CN104673681B

CN104673681B - 一株桦褐孔菌qd04及其转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法

Info

Publication number: CN104673681B
Application number: CN201510070269.1A
Authority: CN
Inventors: 刘琳; 郭立忠
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104673681A

Abstract

本发明提供了一株桦褐孔菌QD04及其转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，所述桦褐孔菌QD04保存于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC M 2015036，本发明利用药用真菌QD04将植物中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，大大提高了其白藜芦醇的收率，工艺简单，重复性好；菌体能够利用虎杖合成自身活性物质三萜皂苷和多糖；发酵产物桦褐孔菌菌丝体含有丰富的人体必需氨基酸，具有较高的营养价值；一次发酵过程同时获得白藜芦醇、三萜皂苷、多糖和桦褐孔菌菌丝体4种产品，生产过程附加值高；所述桦褐孔菌能够更加彻底地水解虎杖纤维素，使虎杖生物质资源得到充分利用，减少了资源浪费和环境污染。

Description

一株桦褐孔菌QD04及其转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法

技术领域

本发明属于天然产物的生物转化和发酵工程技术领域，具体涉及一株桦褐孔菌QD04及其转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法。

背景技术

白藜芦醇（3，4'，5-三羟基-反式-二苯乙烯）是一种非黄酮类多酚化合物，存在于虎杖、葡萄、花生等70余种植物中，是植物处于逆境下产生的一种植物抗毒素。研究表明白藜芦醇具有抗癌、抗氧化、保护心血管系统、清除自由基和延缓衰老等功效。

白藜芦醇的生产方法有化学合成和从天然植物中提取。化学合成法成本高，污染环境，所以目前白藜芦醇的生产主要是从植物中提取。然而，植物中的白藜芦醇含量特别低，其中在虎杖中含量最高，但也仅达到0.43%（汉中地区），这就使得其分离纯化成本偏高。而白藜芦醇类似物白藜芦醇苷在植物中的含量远高于白藜芦醇。在虎杖中，白藜芦醇苷的含量可达到2.5%（汉中地区）。如果将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，白藜芦醇的产率可大幅度提高。

传统上，苷元的获得是通过水解相应的糖苷来实现的。但水解反应需要在高温高压下由酸或碱催化来完成，对设备要求高，且对环境造成污染。相比之下，生物转化法具有条件温和，过程简单，污染小等优点，已经成为药物修饰的重要手段。

将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇主要是通过酶法转化和微生物转化实现的。例如，在粉末状虎杖原料中加入复合酶恒温酶解反应48~72小时，或者在虎杖提取液中加入纤维素酶进行水解。酶法转化虽然取得了一定的效果，但是酶价格昂贵，限制了这些方法的推广使用。一些研究者利用微生物转化虎杖的白藜芦醇苷粗提物，虽然白藜芦醇转化率较高（超过95%），但提取白藜芦醇苷增加了操作步骤且需要大量有机溶剂。另有研究将浸润后的虎杖置于温度为20~50℃的容器内自然发酵24~96小时或者在虎杖中加入专用微生物进行转化提高了白藜芦醇的产率。但自然发酵过程中的菌群未知，条件难以控制，且空气中的霉菌有可能产生有毒物质；专用微生物转化法中所用微生物未公开，无法验证和重复，其实用性受到极大限制。再者，已报道的高效转化白藜芦醇苷的微生物菌种主要是霉菌，这样不仅得到的白藜芦醇产品可能存在安全隐患，发酵过程中还产生大量菌丝体和药渣，造成资源浪费和环境污染。

