CN101012462B

CN101012462B - 萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列

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Publication number: CN101012462B
Application number: CN200610095201A
Authority: CN
Inventors: 廖志华; 陈敏; 谌容
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2026-11-14
Also published as: CN101012462A

Abstract

一种萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。包括：编码具有色氨酸脱羧酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列杂交。本发明对提高利血平等萜类吲哚生物碱含量具有明显的作用，本发明具有很大的应用价值。

Description

萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。

背景技术

高血压是严重危害人类健康的疾病，我国已成为世界上高血压危害最严重的国家。据中国疾病预防控制中心健康教育所公布的最新居民营养与健康状况调查结果显示：中国内地高血压患病人数已达一亿六千万，因而对降压药物，尤其是天然降压药物的需求十分巨大。萝芙木(Rauvolfia verticillata)是夹竹桃科萝芙木属的一种重要的药用植物，为中国特有。它的根中含有利血平(reserpine)、阿吗碱(ajmalicine)和利血胺(rescinnamine)等多种药用萜类吲哚生物碱(TIAs)，其中利血平是目前应用最广泛的抗高血压药物之一。由于天然萝芙木资源有限，其药用部位根中药用生物碱含量很低，使得萝芙木野生资源遭到严重破坏，因而，寻找新的药源十分必要。植物次生代谢途径，分子生物学的飞速发展和植物生物技术的曰趋成熟，使得利用基因工程获得萝芙木中天然降压药物利血平成为可能。

利血平等萜类吲哚生物碱生物合成共同的最要前体物质是色氨酸的衍生物色胺(Tryptamine)以及萜类衍生物裂环马钱子苷(Secologanin)的缩合生成3α(S)-异胡豆苷，异胡豆苷是TIAs的普遍的前体物质，其他的种属特异性的酶和自发的转化反应决定了之后生成的各种TIAs的最终形式。而色胺来源于莽草酸途径，由色氨酸脱羧酶(Tryptophandecarboxylase，TDC)催化色氨酸脱羧生成，是TIAs的重要前体之一，色氨酸脱羧酶催化的这一步反应是TIAs生物合成上游途径中的一步关键步骤。可以推断，要提高萝芙木中利血平的含量，色氨酸脱羧酶将会是一个很有效的代谢工程靶点，编码色氨酸脱羧酶的基因已经从长春花Catharanthus roseus、喜树Camptotheca acuminata和短小蛇根草Ophiorrhiza pumila等植物中克隆。到目前为止，还未见从萝芙木或与其同属的其他物种中克隆基因色氨酸脱羧酶的报道。根据GeneBank中色氨酸脱羧酶的核苷酸序列，结合PCR技术我们从萝芙木中克隆了相关序列，根据GeneBank的搜索结果，将该基因命名为色氨酸脱羧酶基因。

在对现有文献的分析中，未见萝芙木萜类吲哚生物碱生物合成途径上的色氨酸脱羧酶基因的克隆，至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列。本发明公开了萝芙木色氨酸脱羧酶的氨基酸序列以及萝芙木色氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列，为最终采用打破TIAs途径上的限速反应步骤，实现利血平的代谢工程提供候选基因和作用靶点，及其在利用转基因技术提高利血平等萜类吲哚生物碱的含量的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：在本发明所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有萝芙木色氨酸脱羧酶核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列杂交。

本发明所分离出的萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列多肽，它包括：具有SEQ ID NO.1氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.1序列的多肽。

本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是真核细胞。在实例中该宿主细胞是萝芙木。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白编码序列”指编码具有活性多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第154-1653位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第154-1653位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDNO.1中第154-1653位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ IDNO.3中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ IDNO.1中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与萝芙木色氨酸脱羧酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“萝芙木色氨酸脱羧酶”指具有蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括具有相关相同功能的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括其活性片段和活性衍生物。

本发明的萝芙木色氨酸脱羧酶基因的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用萝芙木色氨酸脱羧酶编码多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“萝芙木色氨酸脱羧酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

