CN101250541B

CN101250541B - 丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1及其编码的蛋白质和应用

Info

Publication number: CN101250541B
Application number: CN2008100357189A
Authority: CN
Inventors: 开国银; 王敬; 张�林; 董彦君; 周根余
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2008-04-08
Filing date: 2008-04-08
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2028-04-08
Also published as: CN101250541A

Abstract

本发明公开了一种丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1及其编码的蛋白质与用途，填补了从我国传统名贵中药材丹参中分离克隆出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的空白。本发明所提供的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1由SEQ ID No.1所示的第294-2438位的核苷酸序列构成。所述基因编码的蛋白质由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列构成。本发明提供的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1对于通过基因过量表达技术来提高丹参中丹参酮的含量具有显著作用，可用于丹参药材的品质改良，具有很好的应用前景。

Description

丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及在丹参中表达的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国的一种传统中药材。现代药理研究表明，丹参对心血管系统和血液系统的作用十分显著。以丹参为主的多种复方制剂如复方丹参注射液、复方丹参片、复方丹参胶囊和复方丹参滴丸(1997年向美国FDA以治疗药身份申报的品种)等已被广泛用于临床治疗心血管疾病、肾病、肝病及抗感染等。但是，由于丹参生长周期较长(2年以上)，在传统的栽培模式下，面临着品质严重退化、生产成本相对过高等诸多弊端；离体条件下产生的丹参组培苗，其药用活性成分的含量还远达不到商业化开发利用的要求。所以，利用现代基因工程手段将丹参药用活性成分生物合成途径中的关键酶基因导入到丹参中，获得转基因的发根、细胞系或再生植株，并进行大规模的培养，是提高丹参中丹参酮的含量和解决丹参药源问题的最佳途径之一。

丹参酮类化合物(如丹参酮I、丹参酮II A及隐丹参酮等)属于二萜化合物，最新研究表明二萜化合物主要是通过1-去氧木糖-5-磷酸(DXP)途径都来提供关键前体物质。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS)是DXP途径中的第一步催化酶，也是第一个关键性的限速酶，能以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为前体，在焦磷酸硫胺素存在的情况下，催化生成关键前体5-磷酸脱氧木酮糖(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate)(DXP)，DXP在再经过一系列催化步骤衍变生成丹参酮类化合物。从而为丹参酮的合成提供前体。因此，DXS是丹参酮类化合物代谢工程的首要调控靶点。提高1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1的活性或者含量，可以直接提高丹参中丹参酮的含量。

在对现有文献的分析中，“The Plant Journal(植物杂志)2000，22：503-513”报道了从番茄中分离克隆出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因，但至今尚未有从我国特有的药用植物丹参中分离克隆出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的文献报道。由于这个基因编码的酶对于丹参丹参酮的合成具有重要影响，因此，这一步是利用基因工程技术来提高丹参丹参酮合成的重要切入点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明所提供的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1(SmDXS1)，由SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列的第294-2438位构成。

丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1编码的蛋白质(SmDXS1)，由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列构成。

含有上述丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1完整编码阅读框序列的重组载体，均属于本发明的保护范围。这些重组载体包括质粒和植物表达载体。

含有上述丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、丹参细胞或丹参发根细胞。

所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、丹参细胞或丹参发根细胞。

优选的宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或丹参发根细胞。

上述丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的应用，包括用所述重组载体，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化丹参细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与丹参细胞共培养，得到转基因的丹参发根系；或者用所述的丹参发根细胞再生丹参植株；或者用所述的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1遗传转化获得转基因丹参植株。

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下：

本发明所说的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的DNA分子为编码具有丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1活性的多肽的核苷酸序列，由SEQ ID NO.1中从核苷酸第294-2438位的核苷酸序列构成。还可以是与SEQ ID NO.1中从核苷酸第294-2438位的核苷酸序列有至少70％的同源性的核苷酸序列；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第294-2438的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明分离出的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1多肽为SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽。还可以包括上述多肽的保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中术语“丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(或多肽)基因1”指：编码具有丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第294-2438位核苷酸序列。还可包括其简并序列，该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第294-2438位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第294-2438位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第294-2438位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第294-2438位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1相同功能的蛋白的SEQ IDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明中术语“丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1或多肽”指：具有丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。

本发明的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1多肽的血清获得的多肽或蛋白。

本发明中丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1保守性变异多肽指：与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1.保守性变异多肽中的取代残基

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg	Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg	Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile	Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile	Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu	Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu	Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala	Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala	Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser	Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1或多肽的类似物。这些类似物与天然1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1多肽时，可以将丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