药用真菌中的白腐菌能够同时分泌纤维素酶和木质素降解酶，比霉菌更适合水解天然木质纤维素。研究表明，桦褐孔菌对液体深层发酵培养基中的甘蔗渣、稻秆、麦秆和花生壳的木质素、纤维素、半纤维素成分均有较好的降解效果。同时，桦褐孔菌主要活性成分三萜皂苷在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和调节心血管系统等方面均呈现较好的生物活性；桦褐孔菌多糖具有降血糖及血脂、抗病毒及肿瘤、抗氧化及衰老、抗炎及抗凝血、增强免疫力和止痛等功效。另外，发酵产物桦褐孔菌菌丝体含有丰富的人体必需氨基酸，具有较高的营养价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株桦褐孔菌QD04及其转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，所述桦褐孔菌QD04（Inonotus obliquus）于中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 2015036，以下简称桦褐孔菌QD04。

本发明的另一目的是桦褐孔菌QD04利用虎杖作为主要碳源，将植物中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，合成自身活性成分多糖和三萜皂苷，大大提高了白藜芦醇的收率。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株桦褐孔菌QD04，其分类命名为桦褐孔菌 Inonotus obliquus，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2015036。

所述QD04的菌落呈圆形，初始时为绒毛状，后变为棉絮状，具有同心轮纹；菌丝无色透明，具有隔膜，树状分支较多，呈现交叉网状，菌丝前端较齐短。

本发明还提供了所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，它包括以下步骤：

1）种子培养：将所述桦褐孔菌QD04接种到种子培养基中进行培养得种子培养液，摇床转速为100～200rpm，温度为20～30℃，培养时间为4~6 d；

2）发酵培养：将所述种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为按照体积比5%～15%，摇床转速为100～200rpm，温度20~30℃，培养时间为8~12 d，发酵产物中含有所述白藜芦醇、三萜皂苷和多糖。

对上述技术方案的进一步改进：所述种子培养基的组分包括葡萄糖1~3%、蛋白胨0.5~2.0%、KH₂PO₄ 0.2~0.4%、MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3%和麸皮0.5~2%，按质量体积百分比计。

对上述技术方案的进一步改进：所述发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和诱导物，所述碳源包括添加量占培养基质量体积比为0.5~8.0%的虎杖；所述氮源的添加量占培养基质量体积比为0.5~2.5%，所述诱导物为占培养基质量体积比为0.5~4.0%的麸皮。

对上述技术方案的进一步改进：所述碳源还包括添加量占培养基质量体积比为0.5~2.0%的补充碳源，所述补充碳源为麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖或玉米粉中的一种或几种。

对上述技术方案的进一步改进：所述氮源为蛋白胨、黄豆粉、豆粕、牛肉膏、酵母膏或 (NH₄)₂SO₄中的一种或几种。

对上述技术方案的进一步改进：所述无机盐为KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O，其添加量分别占培养基质量体积比为0.3%和0.15%。

对上述技术方案的进一步改进：所述方法还包括步骤3）发酵罐培养：在发酵罐中进行，接种量为按照体积比5%～15%，转速为150～350rpm，温度为20～30℃，发酵过程中通入空气量为0.8～1.5vvm，发酵时间为8~10d。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

1）直接将原料粉末进行发酵，显著提高了白藜芦醇的收率，工艺简单，重复性好。

2）桦褐孔菌QD04菌体能够利用虎杖合成自身活性物质三萜皂苷和多糖。

3）发酵产物桦褐孔菌菌丝体含有丰富的人体必需氨基酸，具有较高的营养价值。

4）一次发酵过程同时获得白藜芦醇、三萜皂苷、多糖和桦褐孔菌菌丝体4种产品，生产过程附加值高。

5）与已报道的转化白藜芦醇微生物菌种相比，桦褐孔菌能够更加彻底的水解虎杖纤维素，使虎杖生物质资源得到充分利用，减少了资源浪费和环境污染。

附图说明

图1是转化白藜芦醇菌株的筛选，其中，1：白藜芦醇苷；2：原药材虎杖对照；3：白藜芦醇；4：QD01；5：QD07；6：QD02；7：QD06；8：QD10；9：QD04。

