CN101168739A - 三分三托品酮还原酶ⅱ基因及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三分三托品酮还原酶II基因及其编码的蛋白质与用途，填补了从我国云南特有的药用植物三分三中分离克隆出托品酮还原酶II基因的空白。本发明所提供的三分三托品酮还原酶II基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明提供的托品酮还原酶II基因对于通过反义基因技术来提高三分三等植物中莨菪烷生物碱的含量具有显著作用，可广泛应用于产托品烷生物碱的资源植物的品质改良。

Description

三分三托品酮还原酶Ⅱ基因及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及在三分三中表达的托品酮还原酶II基因及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

莨菪烷生物碱如莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)等，主要是从茄科植物如颠茄、曼陀罗、莨菪及三分三(Anisodus scutangulus)等中提取到的，在医用方面是作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛的功能。此外，还具有改善微循环的作用，临床上可用于治疗微循环障碍性疾病。由于我国学者的努力，莨菪烷生物碱的临床应用遍及内科、外科、妇产科、神经科、皮肤科、耳鼻喉科等，能治疗100多种疾病，市场需求十分巨大。

药用植物三分三，为茄科多年生草本植物，主要分布于我国云南西北部，在云南民间它作为解痉镇痛的中药使用已有悠久历史。三分三根部富含莨菪烷生物碱，据报道，野生三分三干燥品总生物碱含量高达1.2％，所含生物碱含量比世界上一些常用的茄科植物如颠茄、莨菪曼陀罗等均高的多。根据记载，七年生三分三总生物碱含量可高达5％。实验表明，三分三所含生物碱绝大部分是莨菪烷类生物碱。随着市场对莨菪烷生物碱的需求不断扩大，寻找可以大量生产莨菪烷生物碱的替代方法已成为当前研究的热点。近年来基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高托品烷生物碱含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将莨菪碱生物合成途径中的关键酶基因导入资源植物中，获得转基因植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高莨菪烷生物碱含量的最佳途径之一。

托品酮还原酶II(Tropinone reductase II，TRII)是整个莨菪碱生物合成途径中的一个重要的分支催化酶，它和托品酮还原酶I(Tropinone reductase I)分别催化托品烷生物碱合成途径中的一个重要分支点的两个分支。其中托品酮还原酶I(TRI)专一的将托品酮的3-酮基还原成3α-羟基从而生成莨菪醇(3α-hydroxytropane)，而TRII则将托品酮的3-酮基还原成3β-羟基从而生成假莨菪醇(3β-hydroxytropane)。莨菪醇沿TRI支路最终生成莨菪碱和东莨菪碱，而假莨菪醇沿另一条支路最终生成Calystegines。这两个酶的活力比值将决定代谢流在这一分支点的流向，因为目前在植物体内莨菪醇和假莨菪醇的互变还没有被发现。利用反义基因技术来抑制资源植物如三分三等中托品酮还原酶II(Anisodus acutangulus Tropinone reductase II，AaTRII)的活性，从而减少旁路途径终产物Calystegines的合成，推动更多的代谢流流向目标途径继而生成更多的莨菪碱和东莨菪碱，因此，克隆托品酮还原酶II的编码基因有着十分重要的医学价值。

在对现有文献的分析中，“Plant Physiology(植物生理)，1993，103，1465-1466”报道了从莨菪中克隆了托品酮还原酶II基因，但至今尚未有从我国云南特有的药用植物三分三中分离克隆出托品酮还原酶II的文献报道。由于这个基因编码的酶对于莨菪烷生物碱的合成具有重要影响，因此，这一步是利用基因工程技术来调控莨菪烷生物碱生物合成的重要切入点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三分三托品酮还原酶II基因及其编码的蛋白质与用途，以填补从我国云南特有的药用植物三分三中分离克隆出托品酮还原酶II基因的空白。

本发明所提供的三分三托品酮还原酶II基因，是具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本发明所提供的三分三托品酮还原酶II基因编码的蛋白质，是具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

含有本发明的三分三托品酮还原酶II基因全序列或部分片段的质粒和植物表达载体均属于本发明的保护范围。

一种宿主细胞，该细胞含有本发明的三分三托品酮还原酶II基因或质粒或植物表达载体的基因序列。

所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞或其它植物细胞。

所述宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或三分三发根细胞。

本发明的三分三托品酮还原酶II基因的应用，包括用所述的植物表达载体转化三分三细胞或者用所述的农杆菌与三分三细胞共培养或者用所述的三分三发根细胞培育雄性不育植株或者用所述的托品酮还原酶II基因序列提供一种转基因三分三。