本发明还可用Northern印迹法技术分析丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1产物的表达，即分析丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1的RNA转录物在细胞中的存在和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1同源基因或同源蛋白。

为了得到与丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1相关的丹参cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选丹参cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自丹参的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的基因家族的核苷酸序列。

本发明的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1，通过各种常规筛选方法，可筛选出与丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。

本发明提供的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1是首次从丹参中克隆制备的，可以通过基因工程技术用来提高丹参等植物中丹参酮的含量。转基因结果显示，丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1对促进丹参酮含量的提高有明显作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1(丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的克隆)

1.组织分离(isolation)

丹参植株来源于河南，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据金鱼草，薄荷等DXS基因氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)5’-RACE

PCR(UPM+R2)得到DXS1R2’(721bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1(如穿心莲1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1等)的同源性很高，故初步认为它是一个1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1。

(2)3’RACE

根据5’RACE结果，设计正向特异引物F2，经PCR(UPM+F2)得到DXS1F2’(1890bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。

(3)将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1编码区(DXS1KF1+DXS1KR1)得到DXS1编码区(2145bp)(过程同步骤(1))。BLAST的结果证明从丹参中新得到的基因确为一个1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的丹参DXS1蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物DXS1F1：5’-GGTTACTGATCTGTCCTCTGTAA-3’(SEQ ID NO.3)为正向引物，寡核苷酸DXS1R1：5’-AGACAAGCTGAAGCTAACACTAT-3’(SEQ ID NO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、60℃1分钟和72℃3分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为2498bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。

实施例2(丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的序列信息与同源性分析)

本发明新的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1全长cDNA的长度为2519bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于294-2438位核苷酸。根据全长cDNA推导出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的氨基酸序列，共714个氨基酸残基，分子量175.89KD，pI为4.91，详细序列见SEQ ID NO.2。将丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与穿心莲DXS基因1(GenBank Accession No.AY254390)具有81％的同源性(见表2)；在氨基酸水平上，它与穿心莲DXS1(GenBankAccession No.AAP14353)的第1-678位氨基酸残基有88％的相同性和93％的相似性(见表3)。由上可见，丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1与穿心莲1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。故可以认为丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1在提高资源植物中丹参酮的含量上也具有促进作用。

表2.本发明的丹参DXS1与穿心莲(Andrographis paniculata)DXS1的核苷酸序列的同源比较(GAP)表

Query 368 TCAGTGGCTACATGGTG-CAGATCTACCAT-TTCACCCCT-TCTGCAAGAACAGTCAGAT 424

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Sbjct 358 TCAGTGGCTACATGG-GATAGATCT-GCATCCTCA-CCATACCTGCAAGAACAATCAGGT 414

Query 425 TAGGAAAAGCTCTACAGGAATTTGTGCAACACTGTCTGAAAGAGGGGAATACTTCTCACA 484

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Sbjct 415 AAGGAAAAGGTCAAGTGGAATTT-TGCATCATTGGCAGAAAGAGGAGAATATTTCTCAGA 473

Query 485 -AAAGCCTCCAACTCCCCTTTTAGACACAATCAACTATCCAATTCACATGAAAAACCTCT 543

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Sbjct 474 GAAA-CCTCCAACTCCTCTTTTGGACACTATCGATTACCCAATTCACATGAAGAATCTCT 532

Query 544 CCACTAAGGAACTGCAA-CAACTCGCCGACGA-ACTGCGGTCCGACGTCATCTTCAACGT 601

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Sbjct 533 CCACAAAGGAACTG-AAGCAGCTTGCTGACGAGCCT-CGATCGGATGTTATCTTCAATGT 590

Query 602 GTCCAAGACTGGGGGTCACCTGGGATCAAGCCTTGGTGTGATTGAGCTAACCGTGGCTCT 661

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Sbjct 591 CTCCAAGACAGGGGGCCATCTTGGTTCGAGTCTTGGTGTAATTGAGCTAACTGTGGCTAT 650

Query 662 TCATTACGTGTTCAATGCTCCTCAAGATCGAATTCTGTGGGATGTTGGCCACCAGGCTTA 721

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Sbjct 651 CCATTATGTGTTCAATGCTCCTCAGGATAGAATTCTTTGGGATGTTGGCCATCAGTCTTA 710

Query 722 TCCACACAAGATTC-TGACAGGAAGAA-GAGACAGGATGCCGAGTTTAAGACAGACCGGT 779

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Sbjct 711 TCCACATAA-AATCTTAACTGGAAGAAGGA-ACATGATGCCAACCTTGAGACAGACAGAT 768