图2 是QD04菌落的正面图。

图3 是QD04菌落的反面图。

图4 是QD04菌丝的显微观察图。

图5 是QD04 菌丝的尖端显微观察图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例详细叙述本发明的技术方案。

实施例1

本发明提供的桦褐孔菌QD04的筛选方法为：

1）分泌纤维素酶的菌株的筛选：

将13种药用真菌白腐菌（青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室采集保藏）分别接种到纤维素-刚果红培养基平板上，经144h培养，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），以cm计，见表1。结果表明：QD01、02、04、06、07和10号菌株，D/d值大于1，初步判断它们可能具有较强的合成纤维素酶的能力。

表1 产纤维素酶菌株的纤维素-刚果红平板筛选结果

菌种编号	144小时透明圈直径	144小时菌落直径	144小时透明圈与菌落直径比值
				QD01	3.00	1.20	2.50
QD02	4.00	1.80	2.22
				QD03	____	0.40	____
QD04	5.00	1.50	3.33
				QD05	2.30	2.30	1.00
QD06	1.60	0.40	4.00
				QD07	2.10	0.90	2.33
QD08	____	1.30	____
				QD09	____	7.00	____
QD10	4.10	3.80	1.07
				QD11	1.30	2.00	0.65
QD12	3.60	3.60	1.00
				QD13	____	0.40	____

2）转化白藜芦醇菌株的筛选：将6种白腐菌在以虎杖为碳源的培养基中进行液体发酵培养，TLC检测白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的情况（如图1所示）培养基培养同上。结果显示：QD04和QD07在白藜芦醇Rf处有蓝色斑点，与对照相比，斑点大小更大，颜色更深；其它4种真菌在白藜芦醇Rf处没有蓝色荧光斑点出现。这说明6种菌中只有QD04和QD07能够将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。HPLC检测QD04的白藜芦醇转化率为85%，QD07为20%，因此，确定菌株QD04能够高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇，进一步对该菌进行鉴定。

3）菌株的鉴定：

QD04菌落呈圆形，初始时为绒毛状，后变为棉絮状，具有同心轮纹；菌落正面呈白色，培养一段时间后，菌落略带黄色；背面初始时呈浅黄色，随着培养时间的延长范围逐步扩大、颜色加深至黄褐色。培养10 d后，菌落长满整个平板。图2和图3 分别是菌落正反面照片。将盖玻片斜插在在待鉴定菌株的PDA平板培养基上，待菌丝长至盖玻片的2/3处时，取出盖玻片擦拭反面，制成菌丝临时标本，在显微镜下观察菌丝生长状况、菌丝及菌丝尖端形态特征，并拍照记录。图4和图5分别是菌丝和菌丝尖端在显微镜照片，显微镜下未知菌菌丝无色透明，具有隔膜，树状分支较多，呈现交叉网状，菌丝前端较齐短。QD04平板菌落特征以及显微镜下的菌丝特征与桦褐孔菌相似。

将测序得到的以ITS4端起始的序列用DNAman软件处理，得到反向互补序列，将其与以ITS1端起始的序列进行拼接，保留重叠序列，即该菌株的ITS序列（759 bp）CTAB法提取获得QD04的基因组DNA，以其为模板，用通用引物ITS1和ITS4，扩增获得ITS目的片段大小为759个bp，条带清晰明亮。将ITS序列在NCBI中进行BLAST同源性比较，结果显示其与序列号为GU903006.1、KC312697.1、AY558593.1和DQ103883.1的四个菌株同源性达到100%，这四个菌株均为桦褐孔菌。因此，鉴定QD04号菌株为桦褐孔菌。QD04菌株ITS序列如下，全长759bp（SEQ ID No:1所示）：