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下：

本发明所说的三分三托品酮还原酶II基因的DNA分子包括：编码具有三分三托品酮还原酶II活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.1中从核苷酸第92-874位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第92-874的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第92-874位的核苷酸序列。

本发明分离出的三分三托品酮还原酶II多肽包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中术语“三分三托品酮还原酶II(或多肽)基因”指：编码具有三分三托品酮还原酶II活性的多肽的核苷酸序列，如SEQID NO.1中第92-874位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第92-874位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第92-874位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第92-874位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第92-874位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的三分三托品酮还原酶II相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明中术语“三分三托品酮还原酶II蛋白或多肽”指：具有三分三托品酮还原酶II活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然三分三托品酮还原酶II相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括三分三托品酮还原酶II的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。

本发明的三分三托品酮还原酶II多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与三分三托品酮还原酶IIDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用三分三托品酮还原酶II多肽的血清获得的多肽或蛋白。

本发明中三分三托品酮还原酶II保守性变异多肽指：与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1.保守性变异多肽中的取代残基

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn

Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括三分三托品酮还原酶II或多肽的类似物。这些类似物与天然托品酮还原酶II多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的三分三托品酮还原酶I I多肽时，可以将三分三托品酮还原酶II基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三分三托品酮还原酶I I表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

本发明还可用Northern印迹法技术分析三分三托品酮还原酶II基因产物的表达，即分析三分三托品酮还原酶II的RNA转录物在细胞中的存在和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有三分三托品酮还原酶II核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码三分三托品酮还原酶II的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在三分三托品酮还原酶II核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于三分三托品酮还原酶II核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的三分三托品酮还原酶II核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选三分三托品酮还原酶II源基因或同源蛋白。

为了得到与三分三托品酮还原酶II基因相关的三分三cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选三分三cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对三分三托品酮还原酶II基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自三分三的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与三分三托品酮还原酶II的基因家族的核苷酸序列。

本发明的三分三托品酮还原酶II核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的三分三托品酮还原酶II，通过各种常规筛选方法，可筛选出与三分三托品酮还原酶II发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。

本发明提供的托品酮还原酶II基因是首次从三分三中克隆制备的，可以通过基因工程技术(如反义基因抑制技术)用来提高三分三等植物中莨菪烷生物碱的含量，转基因结果显示，三分三托品酮还原酶II基因对促进托品烷生物碱含量的提高有明显作用，可广泛应用于产托品烷生物碱的资源植物的品质改良。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1(三分三托品酮还原酶II基因的克隆)

1.组织分离(isolation)

三分三植株来源于云南丽江，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据莨菪及其它茄科植物的TRII氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3′-RACE

PCR(UPM+F2)得到AaTRIIF2′(842bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知托品酮还原酶II基因(如莨菪托品酮还原酶II基因等)的同源性很高，故初步认为它是一个托品酮还原酶II基因。

(2)5′-RACE

根据3′RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到AaTRIIR2′(467bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。将测序结果与3′RACE结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。

(3)将5′RACE测序结果与3′RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增AaTRII编码区(AaTRIIKF1+AaTRIIKR1)得到AaTRII编码区(783bp)(过程同步骤(1))。

BLAST的结果证明从三分三中新得到的基因确为一个托品酮还原酶II基因。由于已知的同源的来源于曼陀罗的托品酮还原酶II对于莨菪烷生物碱的合成具有重要影响(Ute Richter等，2005)，故推测此基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的三分三AaTRII蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物AaTRIF1：5′-AAATCAACTCGAGGACCACTTCA-3′(SEQ ID NO.3)为正向引物，寡核苷酸AaTRIRI：5′-CACAAGAATTTATTATACACAGTC-3′(SEQ ID NO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 1分钟、60℃ 1分钟和72℃ 2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1097bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。

实施例2  (三分三托品酮还原酶II基因的序列信息与同源性分析)

本发明新的三分三托品酮还原酶II全长cDNA的长度为1097bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于92-874位核苷酸。根据全长cDNA推导出三分三托品酮还原酶II的氨基酸序列，共260个氨基酸残基，分子量28.291KD，pI为5.35，详细序列见SEQ ID NO.2。