Query 780 GGCCTCTCTGG-TTTCACGAAGCGGTCTGAGAGCGACTACGACTGCTTTGGCGCCGGTCA 838

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Sbjct 769 GGGCTTTGTGGCTTT-ACCAAGAGGTCTGAGAGCAACTATGATTGCTTCGGCGCTGGTCA 827

Query 839 CAGTTCCACAACTATCTCTGCAGGACTAGGAATGGCTGTGGGGAGGGATCTGAAAGGAAG 898

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Sbjct 828 CAGTTCGACAACGATTTCTGCAGGGTTAGGAATGGCTGTGGGAAGGGATCTTCAAGGGAG 887

Query 899 AAAGGA-CAACGTCGTGGCTGTGATAGGCGACGGGGCTATGACAGCTGGTCAGGCCTATG 957

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Sbjct 888 AAAGAATC-ATGTCGTGGCCGTGATAGGGGATGGTGCTATGATAGCCGGCCAGGCTTATG 946

Query 958 AGGCAATGAACAATGCTGGCTACCTGGACTCGGACATGATTGTTATTCTCAATGACAATA 1017

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Sbjct 947 AAGCAATGAATAATGCTGGCTACCTGGATTCAGACATGATCGTGATTCTTAATGACAACA 1006

Query 1018 AGCAAGTTTCCTTGCCTACTGCCAATC-TGGATGG-GCCAACTGCTCCCGTGGGAGCCTT 1075

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Sbjct 1007 AACAGGTTTCCTTACCCACGGCTAA-CTTAGATGGCCCCATC-CCTCCAGTAGGAGCCTT 1064

Query 1076 GAGCAGTGCTTTGAGTAGGTTGCAGTCGAACCGGCCTCTCAGAGAGCTAAGGGAAGTCGC 1135

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Sbjct 1065 GAGTAGTGCTTTGAGCAGGCTGCAGTCAAATCGGCCACTCAGAGAACTAAGAGAAGTTGC 1124

Query 1136 GAAGGGAGTCACCAAGCAGATCGGAGGGCCTATGCACGAGCTT-GCTGCAAAAGTCGATG 1194

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Sbjct 1125 CAAGGGAGTTACCAAGCAAATCGGAGGATCGATGCATGAG-TTAGCTGCAAAAGTCGATG 1183

Query 1195 AGTATGCTCGTGGGCTGATCAGTGGCTCTGGATCAACACTCTTTGAAGAGCTCGGGCTTT 1254

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Sbjct 1184 AATATGCTCGCGGGCTGATCAGTGGTTCAGGATCAACACTGTTTGAGGAGCTAGGGCTTT 1243

Query 1255 ACTACATCGGTCCAGTTGATGGTCACAATC-TTGATGACCTGACAGCGATTCACAGAGAG 1313

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Sbjct 1244 ATTACATTGGTCCAGTTGATGGCCACAA-CATTGATGATCTGACTGCAATTCTTAAAGAA 1302

Query 1314 GTCAAGAGTACTAAAACGACGGGTCCGGTGTTGATCCATGTTGTGACTGAGAAAGGCAGA 1373

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Sbjct 1303 GTCAAGAGTACCAAGACAACAGGTCCAGTGTCGATCCATGTTGTAACCGAGAAAGGCCGA 1362

Query 1374 GGATATCCTTATGCAGAGAAAGCTGCAGATAAATACCATGGAGTGACCAAGTTCGATCCA 1433

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Sbjct 1363 GGATATTCATACGCTGAAAAAGCTGCAGACAAATACCATGGTGTGGCAAAGTTTGATCCA 1422

Query 1434 GCAACGGGGAAGCAGTTTAAATCGAGTGCTCCAACTCAGCCTTACACAACCTACTTTGCT 1493

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Sbjct 1423 GCAACTGGAAAACAATTCAAATCGAGCACTCCGACTCAGGCTTACACAACCTACTTTGCA 1482

Query 1494 GAGGCCCTGATTGCAGAAGCTGAAGTAGACAAGGA-TATCGTAGCAATCCATGCAGCAAT 1552

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Sbjct 1483 GAGGCGTTGATTGCAGAAGCAGAACAAGACAA-TATTATTGTAGCGATACATGCCGCAAT 1541

Query 1553 GGGAGGTGGG-A-CGGGTTTGAACCTCTTCCAACGCCGTTTCCCAACGAGGTGTTTCGAT 1610

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Sbjct 1542 GGGTGG-GGGAACCGGG-TTAAACCTTTTTGATCGTCGTTTCCCAACCAGGTGTTTTGAT 1599