5’-AAGGATCATTATCGAGTTTATTTTGAAATCGAGGGGCCTGTGCTGGCACGGAAACGTTGCATGTGCACGGCCTTTCGTGCTCAAATCCAACTCTCAAACCCCTGTGCACCTATACAAGTTGAAGGTCTTAGTAGTTTCTGTAATCGAACGGCAAGTCAAGTACGTCGAGTAATCAAGTACGAGGGTTTCGGCCCTTGGAAAGTGTGAAAGATGGAAAGGCAAGCTTCAGGGACAAGGAGACGAAAAGCTTTTGGCTTCATTACAAACACCAATATACTTGTTATGTGAATGAAATGCTCCTTGTGGGCGATAATAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCCAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTAATCTCAAATCGCTCGTCTATTCTTAATTGAAGTGGCTTTCGATTTGGACTTGGAGGTTTTGCTGGCCCGGGCGACTTTGGTTGCCCTTGGTTTGTCGGCTCCTCTCAAATACATTAGCTGGACTTTGGTTCGCGTTTACGGTGTAATAATGTAATGTTCACTAAGACGCTTGCCTAACAAGTCTGCTTCTAATAGTCCTTAAGTTGGACAAGGATCCCTTCATTGGGCCTTCTTGACACCTTTGACCTCAAATCACGTAGGATTACCCGCTGAACTTAA-3’

本发明从13种白腐菌中筛选到一株白腐菌QD04，经ITS鉴定为该菌为桦褐孔菌（Inonotus obliquus）。将筛选到的菌株桦褐孔菌QD04进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：中国武汉市武汉大学；保藏日期：2015年1月15日，桦褐孔菌Inonotus obliquus 的保藏编号为CCTCC M 2015036。

实施例2：桦褐孔菌QD04摇瓶发酵虎杖

1）种子培养：

种子培养基配方为：按照质量体积百分比计，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄ 0.3%，MgSO₄·7H₂O 0.15%，麸皮0.5%，余量为水，250ml 三角瓶装液量为50ml，121℃灭菌20min。

种子培养在250ml的三角瓶中进行，装液量为50mL，摇床转速为150rpm，培养温度为28℃，培养时间为96小时；

2）发酵培养

发酵培养基：3g麸皮加100ml自来水煮沸20min，过滤，滤液添加水到100ml，取50ml装入250ml三角瓶中，添加虎杖粉末2g（60目），蔗糖1g，蛋白胨0.25g，KH₂PO₄0.15g,和MgSO₄·7H₂O 0.075g，121℃灭菌20min。

发酵培养基中必须具备微生物生长所需的碳源、氮源和无机盐。所述发酵培养基碳源以虎杖为主，虎杖添加量为0.5~8.0%；补充碳源为麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖和玉米粉，添加量为0.5~2.0%；氮源为蛋白胨、黄豆粉、豆粕、牛肉膏、酵母膏、(NH₄)₂SO_4，添加量为0.5~2.5%；无机盐为KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O，添加量分别为0.3%和0.15%；诱导物为添加量0.5~4.0%的麸皮，发酵培养基的余量为水，上述添加量均为占培养基的质量体积比。

发酵培养在在250ml的三角瓶中进行，接种量为15%，装液量、摇床转速和培养温度同种子培养基，培养时间为10 d。

实验结果：发酵进行10d，白藜芦醇转化率为99.43%，三萜皂苷产量为837.14±3.56μg/mL，多糖产量为48.69±2.15mg/mL。

实施例3：桦褐孔菌QD04批式发酵虎杖

1）种子培养：

种子培养基和种子培养过程同实施例1。

2）发酵培养

发酵培养基：35g麸皮加1000ml自来水煮沸20min，过滤，滤液添加水到1000ml，向滤液中添加虎杖粉末60g/L（60目），蔗糖10g/L，蛋白胨4g/L，KH₂PO₄2g/L,和MgSO₄·7H₂O2g/L。

发酵培养使用5 L发酵罐，装液量为3 L，接种量为10% (v/v)，发酵温度为28℃，转速为300 rpm，通空气量1 vvm，用5 mol/L的NaOH控制pH值为6.0。采用批式发酵的方式，发酵8d。