表2

88％ identity in 500aa overlap

Query 1 MGSIDSTDVAISASPVAEFKPLEAEEFRKQAHRMVDFIADYYKNVESYPVLSQVEPGYLR

MGSIDST+VA+S SPV EFKPLEAEEFRKQAHRMVDFIADYYKNVE+YPVLS+VEPGYLR

Sbjct 1 MGSIDSTNVAMSNSPVGEFKPLEAEEFRKQAHRMVDFIADYYKNVETYPVLSEVEPGYLR

Query 61 ERLPETPPYLPDSLDKIIDDIQKDIIPGMTNWMSPNFYAFFPATVSSAAFLGEMLSTALN

+R+PET PYLP+ LD I+ DIQKDIIPGMTNWMSPNFYAFFPATVSSAAFLGEMLSTALN

Sbjct 61 KRIPETAPYLPEPLDDIMKDIQKDIIPGMTNWMSPNFYAFFPATVSSAAFLGEMLSTALN

Query 121 SVGFTWVSSPAATELEMIVMDWLAQMLKLPKSFMFSGTGGGVIQNTTSESILCTIIAARE

SVGFTWVSSPAATELEMIVMDWLAQ+LKLPKSFMFSGTGGGVIQNTTSESILCTIIAARE

Sbjct 121 SVGFTWVSSPAATELEMIVMDWLAQILKLPKSFMFSGTGGGVIQNTTSESILCTIIAARE

Query 181 RALEELGVDSIGKLVCYGSDQTHTMFPKTCKLAGISPKNIRLIPTTAETDFGIAPEVLRG

RALE+LG DSIGKLVCYGSDQTHTMFPKTCKLAGI P NIRLIPTT ETDFGI+P+VLR

Sbjct 181 RALEKLGPDSIGKLVCYGSDQTHTMFPKTCKLAGIYPNNIRLIPTTVETDFGISPQVLRK

Query 241 MVEADIAAGLVPLFLCATLGTTSSTATDPVDSLSEIANEFNIWMHVDAAYAGSACICPEF

MVE D+AAG VPLFLCATLGTTS+TATDPVDSLSEIANEF IW+HVDAAYAGSACICPEF

Sbjct 241 MVEDDVAAGYVPLFLCATLGTTSTTATDPVDSLSEIANEFGIWIHVDAAYAGSACICPEF

Query 301 MHYLDGIERVDSLSISPHKWLLAYLDCTCLWVKKPHFILRALTTNPEYLKNKQSELDKVV

HYLDGIERVDSLS+SPHKWLLAYLDCTCLWVK+PH +LRALTTNPEYLKNKQS+LDKVV

Sbjct 301 RHYLDGIERVDSLSLSPHKWLLAYLDCTCLWVKQPHLLLRALTTNPEYLKNKQSDLDKVV

Query 361 DFKNWQIATGRKFRALKLWLILRSYGVSNLQSHIRSDVAMAKMFEDFARSDPRFEVVVPR

DFKNWQIATGRKFR+LKLWLILRSYGV NLQSHIRSDVAM KMFE++ RSD RFE+VVPR

Sbjct 361 DFKNWQIATGRKFRSLKLWLILRSYGVVNLQSHIRSDVAMGKMFEEWVRSDSRFEIVVPR

Query 421 NFSLVCFRLKALPGS-DVEALNKKLLDMLNSTGRVYMTHTIVGGIYMLRLAVGSSLTEEH

NFSLVCFRLK S VE +NKKLLDMLNSTGRVYMTHTIVGGIYMLRLAVGSSLTEEH

Sbjct 421 NFSLVCFRLKPDVSSLHVEEVNKKLLDMLNSTGRVYMTHTIVGGIYMLRLAVGSSLTEEH

Query 480 HVRAVWELIKELANDLLKEA 499

HVR VW+LI++L +DLLKEA

Sbjct 481 HVRRVWDLIQKLTDDLLKEA 500

Query：萝芙木色氨酸脱羧酶的氨基酸序列

Sbjct：长春花色氨酸脱羧酶的氨基酸序列(CAA47898.1)

表2为本发明的萝芙木色氨酸脱羧酶与长春花色氨酸脱羧酶的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化.修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽.这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成.修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列.还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽.