Query 1611 GTTGGGATAGCAGAACAGCATGCTGTGACTTTTGCTGCAGGTTTGGCCTGTGAAGGGATC 1670

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Sbjct 1600 GTTGGGATAGCAGAACAGCATGCTGTAACTTTTGCCGCAGGTTTGGCATGTGAAGGCCTC 1659

Query 1671 AAGCCCTTCTGTGCAATCTACTCATCCTTCTTGCAACGAGGCT-ACGACCAGGTAGTGCA 1729

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Sbjct 1660 AAACCCTTCTGTGCAATCTACTCGTCTTTCTTGCAAAGAG-CTTACGACCAGGTGGTGCA 1718

Query 1730 CGACGTGGATTTGCAGAAGCTGCCGGTTAGGTTTGCTATGGACAGAGCCGGCTTGGT-GG 1788

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Sbjct 1719 CGATGTTGACCTGCAGAAGCTCCCAGTCAGGTTCGCAATGGACAGAGCAGGTTTAGTCGG 1778

Query 1789 GAGCGGATGGCCCGACACATTGTGGAGCTTTTGATGTTACAT-TCATGGCATGCCTTCCC 1847

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Sbjct 1779 G-GCAGACGGACCTACACATTGTGGGGCATTCGACATTACTTAT-ATGGCTTGCCTTCCC 1836

Query 1848 AACATGGTGGTGATGGCTCCTTCAGATGAGGCTGAATTGTTTAACATGGTTGCAACTGCT 1907

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Sbjct 1837 AACATGGTGGTTATGGCTCCTGCAGACGAAGCTGAACTGTTTCACATGGTTGCCACTGCT 1896

Query 1908 GCAGCTATAGACGACAGACCAAGCTGCTTCCGTTATCCAAGAGGCAACGGTATAGGTGTG 1967

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Sbjct 1897 GCTGCCATTGATGACAGACCGAGCTGTTTCAGATATCCCAGAGGCAACGGGATTGGCGTA 1956

Query 1968 GAGTTGCCGCCCGGAAACAAAGGCAAACCCCTCGAGATTGG-AAAGGGCCGTATACTAAT 2026

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Sbjct 1957 GAGCTCCCACCTGGAAACAAAGGCATACCCCTTGAGATTGGCAAAGGGC-GAATACTTCT 2015

Query 2027 TGAAGGGGAGAGGGTGGCTCT-CTTGGGTTATGGATCAGCAGTTCAGAGCTGTTTGGCTG 2085

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Sbjct 2016 CGAGGGGGAGAGAGTGGCTCTGCTCGGCT-ATGGAACAGCAGTTCAGAGCTGTATGACTG 2074

Query 2086 CAGCTGC-CT--TGGTAGAAACCCGCGGTTTACAGTTGACAGTAGCCGATGCTCGTTTCT 2142

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Sbjct 2075 CAGCAGCACCAATGG-AGC--CCCATGGTTTACAGTTGACAGTGGCTGATGCACGCTTCT 2131

Query 2143 GTATGCCATTGGATCATGCTCTTATTCGGAGCTTGGCCAAA-TCACACGAGGTCTTGATC 2201

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Sbjct 2132 GCAAGCCGTTGGACCAAGGTCTTATCCGCAGGTTAGC-AAACTCACATGAAGTCTTGATC 2190

Query 2202 ACTGTGGAAGAAGGGTCAATTGGTGGTTTTGGATCTCATGTAGCTCACTTCATGGCCTTG 2261

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Sbjct 2191 ACTGTCGAAGAAGGGGCTGTCGGTGGCTTTGCAGCTCACGTAGCTCAGTTCATGGCCCTC 2250

Query 2262 GATGGCCTCCTTGATGGCAACCTAAAGTGGAGACCA-TTGGTTCTTCCTGATCGATACAT 2320

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Sbjct 2251 GATGGGCTCCTTGACGGCAAATTAAAGTGGAGGCCACTTG-TTCTTCCTGACCGATACAT 2309

Query 2321 CGACCATGGAGCCCCGGTGGATCAACTGATGGAAGCAGGACTCACGCCTTCAC-ACATCG 2379

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Sbjct 2310 CGACCATGGATCCCCGGCAGACCAATTGATGGAAGCAGGCCTGACATCT-CACCATATCG 2368

