎60分钟；然后将混合液于5000转/分钟条件下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩，得目标产物。
5)目标产物鉴定：将目标产物用薄层层析法检测，目标产物的条带与文献的三萜类物质条带相同，可以确定目标产物为三萜类化合物。以白桦脂醇为对照品，采用分光光度法和高效液相色谱法测定三萜类物质的含量。结果测定三萜类物质含量为5.61％，回收率为11.6％。
序列表
<110>辽宁大学
<120>一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法
<160>1
<210>1
<211>686
<212>DNA
<213>桦褐孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)
<400>1
tcgaggggcc tgtgctggca cggaaacgtt tgcatgtgca cggcctttcg 50
tgctcaaatc caactctcaa acccctgtgc acctatacaa gttgaaggtc 100
ttagtagttt ctgtaatcga acggcaagtc aagtacgtcg agtaatcaag 150
tacgagggtt tcggcccttg gaaagtgtga aagatggaaa ggcaagcttc 200
agagacaagg agacgaaaag cttttggctt cattacaaac accaatataa 250
ttgttatgtg aatgaaatgc tccttgtggg cgataataaa tacaactttc 300
aacaacggat ctctaggctc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 350
ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 400
accttgcgcc ccttggtatt ccgaggggca tgcctgtttg agtgtcatgt 450
taatctcaaa tcgctcgtct attcttaatt gaagtggctt tcgatttgga 500
cttggaggtt ttgctggccc gggcgacttt ggttgccctt ggtttgtcgg 550
ctcctctcaa atacattagc tggactttgg ttcgcgttta cggtgtaata 600
atgtaatgtt caccaagacg cttgcctaac aagtctgctt ctaatagtcc 650
ttaagttgga caaggatccc ttcgttgggc cttctt 686
Claims (1)
1.一种从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法，其特征在于步骤如下：
1)将桦褐孔菌LNUF008(Inonqqus obliquus)活化，制备种子液；所述的桦褐孔菌LNUF008(Inonqqus obliquus)为CCTCC M 209280；
2)发酵液制备：种子液以发酵液体积2％的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵温度为26～30℃，发酵时间为70～74小时，pH为6.8～7.2，通气量为0.5～1.0立方米/小时，转速为400转/分钟，罐压为0.1～0.2兆帕；
所述的发酵罐液体综合培养基为：葡萄糖20克，蛋白胨0.2克，土豆200克，去离子水1000毫升，pH为6.5；
3)提取：将发酵液抽滤，45℃干燥，抽滤出菌丝体，将菌丝体倒入研钵中，研磨成粉末状，加入8～12倍体积的有机溶剂，浸泡24小时；于50℃，77KHz下超声破碎50～70分钟；然后将混合液于5000转/分钟条件下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩，得目标产物；
所述的有机溶剂为无水乙醇。
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