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白时，可以将萝芙木色氨酸脱羧酶基因的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成萝芙木色氨酸脱羧酶基因表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有萝芙木色氨酸脱羧酶基因编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码萝芙木色氨酸脱羧酶的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在萝芙木色氨酸脱羧酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于萝芙木色氨酸脱羧酶基因核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

本发明的萝芙木色氨酸脱羧酶基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的萝芙木色氨酸脱羧酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与萝芙木色氨酸脱羧酶相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。

本发明在提高萝芙木萜类吲哚生物碱含量上具有明显的作用。提高生物碱的产量，以满足全世界对利血平等药物的巨大需求。因此，本发明具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

萝芙木色氨酸脱羧酶基因的克隆

1.组织分离(Isolation)

萝芙木(品种为“云南萝芙木”)从重庆南山采集，将种子播种于温室中，待萝芙木苗长至10cm高时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据各种植物的色氨酸脱羧酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)核心片断的克隆

PCR[BP001(5`-GTTGAYTTCATHGCTGAYTA-3`)+BP002(5`-CTTCRAACATYTTRGCCAT`-3`)]得到2002BP(1115bp)的核心片断，回收后连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知长春花的TDC基因的同源性很高，故初步认为它是一个色氨酸脱羧酶基因的片段。

(2)3′-RACE

PCR[AP+BP003(5’-TTCGATCAGATGTTGCAATGGCC-3’)]得到2002BP 3`端序列(491bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与长春花的TDC基因的同源性很高，故初步认为它是一个色氨酸脱羧酶基因。

(3).5′-RACE

第一轮PCR[AAP+BP004(5’-TAGAAGTTAGGGCTCATCCAG-3’)]

第二轮PCR[(AUAP+BP005(5’-GTCATTCCAGGGATTATATCCTTC-3’)]得到2002BP 5′端序列(422bp)，(过程同(1))。

将测序结果的重叠区拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增TDC编码区(BP006F1(5’-ATGGGCAGCATTGATTCAAC-3’)+BP007R1(5’-TCAAGCTTCCTTGAGCAAATCA-3’))得到TDC的编码区(1500bp).

BLAST的结果证明从萝芙木中新得到的基因确为一个色氨酸脱羧酶基因。由于已知的同源色氨酸脱羧酶基因具有将色胺酸脱羧成为色胺的功能，故推测此基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的萝芙木色氨酸脱羧酶的全长编码序列。在拼接得到全长(包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物BP008F1：5`-CTAATACGACTCACTATAGG-3为正向引物，BP009R1：5`-AGACAGCACAAATTGTGTTTT-3`为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为：94℃预变性2min；然后94变性45s、51退火45s、72延伸2min；30个循环；最后72延伸8min；电泳检测PCR产物，获得扩增片断长度为1810bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆，测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。

实施例2

萝芙木色氨酸脱羧酶基因序列信息与同源性分析

本发明新的色氨酸脱羧酶基因序列全长cDNA的长度为1824bp(包括153bp 5端非编码区、1500bp编码区和171bp的3端非编码区)，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于154-1653位核苷酸(1500个核苷酸)。根据全长cDNA推导出萝芙木色氨酸脱羧酶氨基酸序列，共499个氨基酸残基，分子量为55.54kDa，等电点(pI)为5.35。详细序列见SEQ IDNO.1。

将萝芙木色氨酸脱羧酶基因相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与长春花色氨酸脱羧酶基因序列在核苷酸水平上具有约80％的相同性；在氨基酸水平上，它与长春花色氨酸脱羧酶在蛋白水平上具有88％的相同性(附表2)。由此可见，萝芙木色氨酸脱羧酶基因与长春花色氨酸脱羧酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为萝芙木色氨酸脱羧酶在MEP途径上也具有相似的作用。

实施例3

萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白或多肽在萝芙木中进行真核细胞表达及转基因植株的TIAs含量检测

含目的基因的表达载体的构建，根据萝芙木色氨酸脱羧酶基因编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将萝芙木色氨酸脱羧酶基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化萝芙木。

1.发苗：采取萝芙木成熟的种子，用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗6次；将萝芙木种子接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，添加30g/L蔗糖，调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉.在光照培养箱中培养萝芙木的幼芽，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养.待种子萌动后，改变培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为25μmol.m^-2.s^-1。等到植株片长到3cm高时时可用于遗传转化。