将三分三托品酮还原酶II的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与莨菪TRII基因(GenBank Accession No.L20485)具有92％的同源性(见表2)；在氨基酸水平上，它与莨菪TRII(GenBank AccessionNo.AAB09776)的第1-260位氨基酸残基有97％的相同性和98％的相似性(见表3)。由上可见，三分三托品酮还原酶II基因与莨菪托品酮还原酶II基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。故可以认为三分三托品酮还原酶II在提高资源植物中莨菪烷生物碱的含量上也具有相似的作用。

表2.本发明的三分三AaTRII与莨菪(Hyoscyamus niger)HnTRII的核苷酸序列的同源比较(GAP)表

Query 64

TTTCAAGTTCTTCAACAATTTGCAGGTTATGGCAGGAAGGTGGAATCTTGAAGGCTGCAC 123

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Sbjct  31

TTTCCACTTCTCCTACAATTTTCAAGTTATGGCTGGCAGGTGGAATCTTGAAGGCTGCAC 90

Query  124

TGCCCTTGTTACTGGTGGCTCTCGAGGCATAGGGTATGGGATCGTAGAGGAATTAGCAAG  183

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Sbjct  91

TGCCCTTGTTACTGGTGGCTCGCGAGGCATAGGGTATGGGATCGTAGAGGAATTAGCAAA  150

Query  184

TCTTGGAGCATCAGTTTATACATGTTCACGTAATCAAAAGGAGCTTAATGGGTGTTTGAC  243

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Sbjct  151

TCTTGGAGCATCAGTTTATACATGTTCACGTAATCAAAAGGAGCTTGATGAGTGTTTAAC  210

Query  244

TCAATGGAGAAGTAAGGGTTTTAATGTTGAAGCTTCTGTTTGTGATTTATCATCAAGATC  303

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Sbjct  211

TCAATGGAGAAGTAAAGGTTTTAATGTTGAAGCTTCTGTTTGTGATTTATCATCAAGATC  270

Query  304

TGAACGAGAGGAGTTTATGAAGACTGTATCTAATCATTTCGATGGAAAACTCAATATTTT  363

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Sbjct  271

TGAACGAGAAGAGTTTATGAAGACTGTATCTAATCATTTCCATGGAAAACTCAATATTTT  330

Query  364

GGTAAATAATGCTGGTATTGTCATATACAAGGAAGCTAAAGATTACACTATGGAAGATTA  423

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Sbjct  331

GGTAAATAATGCTGGTATTGTCATATACAAGGAAGCTAAAGATTACACTATGGAAGATTA  390

Query  424

CTCTC-TGATTATGAGCATCAACTTTGAGGCTGCTTACCACTTATCTGTACTTGCACACC  482

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Sbjct  391

CTCTCAT-ATTATGAGCATAAACTTTGAGGCTGCTTATCACTTATCTGTACTTGCACATC  449

Query  483

CCTTTCTGAAGGCATCAGAAAGGGGAAATGTTGTCTTTATTTCTTCTATTTCTGGGGCTT  542

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Sbjct  450

CCTTTTTGAAGGCATCAGAAAGGGGAAATGTTGTATTTATTTCCTCCATTTCTGGGGCTT  509

Query  543

CAGCACTTCCATATGAGGCTGTCTATGGAGCAACCAAAGGAGCAATGGACCAACTCACAA  602

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Sbjct  510

CTGCACTACCATATGAGGCTGTTTATGGAGCAACCAAAGGAGCAATGGACCAACTGACAA  569

Query  603

GATGTTTGGCGTTCGAGTGGGCAAAGGACAACATTCGTGTCAATGGCGTTGCACCAGGGG  662

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Sbjct  570

GATGCTTGGCGTTTGAGTGGGCAAAGGACAATATTCGTGTCAATGGTGTTGGACCTGGGG  629

Query  663

TTATTGCAAGTTCTATGGTCGAAATGACTATTCAAGATCCGGAGCAAAAAGAAAACTTGG  722

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Sbjct  630

TTATTGCAACTTCTATGGTCGAAATGACTATTCAAGATCCAGAACAAAAAGAAAACTTGG  689

Query  723

ATAAGCTGATTGATAGATGTGCTCTCCGACGAATGGGAGAGCCTAAAGAACTTGCAGCAG  782

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Sbjct  690

ATAAGCTGATTGATAGATGTGCTCTCCGGCGAATGGGAGAGCCCAAAGAACTTGCAGCAG 749

Query  783

TGGTTGCATTCCTCTGTTTCCCTGCTGCTTCATATGTCACTGGCCAAATTATATATGTTG 842

