CN102643843A - 南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在南方红豆杉中表达的新的编码1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-Deoxy-D-xylulose5-phosphatereductoisomerase，DXR）蛋白的编码序列及其在提高植物萜类化合物含量的应用。本发明涉及包含所说基因的克隆、功能验证、融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物的萜类化合物含量获得了提高。

Description

南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在植物中表达的TcDXR蛋白（南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白，1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，TcDXR）及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。

背景技术

紫杉醇是从药用植物红豆杉中分离出的具有抗癌作用的天然产物，是目前发现的最好的天然抗癌药物之一。由于红豆杉生长缓慢且紫杉醇含量非常低，所以完全不能满足患者的需求。开展红豆杉的基因工程为解决药源缺乏的问题提供了崭新的思路，而开展紫杉醇生物合成途径的分子生物学研究是实现紫杉醇基因工程的首要工作。

本发明中，我们在南方红豆杉科（Araceae）植物南方红豆杉（Taxus chinensis）中克隆到1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（TcDXR）基因。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的南方红豆杉TcDXR蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的南方红豆杉基因TcDXR，该基因是一个南方红豆杉TcDXR蛋白基因。

本发明的第二目的是提供一种新的南方红豆杉蛋白TcDXR。

本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的南方红豆杉TcDXR蛋白和核酸序列的方法。

本发明还提供了这种南方红豆杉TcDXR蛋白多肽和编码序列在提高植物萜类化合物含量上的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的南方红豆杉TcDXR蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO. 4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO. 4序列的多肽。

在本发明的另一方面，还提供了一种载体， 它包含上述的DNA分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是BL21和烟草。

在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有南方红豆杉TcDXR蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成南方红豆杉TcDXR蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成南方红豆杉TcDXR蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达南方红豆杉TcDXR蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的基本纯的多肽。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列是SEQ ID NO.3中第19-1432位的序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物萜类化合物的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含南方红豆杉TcDXR的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有南方红豆杉TcDXR蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有南方红豆杉TcDXR蛋白基因的转基因植株具有较高的萜类化合物合成能力。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列是SEQ ID NO.3中第19-1432位的序列。

本发明还提供了与TcDXR蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“南方红豆杉TcDXR蛋白(或多肽)编码序列” 指编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第19-1432位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的编码框第19-1432位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 3中第19-1432位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的南方红豆杉TcDXR相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“南方红豆杉TcDXR蛋白或多肽”指具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的SEQ ID NO. 4序列的多肽。该术语还包括具有与天然南方红豆杉TcDXR相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括南方红豆杉TcDXR蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的南方红豆杉TcDXR多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与南方红豆杉TcDXR DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗南方红豆杉TcDXR多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含南方红豆杉TcDXR多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括南方红豆杉TcDXR多肽的可溶性片段。通常，该片段具有南方红豆杉TcDXR多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“南方红豆杉TcDXR保守性变异多肽”指与SEQ ID NO. 4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽不影响三个结构域折叠成典型的V形结构，这三个结构域分别是：N-端的NADP结合结构域，C-端由四螺旋（E₃₀₁X₃₀₂X₃₀₃E₃₀₄-motif）集束而成的功能域，以及连接这两个功能域的功能域。NADP(H)结合位点是由在TcDXR一级结构上相隔较远(间隔了24个氨基酸残基)，但在三维立体机构上接近的两个Gly (Gly91和Gly116)组成，在N-端的NADPH结合结构域用绿色的小球表示出；在V形结构的内侧底部，是由高度保守的D₂₃₀X₂₃₁E ₂₃₂-motif和E₃₀₁X₃₀₂X₃₀₃E₃₀₄-motif组成DXR活性位点，DXE和EXXE在一级结构上相隔较远，但是经过折叠而聚集在一起，成为DXR的活性位点。

发明还包括南方红豆杉TcDXR蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然南方红豆杉TcDXR多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的南方红豆杉TcDXR多肽时，可以将南方红豆杉TcDXR编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成南方红豆杉TcDXR蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA; 如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列; 如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为原核或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括BL21，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用荧光定量PCR技术分析南方红豆杉TcDXR基因产物的表达，即分析南方红豆杉TcDXR的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