Query 2380 CGGCGACTGTCTTT-AATATTCTAGGAAAAGCTAGGGAGGCTCTGGAAATTATGTCATAG 2438

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Sbjct 2369 CGGCCACTGT-TTTCAACATACTAGGGAAAGCTAGAGAAGCCCTGCAGATTATGTCCTAG 2427

Query 2439 ATCG-AAGA-GCTGTACAAAA--AACAACAAACTC-TGAAATA-TAGTGTTAGCTTCA-G 2491

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Sbjct 2428 GTTGCAAGAAG-TGTACATATTTAAGAACATA-TGATGAA-TCCTAGCATGAGCCTCATG 2484

Query 2492 CTTGTCTaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 2519

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Sbjct 2485 AT-GACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 2511

其中：Query表示丹参DXS1的核酸序列；Subject表示穿心莲DXS1的核酸序列(GenBankAccession No.AY254390)。结果：在2519个核苷酸的比对中两者有81％的相似性。

表3.本发明的丹参的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1与穿心莲的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1氨基酸序列的同源比较(FASTA)表

Query 37 PFCKNSQIRKSSTGICATLSERGEYFSQKPPTPLLDTINYPIHMKNLSTKELQQLADELR 96

P+ + ++ A+L+ERGEYFS+KPPTPLLDTI+YPIHMKNLSTKEL+QLADE R

Sbjct 14 PYLQEQSGKEKVKWNFASLAERGEYFSEKPPTPLLDTIDYPIHMKNLSTKELKQLADEPR 73

Query 97 SDVIFNVSKTGGHLGSSLGVIELTVALHYVFNAPQDRILWDVGHQAYPHKILTGRRDRMP 156

SDVIFNVSKTGGHLGSSLGVIELTVA+HYVFNAPQDRILWDVGHQ+YPHKILTGRR+ MP

Sbjct 74 SDVIFNVSKTGGHLGSSLGVIELTVAIHYVFNAPQDRILWDVGHQSYPHKILTGRRNMMP 133

Query 157 SLRQTGGLSGFTKRSESDYDCFGAGHSSTTISAGLGMAVGRDLKGRKDNVVAVIGDGAMT 216

+LRQT GL GFTKRSES+YDCFGAGHSSTTISAGLGMAVGRDL+GRK++VVAVIGDGAM

Sbjct 134 TLRQTDGLCGFTKRSESNYDCFGAGHSSTTISAGLGMAVGRDLQGRKNHVVAVIGDGAMI 193

Query 217 AGQAYEAMNNAGYLDSDMIVILNDNKQVSLPTANLDGPTAPVGALSSALSRLQSNRPLRE 276

AGQAYEAMNNAGYLDSDMIVILNDNKQVSLPTANLDGP PVGALSSALSRLQSNRPLRE

Sbjct 194 AGQAYEAMNNAGYLDSDMIVILNDNKQVSLPTANLDGPIPPVGALSSALSRLQSNRPLRE 253

Query 277 LREVAKGVTKQIGGPMHELAAKVDEYARGLISGSGSTLFEELGLYYIGPVDGHNLDDLTA 336

LREVAKGVTKQIGG MHELAAKVDEYARGLISGSGSTLFEELGLYYIGPVDGHN+DDLTA

Sbjct 254 LREVAKGVTKQIGGSMHELAAKVDEYARGLISGSGSTLFEELGLYYIGPVDGHNIDDLTA 313

Query 337 IHREVKSTKTTGPVLIHVVTEKGRGYPYAEKAADKYHGVTKFDPATGKQFKSSAPTQPYT 396

I +EVKSTKTTGPV IHVVTEKGRGY YAEKAADKYHGV KFDPATGKQFKSS PTQ YT

Sbjct 314 ILKEVKSTKTTGPVSIHVVTEKGRGYSYAEKAADKYHGVAKFDPATGKQFKSSTPTQAYT 373

Query 397 TYFAEALIAEAEVDKDIVAIHAAMGGGTGLNLFQRRFPTRCFDVGIAEQHAVTFAAGLAC 456

TYFAEALIAEAE D IVAIHAAMGGGTGLNLF RRFPTRCFDVGIAEQHAVTFAAGLAC

Sbjct 374 TYFAEALIAEAEQDNIIVAIHAAMGGGTGLNLFDRRFPTRCFDVGIAEQHAVTFAAGLAC 433

Query 457 EGIKPFCAIYSSFLQRGYDQVVHDVDLQKLPVRFAMDRAGLVGADGPTHCGAFDVTFMAC 516

EG+KPFCAIYSSFLQR YDQVVHDVDLQKLPVRFAMDRAGLVGADGPTHCGAFD+T+MAC

Sbjct 434 EGLKPFCAIYSSFLQRAYDQVVHDVDLQKLPVRFAMDRAGLVGADGPTHCGAFDITYMAC 493

Query 517 LPNMVVMAPSDEAELFNMVATAAAIDDRPSCFRYPRGNGIGVELPPGNKGKPLEIGKGRI 576

LPNMVVMAP+DEAELF+MVATAAAIDDRPSCFRYPRGNGIGVELPPGNKG PLEIGKGRI

Sbjct 494 LPNMVVMAPADEAELFHMVATAAAIDDRPSCFRYPRGNGIGVELPPGNKGIPLEIGKGRI 553

Query 577 LIEGERVALLGYGSAVQSCLAAAALVETRGLQLTVADARFCMPLDHALIRSLAKSHEVLI 636

L+EGERVALLGYG+AVQSC+ AAAL+E GLQLTVADARFC PLD LIR LA SHEVLI