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Sbjct  750

TGGTTGCATTCCTCTGTTTCCCTGCTGCTTCATATGTCACTGGCCAAATTATCTATGTTG 809

Query  843

TGGTGGATTTATGGCTAATGGTGGGTTTTAATCAT-CCTTTAATTTGTC-T-T-TGCTT  898

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Sbjct  810

ATGGTGGATTTATGGCTAATGGTGGTTTTTAAT-ATTCCTTTAATTTATCATATCTGCCT 868

Query  899

TTGTGAA--TTATCAAATAACTACTCAAAGTAGTTTGCTTTAGGGGTG-AAATAAAGG   953

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Sbjct  869

TTGTAAACATTGTCGAATAATTA-TCCA-G-AGTTT--TT--GTGGTGGAAATAAAGG   919

其中：Query表示三分三AaTRI I的核酸序列；Sbjct表示莨菪HnTRII的核酸序列(GenBank Accession No.L20485)。

结果：在898个核苷酸的比对中两者有92％的相似性。

表3.本发明的三分三的托品酮还原酶II与莨菪的托品酮还原酶II氨基酸序列的同源比较(FASTA)表

Query 1

MAGRWNLEGCTALVTGGSRGIGYGIVEELASLGASVYTCSRNQKELNGCLTQWRSKGFNV 60

MAGRWNLEGCTALVTGGSRGIGYGIVEELA+LGASVYTCSRNQKEL+CLTQWRSKGFNV

Sbjct  1

MAGRWNLEGCTALVTGGSRGIGYGIVEELANLGASVYTCSRNQKELDECLTQWRSKGFNV 60

Query  61

EASVCDLSSRSEREEFMKTVSNHFDGKLNILVNNAGIVIYKEAKDYTMEDYSLIMSINFE 120

EASVCDLSSRSEREEFMKTVSNHFGKLNILVNNAGIVIYKEAKDYTMEDYSIMSINFE

Sbjct  61

EASVCDLSSRSEREEFMKTVSNHFHGKLNILVNNAGIVIYKEAKDYTMEDYSHIMSINFE 120

Query 121

AAYHLSVLAHPFLKASERGNVVFISSISGASALPYEAVYGATKGAMDQLTRCLAFEWAKD 180

AAYHLSVLAHPFLKASERGNVVFISSISGASALPYEAVYGATKGAMDQLTRCLAFEWAKD

Sbjct  121

AAYHLSVLAHPFLKASERGNVVFISSISGASALPYEAVYGATKGAMDQLTRCLAFEWAKD 180

Query 181

NIRVNGVAPGVIASSMVEMTIQDPEQKENLDKLIDRCALRRMGEPKELAAVVAFLCFPAA 240

NIRVNGV PGVIA+SMVEMTIQDPEQKENLDKLIDRCALRRMGEPKELAAVVAFLCFPAA

Sbjct  181

NIRVNGVGPGVIATSMVEMTIQDPEQKENLDKLIDRCALRRMGEPKELAAVVAFLCFPAA 240

Query 241 SYVTGQIIYVDGGFMANGGF 260

SYVTGQIIYVDGGFMANGGF

Sbjct 241 SYVTGQI IYVDGGFMANGGF 260

其中：Query表示三分三AaTRII的氨基酸序列；Sbjct表示莨菪HnTRII的氨基酸序列(GenBank Accession No.AAB09776)；相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

结果：在260个氨基酸的比对中，两者分别有97％的相同性和98％的相似性。

实施例3(三分三托品酮还原酶II或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯)

在该实施例中，将全长的三分三AaTRII编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1、原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌

根据三分三AaTRII的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将三分三AaTRII基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-AaTRII表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-AaTRII。

2、表达Trx-AaTRI重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-AaTRII工程菌于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-AaTRII融合蛋白的工程菌。

3、Trx-AaTRI融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达Trx-AaTRII融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-AaTRII，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH 11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HClpH 7.9)洗脱来收集Trx-AaTRII融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获的AaTRII的表达蛋白。

实施例4(三分三托品酮还原酶II或多肽在三分三中进行真核细胞表达及转基因发根中莨菪碱和东莨菪碱含量测定)

含目的基因(三分三托品酮还原酶II基因)的表达载体的构建，根据三分三托品酮还原酶II的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将三分三托品酮还原酶II基因cDNA反向克隆到双元表达载体(如pBI121)，将其转入农杆菌中，遗传转化资源植物三分三。利用发根农杆菌Ri质粒介导的三分三的遗传转化：