2.转化共培养：将萝芙木无菌苗的幼嫩叶片用小刀片削成约1cm²放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入共培养基暗培养2天。

3.除菌培养：共培养结束后，将外植体放入除菌培养基培养。4周继代一次。待除菌培养结束后，转入抗性筛选培养基进行转基因毛状根初步筛选。

除菌培养基：MS+cb(头孢菌素)(250mg/l)

筛选培养基：MS+hygr(潮霉素)(30mg/l)

4.毛状根的离体培养：当毛状根长至大约4cm长时切下，在不含任何植物激素的MS培养基上于25±1.0℃无光照的恒温培养箱中继代培养。每三周继代一次，经过几次继代培养后可进行液体发酵培养，以进一步进行分子检测。

5.转基因萝芙木的分子检测

毛状根DNA的提取和纯化均参照分子克隆实验指南(Sambrook，J.et al 1993)根据Furner等的Ri质粒基因序列分析设计rolB、rolC基因的特异性引物。rolB基因的一对引物为：5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’。rolC基因的一对引物为5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’。rolB、rolC基因的片段大小分别423bp和626bp。

由于萝芙木中含有色氨酸脱羧酶基因，所以在对转色氨酸脱羧酶基因的毛状根单克隆时不能检测直接TDC基因，而检测植物表达载体上的潮霉素(hygr)抗性基因，潮霉素抗性基因(812bp)的检测使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’，退火温度，58℃)。

PCR结果表明：所获得的根为毛状根，对潮霉素抗性基因的检测表明萝芙木色氨酸脱羧酶基因已经成功整合到萝芙木基因组。

6.色氨酸脱羧酶基因在萝芙木毛状根中的northern blot分析

1.RNA的提取：利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)提取萝芙木转基因毛状根各个单克隆的RNA。

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1 OD₂₆₀＝40μg/ml。

3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6m125×(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10×上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5.膜上杂交信号的检出：1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时.2)将用Gene Images^TM Contents CDP-Star^TM labelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。

Northern blot结果表明：转萝芙木色氨酸脱羧酶基因的毛状根中色氨酸脱羧酶基因基因转录水平比空白毛状根的明显偏高。

7转色氨酸脱羧酶基因的毛状根利血平的HPLC分析

生物碱的提取：取萝芙木的毛状根，在烘箱里50度恒温干燥5-6个小时至恒重，取1.0g发根研磨成细粉，水润湿，用超声波在20ml甲醇中抽提3次，每次15min，提取液浓缩后用5％冰乙酸提取，提取液用石油醚洗涤，而后用氯仿提取，将氯仿提取液浓缩蒸干，得到粗制的生物碱。用流动相溶解，定容至1mL，用0.122μm微孔滤膜过滤后，可用于HPLC分析。

高压液相检测标准品的制备：精密量取利血平标准品1mg，用流动相溶解成1mg/ml母液。从母液配成50，40，30，20，10mg/ml的浓度梯度，HPLC分析，根据标准品的浓度和峰面积绘制标准曲线.

高压液相检测条件：色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.5％(v/v)三乙胺-水∶乙腈(50∶50)，流速1.0mL.min^-1，柱温室温。检测波长：268nm。利血平大约在22min处出峰。

HPLC结果表明：转萝芙木色氨酸脱羧酶基因的毛状根中利血平的含量比空白毛状根的明显偏高。

序列表

<110>西南大学

<120>萝芙木色氨酸脱羧酶基因编码序列

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1800

<212>DNA

<213>萝芙木(Rauvolfia verticillata)

