CN101250545B - 三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1及其编码的蛋白质和应用，填补了从我国云南特有的药用植物三分三中分离克隆出1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因的空白。本发明所提供的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因对于通过基因工程技术提高三分三等植物中莨菪烷生物碱的含量具有显著作用，可广泛应用于产托品烷生物碱的资源植物的品质改良。

Description

三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及在三分三中表达的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

莨菪烷生物碱如莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)等，主要是从茄科植物如颠茄、曼陀罗、莨菪及三分三等中提取到的，在医用方面是作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛的功能。此外，还具有改善微循环的作用，临床上可用于治疗微循环障碍性疾病。由于我国学者的努力，莨菪烷生物碱的临床应用遍及内科、外科、妇产科、神经科、皮肤科、耳鼻喉科等，能治疗100多种疾病，市场需求十分巨大。

药用植物三分三(Anisodus acutangulus)，为茄科多年生草本植物，主要分布于我国云南西北部，在云南民间它作为解痉镇痛的中药使用已有悠久历史。三分三根部富含莨菪烷生物碱，据报道，野生三分三干燥品总生物碱含量高达1.2％，所含生物碱含量比世界上一些常用的茄科植物如颠茄、莨菪曼陀罗等均高的多。根据记载，七年生三分三总生物碱含量可高达5％。实验表明，三分三所含生物碱绝大部分是莨菪烷类生物碱。随着市场对莨菪烷生物碱的需求不断扩大，寻找可以大量生产莨菪烷生物碱的替代方法已成为当前研究的热点。近年来基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高托品烷生物碱含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将莨菪碱生物合成途径中的关键酶基因导入资源植物中，获得转基因植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高莨菪烷生物碱含量的最佳途径之一。

三分三中的莨菪碱是由精氨酸和鸟氨酸经腐胺(Putrescine)衍生而来的。在整个莨菪烷生物碱合成过程中，1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶(putrescineN-methyltransferaseI，PMT)是整个莨菪碱生物合成途径中的第一个关键催化酶，PMT催化腐胺变成N-甲基腐胺。由于PMT对于代谢流流向莨菪生物碱具有重要的调节作用，所以这一步是利用基因工程技术来调控莨菪生物碱生物合成的重要调控点。因此，从三分三中分离克隆1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的编码基因(Anisodus acutangulus putrescine N-methyltransferase，AaPMT1)并利用基因工程技术来提高资源植物如三分三等中1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的活性或含量，从而提高转基因植物如三分三中莨菪生物碱的含量，有着十分重要的意义和价值。

虽然现有文献“Plant Cell Physiol(植物细胞生理学)1999，40(3)：289-297”中报道了从颠茄中克隆1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因，但至今尚未有任何从我国云南特有的药用植物三分三中分离克隆出1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因的文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1及其编码的蛋白质和应用，以填补从我国云南特有的药用植物三分三中分离克隆出1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因的空白。

本发明所提供的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所提供的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

含有本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1全序列或部分片段的质粒和植物表达载体均属于本发明的保护范围。

一种宿主细胞，该细胞含有本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的基因序列。

所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞或三分三细胞。

本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的应用，包括用所述的植物表达载体转化三分三细胞或者用所述的农杆菌细胞与三分三细胞共培养或者用所述的三分三发根细胞培育雄性不育植株或者用所述的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1制备转基因三分三。

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下：

本发明所说的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的DNA分子包括：编码具有三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第117～1133位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第117～1133的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第117～1133位的核苷酸序列。

本发明分离出的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶多肽包括：

具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8～100个连续核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指：该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中术语“三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶(或多肽)基因”指：

编码具有三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第117～1133位核苷酸序列及其简并序列，该简并序列是指位于SEQ ID NO.1序列的编码框第117～1133位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第117～1133位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第117～1133位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第117～1133位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明中术语“三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶蛋白或多肽”指：

具有三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶相同功能的SEQ IDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～50个，较佳地1～30个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。

本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。

本发明中三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶保守性变异多肽指：与SEQ IDNO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1.保守性变异多肽中的取代残基

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶或多肽的类似物，这些类似物与天然1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶多肽时，可以将三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

本发明还可用Northern印迹法技术分析三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1产物的表达，即分析三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的RNA转录物在细胞中的存在和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶核苷酸编码序列的8～100个连续核苷酸，较佳地具有15～50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶源基因或同源蛋白。

为了得到与三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1相关的三分三cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选三分三cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自三分三的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的基因家族的核苷酸序列。