1)发根农杆菌C58C1。使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜。

2)经种子萌发生长8周左右的三分三的无菌嫩叶片。

3)经过夜培养的菌液，用转化液稀释为100个细菌/mL。取无菌三分三叶片，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化中，60rpm/mi n振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。

4)把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有100mL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用。

5)含三分三托品酮还原酶II基因的转基因发根的莨菪碱和东莨菪碱含量测定按Zhang等(PNAS，2004)的方法对表达三分三托品酮还原酶II基因的转基因发根进行莨菪碱和东莨菪碱含量测定。结果表明，在表达三分三托品酮还原酶II基因的转基因发根中托品烷生物碱含量同非转基因对照上的相比显著提高(P＜0.05)。因此转基因结果证明，三分三托品酮还原酶II基因对促进托品烷生物碱含量的提高有明显作用，可广泛应用于产托品烷生物碱的资源植物的品质改良。

核苷酸序列表

<110>上海师范大学

<120>三分三托品酮还原酶II基因及其编码的蛋白质和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1116

<212>DNA

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<221>CDS

<222>(92)..(874)

<400>1

aaatcaactc gaggaccact tcattaaaac aacattaaaa acttgtctaa agcccatttc  60

cattttcaag ttcttcaaca atttgcaggt t atg gca gga agg tgg aat ctt     112

                                    Met Ala Gly Arg Trp Asn Leu

                                    1               5

gaa ggc tgc act gcc ctt gtt act ggt ggc tct cga ggc ata ggg tat    160

Glu Gly Cys Thr Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Tyr

        10                   15                 20

ggg atc gta gag gaa tta gca agt ctt gga gca tca gtt tat aca tgt    208

Gly Ile Val Glu Glu Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Tyr Thr Cys

    25                  30                  35

tca cgt aat caa aag gag ctt aat ggg tgt ttg act caa tgg aga agt    256

Ser Arg Asn Gln Lys Glu Leu Asn Gly Cys Leu Thr Gln Trp Arg Ser

40                  45                  50                  55

aag ggt ttt aat gtt gaa gct tct gtt tgt gat tta tca tca aga tct    304

Lys Gly Phe Asn Val Glu Ala Ser Val Cys Asp Leu Ser Ser Arg Ser

                60                    65                  70

gaa cga gag gag ttt atg aag act gta tct aat cat ttc gat gga aaa    352

Glu Arg Glu Glu Phe Met Lys Thr Val Ser Asn His Phe Asp Gly Lys

            75                  80                  85

ctc aat att ttg gta aat aat gct ggt att gtc ata tac aag gaa gct    400

Leu Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Val Ile Tyr Lys Glu Ala

        90                  95                  100

aaa gat tac act atg gaa gat tac tct ctg att atg agc atc aac ttt    448

Lys Asp Tyr Thr Met Glu Asp Tyr Ser Leu Ile Met Ser Ile Asn Phe

    105                 110                 115

gag gct gct tac cac tta tct gta ctt gca cac ccc ttt ctg aag gca    496

Glu Ala Ala Tyr His Leu Ser Val Leu Ala His Pro Phe Leu Lys Ala

120                 125                 130                 135

tca gaa agg gga aat gtt gtc ttt att tct tct att tct ggg gct tca    544

Ser Glu Arg Gly Asn Val Val Phe Ile Ser Ser Ile Ser Gly Ala Ser

                140                 145                 150

gca ctt cca tat gag gct gtc tat gga gca acc aaa gga gca atg gac    592

Ala Leu Pro Tyr Glu Ala Val Tyr Gly Ala Thr Lys Gly Ala Met Asp

            155                 160                 165

caa ctc aca aga tgt ttg gcg ttc gag tgg gca aag gac aac att cgt    640

Gln Leu Thr Arg Cys Leu Ala Phe Glu Trp Ala Lys Asp Asn Ile Arg

        170                 175                 180

gtc aat ggc gtt gca cca ggg gtt att gca agt tct atg gtc gaa atg    688

Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Val Ile Ala Ser Ser Met Val Glu Met