Sbjct 554 LLEGERVALLGYGTAVQSCMTAAALMEPHGLQLTVADARFCKPLDQGLIRRLANSHEVLI 613

Query 637 TVEEGSIGGFGSHVAHFMALDGLLDGNLKWRPLVLPDRYIDHGAPVDQLMEAGLTPSHIA 696

TVEEG++GGF +HVA FMALDGLLDG LKWRPLVLPDRYIDHG+P DQLMEAGLT HIA

Sbjct 614 TVEEGAVGGFAAHVAQFMALDGLLDGKLKWRPLVLPDRYIDHGSPADQLMEAGLTSHHIA 673

Query 697 ATVFNILGKAREALEIMS 714

ATVFNILGKAREAL+IMS

Sbjct 674 ATVFNILGKAREALQIMS 691

其中：Query表示丹参DXS1的氨基酸序列；Subject表示穿心莲DXS1的氨基酸序列(GenBankAccession No.AAP14353)；相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。结果：在678个氨基酸的比对中，两者分别有88％的相同性和93％的相似性。

实施例3(丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯)在该实施例中，将全长的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1、原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌

根据丹参DXS1的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将丹参DXS基因1在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-DXS1表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-DXS1。

2、表达Trx-DXS1重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-DXS1工程菌于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-DXS1融合蛋白的工程菌。

3、SmDXS1蛋白的提取纯化及酶活性测定

按上述方法诱导表达Trx-DXS1融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-DXS1，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH 11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集Trx-SmDXS1融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获的SmDXSl的表达蛋白。得到的表达蛋白分子量175.89KD，pI为4.91。按Ge等(Plant Science，2005，168：487-491)的方法对表达纯化的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1进行酶活力的测定，结果表明表达的蛋白的确具有以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为前体，在焦磷酸硫胺素存在的情况下，催化生成5-磷酸脱氧木酮糖的酶活性。

实施例4(丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶1或多肽在丹参中进行真核细胞表达及转基因发根中丹参酮含量测定)

含目的基因(丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1)的表达载体的构建，根据丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的cDNA克隆到双元表达载体(如pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，遗传转化资源植物丹参：

1)发根农杆菌A4。使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜。

2)取生长8周左右的丹参无菌嫩叶片。

3)经过夜培养的菌液，用转化液稀释为100个细菌/mL。取无菌丹参叶片，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化中，60rpm/min振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。

4)把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有100mL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养25天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用。

5)含丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的转基因丹参发根的丹参酮含量测定

按Ge等(Plant Science，2005)的方法对表达丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的转基因发根进行丹参酮含量测定。结果表明，在表达丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的转基因发根中丹参酮含量比非转基因对照组提高1.7倍(P＜0.05)，有显著提高。因此转基因结果证明，丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1对促进丹参酮含量的提高有明显作用，可应用于丹参的品质改良。

核苷酸序列表

<110>上海师范大学

<120>丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1及其编码的蛋白质和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2519

<212>DNA

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza)

<220>

<221>CDS

<222>(294)..(2438)