实验结果：发酵液中白藜芦醇转化率为99.85%，三萜皂苷产量为898.15±4.23μg/mL，多糖产量为54.57±2.79mg/mL。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 一株桦褐孔菌QD04及其转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 758

<212> DNA

<213> 桦褐孔菌

<400> 1

aaggatcatt atcgagttta ttttgaaatc gaggggcctg tgctggcacg gaaacgttgc 60

atgtgcacgg cctttcgtgc tcaaatccaa ctctcaaacc cctgtgcacc tatacaagtt 120

gaaggtctta gtagtttctg taatcgaacg gcaagtcaag tacgtcgagt aatcaagtac 180

gagggtttcg gcccttggaa agtgtgaaag atggaaaggc aagcttcagg gacaaggaga 240

cgaaaagctt ttggcttcat tacaaacacc aatatacttg ttatgtgaat gaaatgctcc 300

ttgtgggcga taataaatac aactttcaac aacggatctc taggctctcg catcgatgaa 360

gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atccaatctt 420

tgaacgcacc ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc ctgtttgagt gtcatgttaa 480

tctcaaatcg ctcgtctatt cttaattgaa gtggctttcg atttggactt ggaggttttg 540

ctggcccggg cgactttggt tgcccttggt ttgtcggctc ctctcaaata cattagctgg 600

actttggttc gcgtttacgg tgtaataatg taatgttcac taagacgctt gcctaacaag 660

tctgcttcta atagtcctta agttggacaa ggatcccttc attgggcctt cttgacacct 720

ttgacctcaa atcacgtagg attacccgct gaacttaa 758

Claims

1.一株桦褐孔菌QD04，其特征在于：其分类命名为桦褐孔菌 Inonotus obliquus，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2015036；所述QD04的菌落呈圆形，初始时为绒毛状，后变为棉絮状，具有同心轮纹；菌丝无色透明，具有隔膜，树状分支较多，呈现交叉网状，菌丝前端较齐短；

所述桦褐孔菌QD04能将虎杖中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。

2.权利要求1所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，其特征在于它包括以下步骤：

2）发酵培养：将所述种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为按照体积比5%～15%，摇床转速为100～200rpm，温度20~30℃，培养时间为8~12 d，发酵产物中含有所述白藜芦醇、三萜皂苷和多糖；

所述发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和诱导物，所述碳源包括添加量占培养基质量体积比为0.5~8.0%的虎杖；所述氮源的添加量占培养基质量体积比为0.5~2.5%，所述诱导物为占培养基质量体积比为0.5~4.0%的麸皮。

3.根据权利要求2所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，其特征在于：所述种子培养基的组分包括葡萄糖1~3%、蛋白胨0.5~2.0%、KH₂PO₄0.2~0.4%、MgSO₄•7H₂O 0.1~0.3%和麸皮0.5~2%，按质量体积百分比计。

4.根据权利要求2所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，其特征在于：所述碳源还包括添加量占培养基质量体积比为0.5~2.0%的补充碳源，所述补充碳源为麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖或玉米粉中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，其特征在于：所述氮源为蛋白胨、黄豆粉、豆粕、牛肉膏、酵母膏或 (NH₄)₂SO₄中的一种或几种。

6.根据权利要求2所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，其特征在于：所述无机盐为KH₂PO₄ 和MgSO₄•7H₂O，其添加量分别占培养基质量体积比为0.3%和0.15%。

7.根据权利要求2所述的桦褐孔菌QD04转化虎杖生成白藜芦醇、三萜皂苷和多糖的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤3）发酵罐培养：在发酵罐中进行，接种量为按照体积比5%～15%，转速为150～350rpm，温度为20～30℃，发酵过程中通入空气量为0.8～1.5vvm，发酵时间为8~10d。