    185                 190                 195

act att caa gat ccg gag caa aaa gaa aac ttg gat aag ctg att gat    736

Thr Ile Gln Asp Pro Glu Gln Lys Glu Asn Leu Asp Lys Leu Ile Asp

200                 205                 210                 215

aga tgt gct ctc cga cga atg gga gag cct aaa gaa ctt gca gca gtg    784

Arg Cys Ala Leu Arg Arg Met Gly Glu Pro Lys Glu Leu Ala Ala Val

                220                 225                 230

gtt gca ttc ctc tgt ttc cct gct gct tca tat gtc act ggc caa att    832

Val Ala Phe Leu Cys Phe Pro Ala Ala Ser Tyr Val Thr Gly Gln Ile

            235                 240                 245

ata tat gtt gat ggt gga ttt atg gct aat ggt ggg ttt taa            874

Ile Tyr Val Asp Gly Gly Phe Met Ala Asn Gly Gly Phe

        250                 255                 260

tcatccttta atttgtcttt gcttttgtga attatcaaat aactactcaa agtagtttgc  934

tttaggggtg aaataaaggt tttaagtcca tttaattcta gaatgacagt tttagagtaa  994

cggtaaatgt gttattacgt gagtaggaag tcatgggttc aagcagtggg aaaaaatgtc 1054

ttgcataaat acaaaataag actgtgtata ataaattctt gtgaaaaaaa aaaaaaaaaa 1114

aa                                                               1116

<210>2

<211>260

<212>PRT

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<400>2

Met Ala Gly Arg Trp Asn Leu Glu Gly Cys Thr Ala Leu Val Thr Gly

1               5                   10                  15

Gly Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Gly Ile Val Glu Glu Leu Ala Ser Leu

            20                   25                 30

Gly Ala Ser Val Tyr Thr Cys Ser Arg Asn Gln Lys Glu Leu Asn Gly

        35                  40                  45

Cys Leu Thr Gln Trp Arg Ser Lys Gly Phe Asn Val Glu Ala Ser Val

    50                  55                  60

Cys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Glu Arg Glu Glu Phe Met Lys Thr Val

65                  70                  75                  80

Ser Asn His  Phe Asp Gly Lys Leu Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly

                 85                  90                  95

Ile Val Ile Tyr Lys Glu Ala Lys Asp Tyr Thr Met Glu Asp Tyr Ser

            100                 105                 110

Leu Ile Met Ser Ile Asn Phe Glu Ala Ala Tyr His Leu Ser Val Leu

        115                 120                 125

Ala His Pro Phe Leu Lys Ala Ser Glu Arg Gly Asn Val Val Phe Ile

    130                 135                 140

Ser Ser Ile Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro Tyr Glu Ala Val Tyr Gly

145                 150                 155                 160

Ala Thr Lys Gly Ala Met Asp Gln Leu Thr Arg Cys Leu Ala Phe Glu

                165                 170                 175

Trp Ala Lys Asp Asn Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Val Ile

            180                 185                 190

Ala Ser Ser Met Val Glu Met Thr Ile Gln Asp Pro Glu Gln Lys Glu

        195                  200                205

Asn Leu Asp Lys Leu Ile Asp Arg Cys Ala Leu Arg Arg Met Gly Glu

    210                  215                 220

Pro Lys Glu Leu Ala Ala Val Val Ala Phe Leu Cys Phe Pro Ala Ala

225                 230                 235                 240

Ser Tyr Val Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Gly Gly Phe Met Ala

                245                 250                 255

Asn Gly Gly Phe

            260

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<400>3

aaatcaactc gaggaccact tca

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>三分三(Anisodus acutangulus)

<400>4

cacaagaatt  tattatacac agtc

Claims (10)

1.一种三分三托品酮还原酶I I基因，其特征在于，所述基因具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的三分三托品酮还原酶II基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

3.一种质粒，其特征在于，所述质粒含有权利要求1所述的三分三托品酮还原酶II基因全序列或部分片段。

4.一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体含有权利要求1所述的三分三托品酮还原酶II基因全序列或部分片段。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1或3或4所述的基因序列。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞或其它植物细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或三分三发根细胞。

8.一种权利要求1所述的三分三托品酮还原酶II基因的应用，其特征在于，用权利要求4所述的植物表达载体转化三分三细胞。

9.一种权利要求1所述的三分三托品酮还原酶II基因的应用，其特征在于，用权利要求7所述的农杆菌细胞与三分三细胞共培养或者用所述的三分三发根细胞培育雄性不育植株。

10.一种权利要求1所述的三分三托品酮还原酶II基因的应用，其特征在于，用权利要求1所述的托品酮还原酶II基因序列提供一种转基因三分三。