<400>1

ggttactgat ctgtcctctg taaatgcgcc acccataaag ccatatgcac aaaccaatcc 60

caccaacatt ttgttcctta acaatccctg catttaatcc aagccctcat cattcccatc 120

attttcacac acacacacac agtggctagt gttcttgaga gaagttcaaa aacagagccc 180

acctcaagag ctggtgcatg aacagatagt aaagttggta tcttttttct gggaaatctg 240

caatctttga ttgtttggag tgaaattttg agctgtctat acacacatac aag atg 296

Met

1

gct tta tgc cca ttt gca ttt tct ggg agt tta gta gct gca gat gct 344

Ala Leu Cys Pro Phe Ala Phe Ser Gly Ser Leu Val Ala Ala Asp Ala

5 10 15

caa aag cac acc aat ttc tgc tct cag tgg cta cat ggt gca gat cta 392

Gln Lys His Thr Asn Phe Cys Ser Gln Trp Leu His Gly Ala Asp Leu

20 25 30

cca ttt cac ccc ttc tgc aag aac agt cag att agg aaa agc tct aca 440

Pro Phe His Pro Phe Cys Lys Asn Ser Gln Ile Arg Lys Ser Ser Thr

35 40 45

gga att tgt gca aca ctg tct gaa aga ggg gaa tac ttc tca caa aag 488

Gly Ile Cys Ala Thr Leu Ser Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Ser Gln Lys

50 55 60 65

cct cca act ccc ctt tta gac aca atc aac tat cca att cac atg aaa 536

Pro Pro Thr Pro Leu Leu Asp Thr Ile Asn Tyr Pro Ile His Met Lys

70 75 80

aac ctc tcc act aag gaa ctg caa caa ctc gcc gac gaa ctg cgg tcc 584

Asn Leu Ser Thr Lys Glu Leu Gln Gln Leu Ala Asp Glu Leu Arg Ser

85 90 95

gac gtc atc ttc aac gtg tcc aag act ggg ggt cac ctg gga tca agc 632

Asp Val Ile Phe Asn Val Ser Lys Thr Gly Gly His Leu Gly Ser Ser

100 105 110

ctt ggt gtg att gag cta acc gtg gct ctt cat tac gtg ttc aat gct 680

Leu Gly Val Ile Glu Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val Phe Asn Ala

115 120 125

cct caa gat cga att ctg tgg gat gtt ggc cac cag gct tat cca cac 728

Pro Gln Asp Arg Ile Leu Trp Asp Val Gly His Gln Ala Tyr Pro His

130 135 140 145

aag att ctg aca gga aga aga gac agg atg ccg agt tta aga cag acc 776

Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Arg Met Pro Ser Leu Arg Gln Thr

150 155 160

ggt ggc ctc tct ggt ttc acg aag cgg tct gag agc gac tac gac tgc 824

Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser Asp Tyr Asp Cys

165 170 175

ttt ggc gcc ggt cac agt tcc aca act atc tct gca gga cta gga atg 872

Phe Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Thr Ile Ser Ala Gly Leu Gly Met

180 185 190

gct gtg ggg agg gat ctg aaa gga aga aag gac aac gtc gtg gct gtg 920

Ala Val Gly Arg Asp Leu Lys Gly Arg Lys Asp Asn Val Val Ala Val

195 200 205

ata ggc gac ggg gct atg aca gct ggt cag gcc tat gag gca atg aac 968

Ile Gly Asp Gly Ala Met Thr Ala Gly Gln Ala Tyr Glu Ala Met Asn

210 215 220 225

aat gct ggc tac ctg gac tcg gac atg att gtt att ctc aat gac aat 1016

Asn Ala Gly Tyr Leu Asp Ser Asp Met Ile Val Ile Leu Asn Asp Asn

230 235 240

aag caa gtt tcc ttg cct act gcc aat ctg gat ggg cca act gct ccc 1064

Lys Gln Val Ser Leu Pro Thr Ala Asn Leu Asp Gly Pro Thr Ala Pro

245 250 255

gtg gga gcc ttg agc agt gct ttg agt agg ttg cag tcg aac cgg cct 1112

Val Gly Ala Leu Ser Ser Ala Leu Ser Arg Leu Gln Ser Asn Arg Pro

260 265 270

ctc aga gag cta agg gaa gtc gcg aag gga gtc acc aag cag atc gga 1160

Leu Arg Glu Leu Arg Glu Val Ala Lys Gly Val Thr Lys Gln Ile Gly

275 280 285

ggg cct atg cac gag ctt gct gca aaa gtc gat gag tat gct cgt ggg 1208

Gly Pro Met His Glu Leu Ala Ala Lys Val Asp Glu Tyr Ala Arg Gly

290 295 300 305

ctg atc agt ggc tct gga tca aca ctc ttt gaa gag ctc ggg ctt tac 1256

Leu Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Leu Tyr

310 315 320

tac atc ggt cca gtt gat ggt cac aat ctt gat gac ctg aca gcg att 1304

Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly His Asn Leu Asp Asp Leu Thr Ala Ile