本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。

本发明提供的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因是首次从三分三中克隆制备的，可以通过基因工程技术用来提高三分三等植物中莨菪烷生物碱的含量，转基因结果显示，1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因对于通过基因工程技术促进三分三等植物中莨菪烷生物碱的含量提高具有显著作用，可广泛应用于产托品烷生物碱的资源植物的遗传改良。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1(三分三托1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的克隆)

1.组织分离(isolation)

三分三植株来源于云南丽江，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(Trizol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据莨菪及其它茄科植物的PMT氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3′-RACE

PCR(UPM+F2)得到AaPMT1F2′(997bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因(如莨菪1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因等)的同源性很高，故初步认为它是一个1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因。

(2)5′-RACE

根据3′RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到AaPMT1R2′(568bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。将测序结果与3′RACE结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。

(3)将5′RACE测序结果与3′RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物AaPMT1KF1：5′-ATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3′(SEQ ID NO.3)和AaPMT1KR1：5′-TCAAAATTCAACCAAATCCCTC-3′(SEQ ID NO.4)进行PCR扩增AaPMT1编码区得到AaPMT1编码区(1017bp)(过程同步骤(1))。

BLAST的结果证明从三分三中新得到的基因确为一个1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因。由于已知的同源的来源于曼陀罗的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因具有提高莨菪烷生物碱的功能(Richter等，2005)，故推测此基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的三分三AaPMT1蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物AaPMT1F1：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG-3′为正向引物，寡核苷酸AaPMT1R1：5′-GTTAATTAATATGATTTTATAA-3′为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1353bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。

实施例2(三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的序列信息与同源性分析)

本发明新的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1全长cDNA的长度为1353bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于117～1133位核苷酸。根据全长cDNA推导出三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的氨基酸序列，共338个氨基酸残基，分子量37.223KD，pI为5.50，详细序列见SEQ ID NO.2。

将三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与唐古特山莨菪PMT基因(GenBank Accession No.AY690623)具有98％的同源性(见表2)；在氨基酸水平上，它与唐古特山莨菪PMT(GenBank Accession No.AAT99576)的第1～273位氨基酸残基有97％的相同性和97％的相似性(见表3)。由上可见，三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1与莨菪1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶在提高资源植物中东莨菪碱的含量上也具有相似的作用。

表2.本发明的三分三AaPMT1与唐古特山莨菪(Anisodus tanguticus)AtPMT1的核苷酸序列的同源比较(GAP)表

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Sbjct 961  TTTCAAGAATCCAGTGAACTCTATTGACAAAGATACCAGCCATGTCAAATCCAAGGGACC 1020

Query 1055 TTTGAAGTTCTACAACTCTGATATTCATAAAGCAGCTTTTATTTTGCCATCTTTCGCGAG 1114

           ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1021 TTTGAAGTTCTACAACTCTGATATTCATAAAGCAGCTTTTATTTTGCCATCTTTCGCGAG 1080

Query 1115 GGATTTGGTTGAATTTTGATCAAACAAATGATGATGATTTTATAGTGTATTTATTGTACC 1174

           |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||||||||

Sbjct 1081 GGATTTGGTTGAGTTTTGATCAAACAAATGATGATGATTTTATGGAATATTTATTGTACC 1140

Query 1175 ACGTTTGGTTGTGTATGGGGAAATTGTCAAGATGTTTGCTTCAAAATTTGTATGTTTAGT 1234

           ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

Sbjct 1141 ACGTTTGGTTGTGTATGGGGAAATTGTCAAGATGTTTGCTTCAAAATTTGTATGTTTGGT 1200

Query 1235 ATCTGTAGACGATGAAATAATGAAGAAGCTTATGTCTATGCAATTTAATTAAAAAGTATA 1294

           ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1201 ATCTGTAGACGATGAAATAATGAAGAAGCTTATGTCTATGCAATTTAATTAAAAAGTATA 1260

Query 1295 ATGCAATAAACTGATATGGTTTTATAAAA  1323

           |||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1261 ATGCAATAAACTGATATGGTTTTATAAAA  1289

其中：Query表示三分三AaPMT1的核酸序列；Subject表示唐古特山莨菪AtPMT1的核酸序列(GenBank Accession No.AY690623)。

结果：在1289个核苷酸的比对中两者有98％的相似性。

表3.本发明的三分三的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶与唐古特山莨菪的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶氨基酸序列的同源比较(FASTA)表

