CN102304530B - 斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及其编码的蛋白质与用途，本发明所提供的鲨烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所示基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因可以通过基因工程技术提高斜生纤孔菌中桦褐孔菌醇的含量，可用于利用转基因技术来提高斜生纤孔菌中桦褐孔菌醇含量的研究和产业化中。而这些次生代谢产物在临床上具有巨大的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在斜生纤孔菌中表达的IoHMGR蛋白(斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，Inonotus obliquus3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，IoHMGR)及其核酸序列，是斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及其编码的蛋白质和应用。
背景技术
斜生纤孔菌Inonotus obliquus(Pers.：Fr.)J.Schroet.，俗称蔷甘(chaga)、桦褐孔菌、白桦茸，属于担子菌门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymeno-mycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、褐孔菌属(Inonotus)，主要分布于北纬45°-50°地区，在我国主要生长于吉林、黑龙江、西藏、青海等高海拔山区的桦属树木上，形成显著的黑色瘤状菌核。斜生纤孔菌作为药用真菌具有抗肿瘤、防治艾滋病、抗衰老、增强免疫、防治糖尿病等疗效。其药效作用主要跟斜生纤孔菌中的三萜类化合物桦褐孔菌醇、白桦脂醇等的活性有关。研究发现桦褐孔菌醇在野生斜生纤孔菌原药材中的含量可达0.2％，而人工培养的斜生纤孔菌菌丝体中，桦褐孔菌醇的含量大大降低。随着野生资源的日益枯竭及对药用真菌斜生纤孔菌需求量的日益增加，有必要通过现代生物技术提高人工培养斜生纤孔菌菌丝体桦褐孔菌醇及其前体的含量来满足人们对斜生纤孔菌的需求。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase)，简称HMGR，催化3，羟基，3，甲基戊二酰辅酶A还原为甲羟戊酸，由于该过程不可逆，被认为是异戊二烯生物合成的第一个关键步骤。HMGR对存在于细胞质中的萜类物质的代谢起重要调控作用，作为早期酶类，它决定“碳流”的流向。Schaller等将橡胶树HMG1基因转入烟草，并对该转基因烟草进行研究，结果发现其形态未发生变化，但HMGR的活性增加了4-8倍，且甾醇含量增加了6倍。因此利用现代生物技术将萜类代谢途径关键酶基因导入斜生纤孔菌中，获得转基因的真菌菌株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高桦褐孔菌醇等三萜类物质含量的最佳途径。
在对现有文献的分析中，“Biosci.Biotechnol.Biochem.，2008，72(5)：1333-1339”等报道了从灵芝中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，但至今尚未发现有与本发明主题相同的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及其编码的蛋白质和应用。使其包含所述基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所述的表达载体转化真菌原生质体细胞，以及由转化原生质体产生的所述基因的转基因菌株及其后代，包括菌丝体及发酵液，所获得的转基因菌株将具有显著提高的桦褐孔菌醇等三萜类化合物含量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，为以下核苷酸序列之一：
1)所述基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列；
3)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列其等位基因及衍生的核苷酸序列。
一种斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因编码的蛋白质，具有以下氨基酸之一：
1)所述蛋白质具有SEQ ID No.2中所示的第1-1381位的氨基酸序列；
2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
含有本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因全序列或部分片段的重组载体，均属于本发明的保护范围。这些重组载体包括质粒和真菌表达载体。
含有本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞或一些真菌的原生质体。优选大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或斜生纤孔菌原生质体。
本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的应用，包括用所述的真菌表达载体转化斜生纤孔菌原生质体；斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因序列提供一种转基因斜生纤孔菌菌株。
具体解释说明如下：
本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.1中从核苷酸第1-4146位的核苷酸序列至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID No.1中从核苷酸第1-4146位的核苷酸序列杂交。
所述的编码具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列的多肽。
所述的序列具有SEQ ID No.1中从核苷酸第1-4146位的核苷酸序列。
本发明分离出的斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主原生质体，它是真核细胞。该宿主原生质体包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-4146位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-4146位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第1-4146位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-4146位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-4146位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白相同功能的蛋白的SEQ IDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白或多肽”指具有斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1.保守性变异多肽中的取代残基