325 330 335

cac aga gag gtc aag agt act aaa acg acg ggt ccg gtg ttg atc cat 1352

His Arg Glu Val Lys Ser Thr Lys Thr Thr Gly Pro Val Leu Ile His

340 345 350

gtt gtg act gag aaa ggc aga gga tat cct tat gca gag aaa gct gca 1400

Val Val Thr Glu Lys Gly Arg Gly Tyr Pro Tyr Ala Glu Lys Ala Ala

355 360 365

gat aaa tac cat gga gtg acc aag ttc gat cca gca acg ggg aag cag l448

Asp Lys Tyr His Gly Val Thr Lys Phe Asp Pro Ala Thr Gly Lys Gln

370 375 380 385

ttt aaa tcg agt gct cca act cag cct tac aca acc tac ttt gct gag 1496

Phe Lys Ser Ser Ala Pro Thr Gln Pro Tyr Thr Thr Tyr Phe Ala Glu

390 395 400

gcc ctg att gca gaa gct gaa gta gac aag gat atc gta gca atc cat 1544

Ala Leu Ile Ala Glu Ala Glu Val Asp Lys Asp Ile Val Ala Ile His

405 410 415

gca gca atg gga ggt ggg acg ggt ttg aac ctc ttc caa cgc cgt ttc 1592

Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Leu Asn Leu Phe Gln Arg Arg Phe

420 425 430

cca acg agg tgt ttc gat gtt ggg ata gca gaa cag cat gct gtg act 1640

Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr

435 440 445

ttt gct gca ggt ttg gcc tgt gaa ggg atc aag ccc ttc tgt gca atc 1688

Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly Ile Lys Pro Phe Cys Ala Ile

450 455 460 465

tac tca tcc ttc ttg caa cga ggc tac gac cag gta gtg cac gac gtg 1736

Tyr Ser Ser Phe Leu Gln Arg Gly Tyr Asp Gln Val Val His Asp Val

470 475 480

gat ttg cag aag ctg ccg gtt agg ttt gct atg gac aga gcc ggc ttg 1784

Asp Leu Gln Lys Leu Pro Val Arg Phe Ala Met Asp Arg Ala Gly Leu

485 490 495

gtg gga gcg gat ggc ccg aca cat tgt gga gct ttt gat gtt aca ttc 1832

Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly Ala Phe Asp Val Thr Phe

500 505 510

atg gca tgc ctt ccc aac atg gtg gtg atg gct cct tca gat gag gct 1880

Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met Ala Pro Ser Asp Glu Ala

515 520 525

gaa ttg ttt aac atg gtt gca act gct gca gct ata gac gac aga cca 1928

Glu Leu Phe Asn Met Val Ala Thr Ala Ala Ala Ile Asp Asp Arg Pro

530 535 540 545

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Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly Ile Gly Val Glu Leu Pro

550 555 560

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Pro Gly Asn Lys Gly Lys Pro Leu Glu Ile Gly Lys Gly Arg Ile Leu

565 570 575

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Ile Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly Tyr Gly Ser Ala Val Gln

580 585 590

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Ser Cys Leu Ala Ala Ala Ala Leu Val Glu Thr Arg Gly Leu Gln Leu

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Ser Ile Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala His Phe Met Ala Leu Asp

645 650 655

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Gly Leu Leu Asp Gly Asn Leu Lys Trp Arg Pro Leu Val Leu Pro Asp

660 665 670

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Arg Tyr Ile Asp His Gly Ala Pro Val Asp Gln Leu Met Glu Ala Gly

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Leu Thr Pro Ser His Ile Ala Ala Thr Val Phe Asn Ile Leu Gly Lys

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<213>丹参(Salvia miltiorrhiza)

<400>2

Met Ala Leu Cys Pro Phe Ala Phe Ser Gly Ser Leu Val Ala Ala Asp

1 5 10 15

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20 25 30

Leu Pro Phe His Pro Phe Cys Lys Asn Ser Gln Ile Arg Lys Ser Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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210 215 220

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245 250 255

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275 280 285

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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645 650 655

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660 665 670

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<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza)

<400>3

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<211>23

<212>DNA

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza)

<400>4

AGACAAGCTG AAGCTAACAC TAT

Claims

1.一种丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1，其特征在于，所述基因由SEQ ID No.1所示的第294-2438位核苷酸序列构成。

2.权利要求1所述的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成。

3.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的完整编码阅读框序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求1所述的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1的完整编码阅读框序列。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、丹参发根细胞或丹参细胞。

6.权利要求1所述的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1应用于制备转基因丹参植株。

7.权利要求1所述的丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因1应用于制备转基因丹参发根系。