南方红豆杉TcDXR RNA的Northern印迹分析和南方红豆杉TcDXR特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实南方红豆杉TcDXR在生物样本中的表达。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有南方红豆杉TcDXR核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码南方红豆杉TcDXR的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在南方红豆杉TcDXR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于南方红豆杉TcDXR核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的南方红豆杉TcDXR核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选南方红豆杉TcDXR同源基因或同源蛋白。

为了得到与南方红豆杉TcDXR基因相关的南方红豆杉cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选南方红豆杉cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对南方红豆杉TcDXR的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自南方红豆杉的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech， Stratagene，Palo Alto， Cal.。这种筛选方法可以识别与南方红豆杉TcDXR相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的南方红豆杉TcDXR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明南方红豆杉TcDXR蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart 等人，(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis， WH Freeman Co.， San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85: 2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City， CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的南方红豆杉TcDXR蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与南方红豆杉TcDXR发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1 TcDXR基因的功能验证。

具体实施方式

实施例1

南方红豆杉TcDXR基因的克隆

1．组织分离

南方红豆杉球茎来源于重庆北碚西南大学，采取南方红豆杉植物花序、幼叶材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

． RNA的分离

参见RNA Plant Buffer使用说明，方法如下：

1).取0.1 g南方红豆杉叶子，在研钵（实验前用酒精灼烧10 min后冷却备用）中液氮研磨成细粉；

2).迅速移入事先已加入0.5 mLRNA Plant Buffer的1.5 mL离心管中，振荡混匀；室温水平放置5 min；

3).4 ℃，12000 rpm离心5-10 min后，将上清移入新的1.5 mL离心管；

4).加入0.1 mL5 mol· L-1 5 mol· L-1NaCl溶液，温和混匀；

5).加入0.3 mL氯仿，上下颠倒混匀；

6).4 ℃，12000 rpm离心10 min，将上清移入新的1.5 mL离心管；

7).加入与所得上清等体积的异丙醇温和混匀后室温放置10 min；

8).4 ℃，12000 rpm离心10 min，小心除去上清后，加入1 mL 75%乙醇；

9).4 ℃，5000 rpm离心3 min，倒出液体，余液用枪头吸干，室温晾干2-3 min；

10).加入50 μL DEPC处理过的水溶解沉淀，检测纯度和浓度合格后，-70 ℃保存备用。

．基因的全长克隆

根据曼地亚红豆杉和其它植物1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，RT-PCR获得核心片段后再采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)获得3'、5'序列，在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物R1:5'- GGATTTACAGTTTTGCAGTGGCAG-3'(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸R2：5'- GCCAAAAGCCCCTCAATTAATTTTTC-3'(SEQ ID NO.2)为反向引物，以南方红豆杉总RNA为模板， 进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 45秒、58℃ 45秒和72℃ 2分钟进行30个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1756 bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO. 3所示的序列。

实施例2

南方红豆杉TcDXR基因的序列生物信息学分析与功能验证

本发明的南方红豆杉TcDXR全长cDNA的长度为1756 bp，详细序列见SEQ ID NO. 3，其中开放读框位于55-1488位核苷酸。根据全长cDNA推导出南方红豆杉TcDXR的氨基酸序列，共478个氨基酸残基，分子量为52.07kDa，pI为7.11。详细序列见SEQ ID NO. 4。

TcDXR的氨基酸序列提交到Swiss-Model进行蛋白三维结构同源性建模(molecular homologous modeling)。预测TcDXR的功能区域的立体机构为由三个结构域折叠成典型的V形，与大肠杆菌DXR的结构相似，这三个结构域分别是：N-端的NADP结合结构域，C-端由四螺旋集束而成的功能域，以及连接这两个功能域的功能域(the connective domain)。NADP(H)结合位点是由在TcDXR一级结构上相隔较远(间隔了24个氨基酸残基)，但在三维立体机构上接近的两个Gly (Gly91和Gly116)组成，在N-端的NADPH结合结构域用绿色的小球表示出；在V形结构的内侧底部，是由高度保守的D₂₃₀X₂₃₁E ₂₃₂-motif和E₃₀₁X₃₀₂X₃₀₃E₃₀₄-motif组成DXR活性位点，DXE和EXXE在一级结构上相隔较远，但是经过折叠而聚集在一起，成为DXR的活性位点(图4-6)。通过基于序列同源性的结构预测，推断TcDXR应该是一个功能蛋白。