本发明还包括斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶或多肽的类似物。这些类似物与天然斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白多肽时，可以将斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明中宿主细胞为原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、斜生纤孔菌原生质体和其它真菌原生质体。
本发明还可用Northern印迹法技术分析斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因产物的表达，即分析斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶同源基因或同源蛋白。
为了得到与斜生纤孔菌Io-HMGR蛋白基因相关的斜生纤孔菌cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选斜生纤孔菌cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自斜生纤孔菌的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因家族的核苷酸序列。
本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase PDstide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
其有益效果是：本发明提供的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因是首次从斜生纤孔菌中克隆制备的，可以通过基因工程技术用来提高斜生纤孔菌中三萜类化合物特别是桦褐孔菌醇的含量，而这些次生代谢产物在临床上具有抗肿瘤、防治艾滋病等潜在的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1(斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆)
1.组织分离(isolation)
斜生纤孔菌来源于江苏省药用植物生物技术重点实验室，菌液培养收集菌丝体后，立即置于液氮中冷冻保存。
2.RNA的分离(RNA isolation)
取冷冻菌丝体，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL DS管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL DS管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根据一些真菌HMGR的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用染色体步移法(TaKaRa Genome walking kit)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行：
(1)保守区序列扩增
斜生纤孔菌RNA反转录成cDNA，然后以此cDNA为模板，以真菌和植物HMGR保守区中的序列设计的简并引物F25’-GATGC[A/T/G/C]ATGGG[G/A]ATGAA[T/C]ATGG-3’和R25’-AC[A/T/C]GT[A/C/G]CC[A/C]ACCTCAAT[N]GA[A/T/G]GG CAT-3’进行PCR得到斜生纤孔菌HMGR的保守区序列共458bp，电泳回收，连接到pMD18-T载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的大型真菌如灵芝(Ganoderma Lucidum)等的HMGR基因的同源性很高，故初步认为它是斜生纤孔菌HMGR基因的保守区序列。
(2)3’方向的染色体步移
根据保守区序列设计3条3’方向的引物，与试剂盒中的P1引物进行三轮PCR扩增获得3端的序列，电泳回收，按上述方法测序。
(3)5’方向的染色体步移
根据保守区序列设计3条5’方向的引物，与试剂盒中的P1引物进行三轮PCR扩增获得5’端的序列，电泳回收，按上述方法测序。
(3)将5’和3’方向的染色体步移结果比序并进行拼接，得到全基因序列信息，通过内含子分析软件获得4个内含子序列，并设计一对特异引物IoHMGRF1：5’-ATGCGCGCATTACTGCGCCCTT-3’(SEQ ID NO.3)和IoHMGRR1：5’-TCATTCTTTATTATCATCCACT-3’(SEQ ID NO.4)，以内生纤孔菌cDNA为模板进行PCR扩增IoHMGR编码区得到IoHMGR编码区(4146bp)。电泳回收，克隆，测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。
实施例2(斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的序列信息与同源性分析)
本发明新的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因编码区序列的长度为4146bp，详细序列见SEQ ID NO.1。根据全长编码区序列推导出斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的氨基酸序列，共1381个氨基酸残基，分子量147.44kDa，pI为8.92。详细序列见SEQ ID NO.2。
将斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与灵芝3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(GenBank Accession No.EU263989.1)在核苷酸水平上具有72％的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它与灵芝3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(GenBank Accession No.ABY84848.1)有49％的相同性和63％的相似性(见表3)。
表2.本发明的斜生纤孔菌Io-HMGR与灵芝(Ganoderma lucidum)G1-HMGR的核苷酸序列的同源比较(GAP)表
其中：Query表示Io-HMGR的核酸序列；Subject表示灵芝G1-HMGR的核酸序列(GenBankAccession No.EU263989.1)。
结果：在1232个核苷酸的比对中两者有72％的相似性。
表3.本发明的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶Io-HMGR与灵芝3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶G1-HMGR氨基酸序列的同源比较(FASTA)表
其中：Query表示斜生纤孔菌Io-HMGR的氨基酸序列；Subject表示灵芝G1-HMGR的氨基酸序列(GenBank Accession No.ABY84848.1)；相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
结果：在1308个氨基酸的比对中，两者分别有49％的相同性和63％的相似性。