CTAATACGAC TCACTATAGG GCAAGCAGTG GTATCAACGC AGAGTACGCG GGACACAACT 60

TCTTCCTCAA TTTTCTTTCT GATTCATACA CCTCCATTCT CACTTCTTCC AAGCTCCTTT 120

AAGGGTCTCA TTTAGTCCTA AAACCCAGAC AAA ATG GGC AGC ATT GAT TCA ACA 174

Met Gly Ser Ile Asp Ser Thr

1 5

GAT GTT GCC ATT TCC GCC TCT CCG GTT GCA GAG TTC AAG CCT CTT GAA 222

Asp Val Ala Ile Ser Ala Ser Pro Val Ala Glu Phe Lys Pro Leu Glu

10 15 20

GCT GAA GAG TTT AGA AAA CAA GCC CAT CGC ATG GTG GAT TTC ATA GCT 270

Ala Glu Glu Phe Arg Lys Gln Ala His Arg Met Val Asp Phe Ile Ala

25 30 35

GAT TAC TAC AAG AAT GTC GAG AGC TAT CCA GTT CTC AGC CAA GTT GAG 318

Asp Tyr Tyr Lys Asn Val Glu Ser Tyr Pro Val Leu Ser Gln Val Glu

40 45 50 55

CCG GGG TAT CTC CGA GAA CGT CTC CCT GAA ACA CCT CCT TAT CTT CCT 366

Pro Gly Tyr Leu Arg Glu Arg Leu Pro Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Pro

60 65 70

GAT TCA CTT GAT AAG ATC ATC GAT GAT ATT CAG AAG GAT ATA ATC CCT 414

Asp Ser Leu Asp Lys Ile Ile Asp Asp Ile Gln Lys Asp Ile Ile Pro

75 80 85

GGA ATG ACT AAC TGG ATG AGC CCT AAC TTC TAC GCA TTT TTT CCG GCC 462

Gly Met Thr Asn Trp Met Ser Pro Asn Phe Tyr Ala Phe Phe Pro Ala

90 95 100

ACT GTG AGT TCG GCT GCT TTC CTG GGA GAA ATG TTG TCC ACT GCC CTC 510

Thr Val Ser Ser Ala Ala Phe Leu Gly Glu Met Leu Ser Thr Ala Leu

105 110 115

AAC TCT GTG GGG TTC ACT TGG GTT TCC TCC CCG GCG GCC ACC GAG CTC 558

Asn Ser Val Gly Phe Thr Trp Val Ser Ser Pro Ala Ala Thr Glu Leu

120 125 130 135

GAG ATG ATT GTG ATG GAC TGG CTG GCG CAG ATG CTC AAG CTT CCC AAG 606

Glu Met Ile Val Met Asp Trp Leu Ala Gln Met Leu Lys Leu Pro Lys

140 145 150

TCT TTC ATG TTC TCC GGC ACC GGT GGA GGC GTT ATT CAG AAC ACC ACC 654

Ser Phe Met Phe Ser Gly Thr Gly Gly Gly Val Ile Gln Asn Thr Thr

155 160 165

AGT GAG TCC ATT CTT TGC ACC ATC ATT GCT GCT CGT GAA AGG GCA CTC 702

Ser Glu Ser Ile Leu Cys Thr Ile Ile Ala Ala Arg Glu Arg Ala Leu

170 175 180

GAA GAA CTA GGA GTG GAT AGC ATT GGC AAG CTT GTT TGT TAT GGA TCT 750

Glu Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Gly Lys Leu Val Cys Tyr Gly Ser

185 190 195

GAT CAA ACG CAC ACC ATG TTT CCC AAA ACT TGC AAA TTG GCG GGC ATT 798

Asp Gln Thr His Thr Met Phe Pro Lys Thr Cys Lys Leu Ala Gly Ile

200 205 210 215

TCC CCA AAG AAC ATT AGA TTA ATC CCT ACA ACT GCA GAA ACT GAC TTT 846

Ser Pro Lys Asn Ile Arg Leu Ile Pro Thr Thr Ala Glu Thr Asp Phe

220 225 230

GGC ATT GCC CCG GAA GTC CTA CGC GGA ATG GTG GAA GCC GAT ATT GCA 894

Gly Ile Ala Pro Glu Val Leu Arg Gly Met Val Glu Ala Asp Ile Ala

235 240 245

GCC GGT TTA GTC CCG CTT TTC CTA TGC GCC ACA CTC GGG ACC ACT TCA 942

Ala Gly Leu Val Pro Leu Phe Leu Cys Ala Thr Leu Gly Thr Thr Ser

250 255 260

TCC ACG GCC ACC GAC CCC GTC GAT TCC CTA TCT GAA ATC GCA AAC GAG 990

Ser Thr Ala Thr Asp Pro Val Asp Ser Leu Ser Glu Ile Ala Asn Glu

265 270 275

TTC AAC ATC TGG ATG CAC GTG GAT GCA GCT TAT GCA GGC AGT GCA TGC 1038

Phe Asn Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Tyr Ala Gly Ser Ala Cys