通过把pAC-BETA质粒导入XL1-BLUE菌中，能够在该菌中重建β-胡萝卜素的生物合成下游途径，使得该菌能在本底水平上表达β-胡萝卜素，但含量很低。从理论上讲，MEP途径上的基因高效表达均可能促使宿主菌积累β-胡萝卜素；用TcDXR的编码区替换pTrc-AtDXR中的AtDXR(拟南芥DXR基因)，获得携带TcDXR基因编码区的pTrc-TcDXR，与pAC-BETA共转化大肠杆菌XL1-Blue，在氨苄霉素(Amp)和氯霉素(Cm)的双抗LB固体培养基上筛选，得到阳性克隆；挑选单克隆在28℃培养2d，菌斑变黄，与Cunningham报道的结果相同；而XL1-Blue+pAC-BETA +pTrc由于没有携带任何MEP途径上的基因的编码框，在双抗培养基上虽然可以生长，但并没有明显积累β-胡萝卜素；而XL1-Blue、XL1-Blue+pAC-BETA、XL1-Blue +pTrc-TcDXR不能在双抗培养基上生长(图1)。同时将拟南芥上的AtDXR基因克隆至pTrc构建XL1-Blue+pAC-BETA +pTrcAtDXR工程菌做对照，结果显示TcDXR与AtDXR基因具有相同的功能，既这两个基因均可以和pAC-BETA上携带的几个外源基因的共同作用下推动代谢流向下游流动，从而证明了TcDXR是一个具有DXR功能的基因。

大肠杆菌中本来存在DXR基因，但是转pAC-BETA的XL1-Blue并没有大量积累类胡萝卜素，这说明DXR催化的MEP合成CDP-ME这步反应对于萜类或异戊烯化合物的合成是一个重要的调节步骤。

实施例3

南方红豆杉TcDXR基因的序列导入甘薯

将含1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的中间载体，进一步克隆到植物双元表达载体（如pCAMBIA1380）中，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌（如EHA105、LBA4404、A4、R1000、ATCC15834等）中，转化甘薯（品种为渝薯99）胚性细胞转化方法按照刘庆昌等发明专利进行（专利申请号：02129245）。

用PCR和Southern blotting检测转基因再生植株，阳性植株在5月移栽大田，8-10月采样用荧光定量PCR检测转基因甘薯1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的表达水平和按照国标（GB/T 12291-90 ）测定类胡罗卜素含量。

由图1 所示的TcDXR基因的功能验证表明，利用大肠杆菌菌株XL1-Blue来验证TcDXR蛋白的功能，质粒pTrc携带DXR在大肠杆菌中超表达，与pAC-BETA共同推动代谢流往下游流动，生产黄色的类胡萝卜素。

SEQ ID NO. 1

<110>西南大学

<120>南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列及其应用

<140>

<141>

<160>4

<170>

<210>1

<211>24bp

<212>寡核苷酸

<213>人工序列

<400>1

5’- GGATTTACAGTTTTGCAGTGGCAG -3’

 

SEQ ID NO. 2

<210>2

<211>26bp

<212>寡核苷酸

<213>人工序列

<400>2

5’- GCCAAAAGCCCCTCAATTAATTTTTC -3’

 

SEQ ID NO. 3

<210>3

<211>1756bp

<212>PRT

<213>南方红豆杉(Taxus chinensis)

<400>3

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ctctggcact gaagagaatg aatatcttga ccaggcagtt gagcaaatca gttctagtca 1680   

tttattttca gtattgtttg tacaaatatc tgaaaagaag caaaagttca gaaaaattaa 1740   

ttgaggggct tttggc 1756。

 

SEQ ID NO. 4

<210>4

<211>478

<212>DNA

<213>南方红豆杉(Taxus chinensis)