实施例3(斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯)
在该实施例中，将全长的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
1、原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌
根据斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-Io-HMGR表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-Io-HMGR。
2、表达Trx-Io-HMGR重组蛋白的工程菌的分离鉴定
挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-Io-HMGR工程菌于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养2、4、6、8小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，1000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-Io-HMGR融合蛋白的工程菌。
3、Trx-Io-HMGR融合蛋白的提取纯化
按上述方法诱导表达Trx-Io-HMGR融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-Io-HMGR，经离心沉淀收集菌体，磷酸盐缓冲液(50mmol/LPBS，PBS，pH 7.2)重悬，超声波冰上破碎。12000r/min离心10分钟，取上清过Ni2+-琼脂糖柱(北京卓冠科技有限公司)，取适量洗脱液SDS-PAGE检测。Brandford法测定蛋白含量。
4、纯化的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活力测定
按Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，9：5702～5712)的方法对表达纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶进行酶活力的测定，研究在其作用下3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的能力。反应体系含有0.05M Tris-HCL(pH＝7.5)，5mM DTT，200mM NADPH，300mM 14C标记的乙酰辅酶A(1mCi/mmol)及20mM磷酸葡萄糖，每毫升9.75mU磷酸葡萄糖脱氢酶用于NADPH的再生，总体积为100ul.反应流程如下：首先加入400mg蛋白质37℃水浴5分钟.然后加入20ml 6N的HCL终止反应，混合物再37℃水浴15分钟，使3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成甲羟戊酸。反应终产物和酶作用物在Bio-Rex 5柱子上分离，反应终产物可从柱子中水洗下来。可用液体闪烁记数器测定14C标记的反应终产物的含量。结果表明，表达的蛋白的确具有催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸的酶活性。
实施例4(斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶或多肽在斜生纤孔菌中进行真核表达及转基因斜生纤孔菌中桦褐孔菌醇含量测定)
含目的基因(斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因)的表达载体的构建，根据斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的全长序列(SEQ ID NO.1)设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因cDNA克隆至pV2，构建成表达载体pV2-Io-HMGR。在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，与pAN7-1质粒一起通过PEG-CaCl2介导转入斜生纤孔菌的原生质体中。利用PEG-CaCl2介导斜生纤孔菌原生质体的遗传转化：
1)将准备好的斜生纤孔菌新鲜的原生质体悬浮于适量的MTC buffer中，使每mL悬浮液中原生质体保持在106个，分别取100μL原生质体于2个无菌的1.5mL的离心管中，一管加入各10μg的质粒pV2-Io-HMGR和pAN7-1，另一管不加质粒，加入相同体积的0.6mol/L甘露醇作对照。混匀后于冰上预冷5min；
2)各加入25μL PEG-CaCl2缓冲液，轻轻混匀后冰上放置60min，然后补加0.6mL 40％PEG溶液，室温放置30min，再加入0.4mL STC缓冲液，室温放置30min。
3)将转化后原生质体转移到无菌的10mL离心管，补加1ml 0.6mol/L甘露醇，然后将混合物悬浮于4mlRCM液体再生培养基中，27℃下培养48h。
4)将培养物在离心机中以3000rpm/min离心5min后，余2mL涂布在含80μg/mL潮霉素的RCM平板上，27℃恒温培养箱静置培养10-14天。通过潮霉素筛选和PCR鉴定的转化子传代后收集菌丝体，放入冷冻干燥机中进行干燥，称重，贮存于-70℃备用。
5)转斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的转基因斜生纤孔菌的桦褐孔菌醇含量测定。
按Du等(Du，2010)的方法对过表达斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的转基因斜生纤孔菌菌丝体进行桦褐孔菌醇含量测定。结果表明：在过表达斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的转基因斜生纤孔菌菌丝体中桦褐孔菌醇含量同非转基因对照上的相比最高提高了1.9倍。因此转基因结果证明：斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因对促进桦褐孔菌醇含量的提高有明显作用。斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因可用于利用转基因技术来提高桦褐孔菌醇含量的研究和产业化中。
Claims (5)
1.一种斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列由SEQ ID NO.1中第1-4146位的核苷酸序列所构成。
2.一种斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，其特征在于：所述还原酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.2中第1-1381位的氨基酸序列所构成。
3.一种含有权利要求1所述的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的质粒。
4.一种含有权利要求1所述的斜生纤孔菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的真菌表达载体。
5.一种用权利要求4所述的真菌表达载体转化斜生纤孔菌原生质体的方法。
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