280 285 290 295

ATA TGC CCG GAG TTC ATG CAC TAC TTG GAT GGG ATC GAA CGA GTC GAC 1086

Ile Cys Pro Glu Phe Met His Tyr Leu Asp Gly Ile Glu Arg Val Asp

300 305 310

TCA CTG AGC ATT AGT CCT CAT AAA TGG TTG CTC GCA TAC TTG GAC TGC 1134

Ser Leu Ser Ile Ser Pro His Lys Trp Leu Leu Ala Tyr Leu Asp Cys

315 320 325

ACT TGC TTG TGG GTC AAG AAA CCC CAC TTT ATA CTC CGG GCT CTT ACT 1182

Thr Cys Leu Trp Val Lys Lys Pro His Phe Ile Leu Arg Ala Leu Thr

330 335 340

ACG AAC CCT GAG TAC TTG AAA AAC AAA CAG AGC GAG TTG GAT AAA GTG 1230

Thr Asn Pro Glu Tyr Leu Lys Asn Lys Gln Ser Glu Leu Asp Lys Val

345 350 355

GTG GAT TTC AAG AAT TGG CAA ATC GCA ACA GGT CGT AAA TTT CGA GCC 1278

Val Asp Phe Lys Asn Trp Gln Ile Ala Thr Gly Arg Lys Phe Arg Ala

360 365 370 375

CTC AAG CTT TGG CTA ATC TTG CGT AGC TAT GGC GTT TCG AAC CTC CAA 1326

Leu Lys Leu Trp Leu Ile Leu Arg Ser Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln

380 385 390

AGC CAT ATT CGA TCA GAT GTT GCA ATG GCG AAG ATG TTC GAA GAT TTT 1374

Ser His Ile Arg Ser Asp Val Ala Met Ala Lys Met Phe Glu Asp Phe

395 400 405

GCG AGA TCA GAC CCA AGG TTT GAA GTG GTC GTA CCA CGA AAT TTT TCA 1422

Ala Arg Ser Asp Pro Arg Phe Glu Val Val Val Pro Arg Asn Phe Ser

410 415 420

CTT GTC TGC TTC AGG CTG AAA GCC TTG CCA GGT TCG GAC GTA GAA GCC 1470

Leu Val Cys Phe Arg Leu Lys Ala Leu Pro Gly Ser Asp Val Glu ALa

425 430 435

CTC AAC AAG AAG CTG CTC GAT ATG CTC AAC TCA ACT GGC CGA GTC TAC 1518

Leu Asn Lys Lys Leu Leu Asp Met Leu Asn Ser Thr Gly Arg Val Tyr

440 445 450 455

ATG ACT CAC ACT ATT GTG GGA GGC ATA TAC ATG CTA AGG TTG GCC GTT 1566

Met Thr His Thr Ile Val Gly Gly Ile Tyr Met Leu Arg Leu Ala Val

460 465 470

GGA TCA TCA CTA ACG GAA GAA CAC CAT GTC CGC GCT GTT TGG GAA CTC 1614

Gly Ser Ser Leu Thr Glu Glu His His Val Arg Ala Val Trp Glu Leu

475 480 485

ATT AAG GAA TTA GCA AAT GAT TTG CTC AAG GAA GCT TGA AGTGAGCTTA 1663

Ile Lys Glu Leu Ala Asn Asp Leu Leu Lys Glu Ala ***

490 495 499

TTTTTTTCAT TTTTTTTAAA ATTTTGTTTG CAGATTGTTT GAAGTGTTTT AAATAAAACG 1723

TTTTGTAAAG CTTATTGAAC TCAAACAATC ATGCAATTAT CTGTATTACT TATATAATAA 1783

TGAAATAAAA CACAATTTGT GCTGTCTAAA AAAAAAAAAA A 1824

<210>2

<211>499

<212>PRT

<213>萝芙木(Rauvolfia verticillata)