Query 1 MEVISNHNNGSTTKI ILKNGSIRNGNVNGNSHSHEKIENKLVECTNSIKPGWFSEFSALW 60

        MEVISNHNNGSTTKI ILKNGSI NGNVNGNSHSHEKIENKLVECTNSIKPGWFSEFSALW

Sbjct 1   MEVISNHNNGSTTKIILKNGSICNGNVNGNSHSHEKIENKLVECTNSIKPGWFSEFSALW 60

Query 61  PDEAFSLKIEKLLLQGKSDYQDVMLFESATYGKVLTLDGAIQHTENGGFPYTEVIVHLPL 120

          P EAFSLKIEKLL QGKSDYQDVMLFESATYGKVLTLDGAIQHTENGGFPYTE+IVHLPL

Sbjct 61  PGEAFSLKIEKLLFQGKSDYQDVMLFESATYGKVLTLDGAIQHTENGGFPYTEMIVHLPL 120

Query 121 GSIPSPKKVLIIGGGIGFTLFEVSRYPTIETIDIVEIDDVVVDVSRKYFPYLAAGFDDPR 180

          GSIPSPKKVLIIGGGIGFTLFEVSRYPTIETIDIVEIDDVVVDVSRK+FPYLAAGFDDPR

Sbjct 121 GSIPSPKKVLIIGGGIGFTLFEVSRYPTIETIDIVEIDDVVVDVSRKFFPYLAAGFDDPR 180

Query 181 VTLIIGDGAAFVKAAQPGYYDAIIVDSSDPIGPAKDLFERPFFEAVAKALRPGGVVCTQA 240

          VTLIIGDGAAFVKAAQPGYYDAIIVDSSDPIGPAKDLFERPFFEA+AKALRPGGVVCTQA

Sbjct 181 VTLIIGDGAAFVKAAQPGYYDAIIVDSSDPIGPAKDLFERPFFEALAKALRPGGVVCTQA 240

Query 241 ESIWLHMHLIEQIIANCRQVFKGSVNYAWTTVPTYPTGVIGYMLCSTEGPEVNFKNPVNS 300

          ESIWLHMHLI+QIIANCRQVFKGSVNYAWTTVPTYPTGVIGYMLCSTEGPEVNFKNPVNS

Sbjct 241 ESIWLHMHLIKQIIANCRQVFKGSVNYAWTTVPTYPTGVIGYMLCSTEGPEVNFKNPVNS 300

Query 301 IDKDTSHVKSKGPLKFYNSDIHKAAFILPSFARDLVEF  338

          IDKDTSHVKSKGPLKFYNSDIHKAAFILPSFARDLVEF

Sbjct 301 IDKDTSHVKSKGPLKFYNSDIHKAAFILPSFARDLVEF  338

其中：Query表示三分三AaPMT1的氨基酸序列；Subject表示唐古特山莨菪AtPMT1的氨基酸序列(GenBank Accession No.AAT99576)；相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

结果：在338个氨基酸的比对中，两者分别有97％的相同性和99％的相似性。

实施例3(三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶1或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯)

在该实施例中，将全长的三分三AaPMT1编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1、原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌

根据三分三AaPMT1的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将三分三AaPMT1基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-AaPMT1表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-AaPMT1。

2、表达Trx-AaPMT1重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-AaPMT1工程菌于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0、1、2、3小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-AaPMT1融合蛋白的工程菌。

3、Trx-AaPMT1融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达Trx-AaPMT1融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-AaPMT1，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集Trx-AaPMT1融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获得AaPMT1的表达蛋白。表达的蛋白分子量为37.2KD，pI为5.5，具有催化腐胺变成N-甲基腐胺的酶活性。

实施例4(三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶或多肽在三分三中进行真核细胞表达及转基因发根中莨菪碱和东莨菪碱含量测定)

含目的基因(三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1)的表达载体的构建，根据三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，遗传转化资源植物三分三。利用发根农杆菌Ri质粒介导的三分三的遗传转化过程为：

1)发根农杆菌A4，使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜；

2)取生长8周左右的三分三的无菌嫩叶片；

3)经过夜培养的菌液，用转化液稀释为100个细菌/mL，取无菌三分三叶片，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化中，60rpm/min振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4～5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养；

4)把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有100mL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用；

5)含三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的转基因发根的莨菪碱和东莨菪碱含量测定

按Zhang等(PNAS，2004)的方法对表达三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的转基因发根进行莨菪碱和东莨菪碱含量测定，测定结果表明：在表达三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的转基因发根中托品烷生物碱含量同非转基因对照组的相比，提高1.6倍(P＜0.05)。因此转基因结果证明：三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1对促进托品烷生物碱含量的提高有明显作用，可广泛应用于产托品烷生物碱的资源植物的品质改良。