<400>4

Met Ala Leu Lys Ile Ala Pro Thr Ser Glu Leu Cys Thr Ser Ser

1               5                   10                  15

Leu Leu Gly Ser Thr Ser Gly Leu Ala Ser Ser Gly Ser Thr Lys

                20                  25                  30

Phe Thr Gly Gln Lys Leu Arg Phe Gly Leu Ser Phe Lys Ser Arg

                35                  40                  45

Thr Lys Lys Ala Cys Thr Arg Ala Ala Arg Cys Ser Ile Gln Ala

                50                  55                  60

Pro Pro Pro Ala Trp Pro Gly Thr Ala Leu Val Asp Glu Asp Arg

                65                  70                  75

Lys Val Trp Asp Gly Pro Lys Pro Phe Ser Ile Ile Gly Ser Thr

                80                  85                  90

Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Asp Ile Val Ala Glu His Pro

                95                  100                 105

Asp Lys Phe Lys Val Val Ala Leu Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr

                110                 105                 120

Leu Leu Ala Glu Gln Val Arg Met Phe Lys Pro Lys Leu Val Ser

                125                 130                 135

Val Arg Asn Glu Ser Leu Ala Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ala

                140                 145                 150

Asp Ile Glu His Lys Pro Glu Ile Val Tyr Gly Asp Glu Gly Met

                155                 160                 165

Val Glu Val Ala Gln His Pro Glu Ala Val Ser Val Val Thr Gly

                170                 175                 180

Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala Ile Glu

                185                 190                 195

Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala

                200                 205                 210

Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala His Lys His Lys Val Lys

                215                 220                 225

Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile

                230                 235                 240

Gln Gly Leu Pro Glu Arg Ser Ser Ala Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser

                245                 250                 255

Phe Trp Arg Ile Ile Leu Glu Ile Gly Pro Val Glu Lys Leu Lys

                260                 265                 270

Glu Val Lys Val Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met

                275                 280                 285

Gly Lys Lys Ile Thr Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly

                290                 295                 300

Leu Glu Val Ile Glu Ala His Tyr Leu Tyr Gly Val Asp Tyr Asp

                305                 310                 315

Asn Ile Glu Ile Val Ile His Pro Gln Ser Ile Ile His Ser Met

                320                 325                 330

Val Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro

                335                 340                 345

Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr Met Ser Trp Pro Glu Arg

                350                 355                 360

Val Pro Cys Ser Glu Ile Thr Trp Pro Arg Leu Asp Leu Cys Lys

                365                 370                 375

Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Ala Pro Asp Cys Val Lys Tyr Pro

                380                 385                 390

Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ser Ala Gly Arg Ala Gly Gly Thr Met

                395                 400                 405

Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Leu Phe

                410                 415                 420

Ile Asp Glu Arg Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val Glu

                425                 430                 435

Lys Thr Cys Asn Lys His Arg Asn Glu Leu Val Leu Arg Pro Ser

                440                 445                 450

Leu Glu Glu Ile Ile His Cys Asp Leu Trp Ala Arg Lys Tyr Ala

                455                 460                 465

Ala Ser Leu Ala Gln Ser Ser Leu Glu Pro Ala Met Val *

                470                 475         478

 

Claims (10)

1.南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征在于，它包括：编码具有南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，TcDXR）蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列杂交。

2.南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征在于：编码具有南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，TcDXR）蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列由SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列所构成。

3.如权利要求2所述南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征在于，所述编码序列由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的多肽构成。

4.一种分离出的南方红豆杉TcDXR蛋白多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO. 4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物；最好地，该多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。

5.一种可用作探针的核酸分子，其特征在于，该分子是权利要求1或2所述的南方红豆杉TcDXR核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸，该探针是用于检测样品中是否存在编码南方红豆杉TcDXR的核酸分子。

6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1或2所述的南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列。

7.一种用权利要求1或2所述南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列转化的宿主细胞，其特征在于它是原核或真核细胞。

8.一种产生具有南方红豆杉TcDXR蛋白质活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下：

(1)将编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成南方红豆杉TcDXR蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成TcDXR蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达南方红豆杉TcDXR蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的基本纯的多肽。

9.一种利用转基因技术将编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物萜类化合物的方法，特征在于其步骤如下：

(1)将编码具有南方红豆杉TcDXR蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含南方红豆杉TcDXR蛋白的植物表达载体，所述的核苷酸序列是SEQ ID NO. 3中从核苷酸第19-1432位的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞；

(3)通过筛选如抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织，转基因植物及其后代的萜类物质含量得到大幅提高。

10.权利要求1或2所述的南方红豆杉1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列在改良植物有用的萜类化合物的应用。

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