<400>2

Met Gly Ser Ile Asp Ser Thr Asp Val Ala Ile Ser Ala Ser Pro Val

1 5 10 15

Ala Glu Phe Lys Pro Leu Glu Ala Glu Glu Phe Arg Lys Gln Ala His

20 25 30

Arg Met Val Asp Phe Ile Ala Asp Tyr Tyr Lys Asn Val Glu Ser Tyr

35 40 45

Pro Val Leu Ser Gln Val Glu Pro Gly Tyr Leu Arg Glu Arg Leu Pro

50 55 60

Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Pro Asp Ser Leu Asp Lys Ile Ile Asp Asp

65 70 75 80

Ile Gln Lys Asp Ile Ile Pro Gly Met Thr Asn Trp Met Ser Pro Asn

85 90 95

Phe Tyr Ala Phe Phe Pro Ala Thr Val Ser Ser Ala Ala Phe Leu Gly

100 105 110

Glu Met Leu Ser Thr Ala Leu Asn Ser Val Gly Phe Thr Trp Val Ser

115 120 125

Ser Pro Ala Ala Thr Glu Leu Glu Met Ile Val Met Asp Trp Leu Ala

130 135 140

Gln Met Leu Lys Leu Pro Lys Ser Phe Met Phe Ser Gly Thr Gly Gly

145 150 155 160

Gly Val Ile Gln Asn Thr Thr Ser Glu Ser Ile Leu Cys Thr Ile Ile

165 170 175

Ala Ala Arg Glu Arg Ala Leu Glu Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Gly

180 185 190

Lys Leu Val Cys Tyr Gly Ser Asp Gln Thr His Thr Met Phe Pro Lys

195 200 205

Thr Cys Lys Leu Ala Gly Ile Ser Pro Lys Asn Ile Arg Leu Ile Pro

210 215 220

Thr Thr Ala Glu Thr Asp Phe Gly Ile Ala Pro Glu Val Leu Arg Gly

225 230 235 240

Met Val Glu Ala Asp Ile Ala Ala Gly Leu Val Pro Leu Phe Leu Cys

245 250 255

Ala Thr Leu Gly Thr Thr Ser Ser Thr Ala Thr Asp Pro Val Asp Ser

260 265 270

Leu Ser Glu Ile Ala Asn Glu Phe Asn Ile Trp Met His Val Asp Ala

275 280 285

Ala Tyr Ala Gly Ser Ala Cys Ile Cys Pro Glu Phe Met His Tyr Leu

290 295 300

Asp Gly Ile Glu Arg Val Asp Ser Leu Ser Ile Ser Pro His Lys Trp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Tyr Leu Asp Cys Thr Cys Leu Trp Val Lys Lys Pro His

325 330 335

Phe Ile Leu Arg Ala Leu Thr Thr Asn Pro Glu Tyr Leu Lys Asn Lys

340 345 350

Gln Ser Glu Leu Asp Lys Val Val Asp Phe Lys Asn Trp Gln Ile Ala

355 360 365

Thr Gly Arg Lys Phe Arg Ala Leu Lys Leu Trp Leu Ile Leu Arg Ser

370 375 380

Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Ser His Ile Arg Ser Asp Val Ala Met

385 390 395 400

Ala Lys Met Phe Glu Asp Phe Ala Arg Ser Asp Pro Arg Phe Glu Val

405 410 415

Val Val Pro Arg Asn Phe Ser Leu Val Cys Phe Arg Leu Lys Ala Leu

420 425 430

Pro Gly Ser Asp Val Glu Ala Leu Asn Lys Lys Leu Leu Asp Met Leu

435 440 445

Asn Ser Thr Gly Arg Val Tyr Met Thr His Thr Ile Val Gly Gly Ile

450 455 460

Tyr Met Leu Arg Leu Ala Val Gly Ser Ser Leu Thr Glu Glu His His

465 470 475 480

Val Arg Ala Val Trp Glu Leu Ile Lys Glu Leu Ala Asn Asp Leu Leu

485 490 495

Lys Glu Ala ***

499

Claims

1.一种萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白，其特征在于，编码色氨酸脱羧酶活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO.1中从核苷酸第154-1653位的核苷酸序列所构成。

2.根据权利要求1所述的萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白，其特征是，萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的萝芙木色氨酸脱羧酶蛋白的编码序列转化的宿主细胞，其特征是，所述的宿主细胞是真核细胞。