核苷酸序列表

<110>上海师范大学

<120>三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1及其编码的蛋白质和用途

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1353

<212>DNA

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<220>

<221>CDS

<222>(117)..(1133)

<223>

<400>1

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gaggccaaaa gtgaagaagc cttttgagtg   60

ccaaactgca aattagtttc ttcaaataat tgcttttctc ttatttagtt tgaaga atg  119

                                                              Met

                                                              1

gag gtc ata agc aac cac aac aat ggc agc acc acc aaa att atc ctg    167

Glu Val Ile Ser Asn His Asn Asn Gly Set Thr Thr Lys Ile Ile Leu

            5                   10                  15

aaa aat ggc agc att cgc aat ggc aat gtt aat ggc aac tcc cac tcc    215

Lys Asn Gly Ser Ile Arg Asn Gly Asn Val Asn Gly Asn Ser His Ser

        20                  25                  30

cat gag aaa att gag aat aag ctt gta gag tgc act aac tct atc aag    263

His Glu Lys Ile Glu Asn Lys Leu Val Glu Cys Thr Asn Ser Ile Lys

    35                  40                  45

cct ggt tgg ttt tct gag ttt agc gca ctc tgg cca gat gaa gca ttt    311

Pro Gly Trp Phe Ser Glu Phe Ser Ala Leu Trp Pro Asp Glu Ala Phe

50                  55                  60                  65

tca ctt aaa att gaa aag tta cta ctt caa gga aag tct gat tat caa    359

Ser Leu Lys Ile Glu Lys Leu Leu Leu Gln Gly Lys Ser Asp Tyr Gln

                70                  75                  80

gat gtc atg ctc ttt gag tca gca act tat ggg aag gtg tta aca ttg    407

Asp Val Met Leu Phe Glu Ser Ala Thr Tyr Gly Lys Val Leu Thr Leu

            85                  90                  95

gat ggg gca att caa cat aca gag aat ggt gga ttt cca tac act gag    455

Asp Gly Ala Ile Gln His Thr Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Thr Glu

        100                 105                 110

gtg att gtt cat ctc cca ctt ggt tcc att cca tcc cct aag aag gtt    503

Val Ile Val His Leu Pro Leu Gly Ser Ile Pro Ser Pro Lys Lys Val

    115                 120                 125

tta atc atc ggt gga ggg att ggt ttc aca ttg ttt gag gtc tct cgt    551

Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Gly Phe Thr Leu Phe Glu Val Ser Arg

130                 135                 140                 145

tac cca act atc gaa aca ata gat ata gtt gag atc gat gac gtg gtt    599

Tyr Pro Thr Ile Glu Thr Ile Asp Ile Val Glu Ile Asp Asp Val Val

                150                 155                 160

gta gat gta tct aga aag tat ttc ccg tac cta gca gca gga ttc gat    647

Val Asp Val Ser Arg Lys Tyr Phe Pro Tyr Leu Ala Ala Gly Phe Asp

            165                 170                 175

gat ccc aga gta acc ctt att att ggc gat gga gct gca ttc gtg aaa    695

Asp Pro Arg Val Thr Leu Ile Ile Gly Asp Gly Ala Ala Phe Val Lys

        180                 185                 190

gct gct caa cct gga tac tat gat gcc att att gtg gac tct tct gat    743

Ala Ala Gln Pro Gly Tyr Tyr Asp Ala Ile Ile Val Asp Ser Ser Asp

    195                 200                 205

cct att ggt cca gca aaa gac ttg ttt gaa agg cca ttc ttc gag gca    791

Pro Ile Gly Pro Ala Lys Asp Leu Phe Glu Arg Pro Phe Phe Glu Ala

210                 215                 220                 225

gtg gcg aaa gcg cta agg cca gga gga gta gta tgt aca caa gca gag    839

Val Ala Lys Ala Leu Arg Pro Gly Gly Val Val Cys Thr Gln Ala Glu

                230                 235                 240

agc att tgg ctt cac atg cat ctt att gag caa att att gct aat tgt    887

Ser Ile Trp Leu His Met His Leu Ile Glu Gln Ile Ile Ala Asn Cys

            245                 250                 255

cgc caa gtg ttt aag ggt tct gtc aat tat gca tgg act aca gtt cct    935

Arg Gln Val Phe Lys Gly Ser Val Asn Tyr Ala Trp Thr Thr Val Pro

        260                 265                 270

act tac cct act ggt gtt atc ggt tac atg ctt tgc tct acg gag gga    983

Thr Tyr Pro Thr Gly Val Ile Gly Tyr Met Leu Cys Ser Thr Glu Gly

    275                 280                 285

cca gaa gtt aat ttc aag aat cca gtg aac tct att gac aaa gat acc   1031

Pro Glu Val Asn Phe Lys Asn Pro Val Asn Ser Ile Asp Lys Asp Thr

290                 295                 300                 305

agc cat gtc aaa tcc aag gga cct ttg aag ttc tac aac tct gat att   1079

Ser His Val Lys Ser Lys Gly Pro Leu Lys Phe Tyr Asn Ser Asp Ile

                310                 315                 320

cat aaa gca gct ttt att ttg cca tct ttc gcg agg gat ttg gtt gaa   1127

His Lys Ala Ala Phe Ile Leu Pro Ser Phe Ala Arg Asp Leu Val Glu

            325                 330                 335

ttt tga tcaaacaaat gatgatgatt ttatagtgta tttattgtac cacgtttggt    1183

Phe

tgtgtatggg gaaattgtca agatgtttgc ttcaaaattt gtatgtttag tatctgtaga 1243

cgatgaaata atgaagaagc ttatgtctat gcaatttaat taaaaagtat aatgcaataa 1303

actgatatgg ttttataaaa tcatattaat taacaaaaaa aaaaaaaaaa            1353

<210>2

<211>338

<212>PRT

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<400>2

Met Glu Val Ile Ser Asn His Asn Asn Gly Ser Thr Thr Lys Ile Ile

1               5                   10                  15

Leu Lys Asn Gly Ser Ile Arg Asn Gly Asn Val Asn Gly Asn Ser His

            20                  25                  30

Ser His Glu Lys Ile Glu Asn Lys Leu Val Glu Cys Thr Asn Ser Ile

        35                  40                  45

Lys Pro Gly Trp Phe Ser Glu Phe Ser Ala Leu Trp Pro Asp Glu Ala

    50                  55                  60

Phe Ser Leu Lys Ile Glu Lys Leu Leu Leu Gln Gly Lys Ser Asp Tyr

65                  70                  75                  80

Gln Asp Val Met Leu Phe Glu Ser Ala Thr Tyr Gly Lys Val Leu Thr

                85                  90                  95

Leu Asp Gly Ala Ile Gln His Thr Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Thr

            100                 105                 110

Glu Val Ile Val His Leu Pro Leu Gly Ser Ile Pro Ser Pro Lys Lys

        115                 120                 125

Val Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Gly Phe Thr Leu Phe Glu Val Ser

    130                 135                 140

Arg Tyr Pro Thr Ile Glu Thr Ile Asp Ile Val Glu Ile Asp Asp Val

145                 150                 155                 160

Val Val Asp Val Ser Arg Lys Tyr Phe Pro Tyr Leu Ala Ala Gly Phe

                165                 170                 175

Asp Asp Pro Arg Val Thr Leu Ile Ile Gly Asp Gly Ala Ala Phe Val

            180                 185                 190

Lys Ala Ala Gln Pro Gly Tyr Tyr Asp Ala Ile Ile Val Asp Ser Ser

        195                 200                 205

Asp Pro Ile Gly Pro Ala Lys Asp Leu Phe Glu Arg Pro Phe Phe Glu

210                 215                 220

Ala Val Ala Lys Ala Leu Arg Pro Gly Gly Val Val Cys Thr Gln Ala

225                 230                 235                 240

Glu Ser Ile Trp Leu His Met His Leu Ile Glu Gln Ile Ile Ala Asn

                245                 250                 255

Cys Arg Gln Val Phe Lys Gly Ser Val Asn Tyr Ala Trp Thr Thr Val

            260                 265                 270

Pro Thr Tyr Pro Thr Gly Val Ile Gly Tyr Met Leu Cys Ser Thr Glu

        275                 280                 285

Gly Pro Glu Val Asn Phe Lys Asn Pro Val Asn Ser Ile Asp Lys Asp

    290                 295                 300

Thr Ser His Val Lys Ser Lys Gly Pro Leu Lys Phe Tyr Asn Ser Asp

305                 310                 315                 320

Ile His Lys Ala Ala Phe Ile Leu Pro Ser Phe Ala Arg Asp Leu Val

                325                 330                 335

Glu Phe

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<400>3

atggaggtca taagcaacca c

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<400>4

tcaaaattca accaaatccc tc

Claims (7)

1.一种三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种质粒，其特征在于，所述质粒含有权利要求1所述的基因序列。

4.一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体含有权利要求1所述的基因序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1所述的基因序列。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞或三分三细胞。

7.一种权利要求1所述的三分三1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1的应用，其特征在于，用权利要求1所述的1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因1制备转基因三分三。