CN101928717A - 丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲨烯合酶基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次利用同源克隆技术从丹参中克隆而得，填补了从我国传统名贵中药材丹参中分离克隆出鲨烯合酶基因的空白。本发明所提供的鲨烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的鲨烯合酶基因可以通过生物技术提高植物中三萜皂苷类成分的含量，同时可用RNAi技术提高丹参中二萜类(丹参酮类)物质含量的提高。本发明在药用植物次生代谢工程研究和产业化方面具有很好的应用前景。

Description

丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及利用同源克隆技术得到丹参中萜类酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。 

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。 

萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，在药用植物中很多活性成分如紫杉醇、人参皂苷类、丹参酮IIA、雷公藤甲、乙素等均为萜类化合物。药用植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.为一味常用中药，素有“一味丹参，功同四物”的美称，具有活血化瘀，理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成分。丹参主要含有两类活性成分：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。目前在植物三萜生物合成途径研究中，由于鲨烯合酶是竞争利用法呢烯焦磷酸(FPP)来合成三萜，会影响植物体内倍半萜类、二萜类等物质合成的关键酶，因此鲨烯合酶的含量和活性决定了相关物质的产量。如将人参鲨烯合酶基因在剌五加中过表达，转化株的植物甾醇及剌五加三萜皂苷类成分增加2～2.5倍；相反，在生产青蒿酸的酵母工程菌中抑制酵母鲨烯合酶活性时，将有利于青蒿酸(倍半萜类)合成。因此，丹参鲨烯合酶的成功克隆和分析，为用基因工程手段提高其有效部位的含量提供重要基础。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参萜类酶基因及其氨基酸序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因。 

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。 

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。 

本发明所提供的丹参鲨烯合酶(SmSQS)，为以下核苷酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。 

该基因所编码的蛋白质为丹参鲨烯合酶(SmSQS)，是以下氨基酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列； 

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。 

含有本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类表达载体，真核表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围。 

含有本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。 

所述宿主细胞为有价值的活体材料。 

本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物过表达载体或干扰载体转化的生物细胞；或者用所述含有重组载体的农杆菌与相关活体材料共培养，得到转基因的植物发根系和转基因生物体。 

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下： 

所说的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因的DNA分子包括：编码具有丹参鲨烯合酶(SmSQS)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1457位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQID NO.1中从核苷酸第1-1457的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1457位的核苷酸序列。本发明分离出的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因多肽包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。 

本发明中术语“丹参鲨烯合酶(SmSQS)(或多肽)”基因指：编码具有丹参鲨烯合酶(SmSQS)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-1457位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-1457位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的 简并性，所以与SEQ ID NO.1，中第1-1457位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1457位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1457位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的丹参鲨烯合酶(SmSQS)相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为，1-90个，较佳地，1-60个，更佳地，1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。 

本发明中术语“丹参鲨烯合酶(SmSQS)蛋白或多肽”指：具有丹参鲨烯合酶(SmSQS)活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然丹参鲨烯合酶(SmSQS)相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括丹参鲨烯合酶(SmSQS)的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的丹参丹参鲨烯合酶(SmSQS)多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与丹参鲨烯合酶(SmSQS)DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用丹参鲨烯合酶(SmSQS)多肽的血清获得的多肽或蛋白。 

本发明中丹参鲨烯合酶(SmSQS)保守性变异多肽指：与SEQ ID NQ.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可根据表1，进行替换而产生。 

本发明还包括丹参鲨烯合酶(SmSQS)或多肽的类似物。这些类似物与天然丹参鲨烯合酶(SmSQS)多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以 及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。 

表1：保守性变异多肽中的取代残基 

最初的残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；IIe	Val
Arg(R)	Lys；GIn；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu

Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr

Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

在生产本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)原酶多肽时，可以将丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成丹参鲨烯合酶(SmSQS)表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 

本发明还可用Northern印迹法技术分析丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因产物的表达，即分析丹参鲨烯合酶(SmSQS)的RNA转录物在细胞中的存在和数量。 

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有丹参鲨烯合酶(SmSQS)核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码丹参鲨烯合酶(SmSQS)的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在丹参鲨烯合酶(SmSQS)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于丹参鲨烯合酶(SmSQS)核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选丹参鲨烯合酶(SmSQS)源基因或同源蛋白。 

为了得到与丹参鲨烯合酶(SmSQS)相关的丹参cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选丹参cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自丹参的文库。构建来 自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别丹参鲨烯合酶(SmSQS)的基因家族的核苷酸序列。 

本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)的基因家族的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的丹参鲨烯合酶(SmSQS)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与丹参鲨烯合酶(SmSQS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。 

本发明所提供的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因是首次从丹参中克隆制备的，填补了从我国药物植物丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因的空白。发明提供的鲨烯合酶基因可以通过转基因技术提高植物体内三萜皂苷类成分的含量，同时可用RNAi技术提高丹参中二萜类(丹参酮类)物质含量的提高，具有很好的应用前景。 

附图说明

图1：SmSQS功能域预测分析(来源于NCBI数据库)； 

图2：GC-MS分析SmSQS体外催化活性； 

图3：用于SmSQS RNAi的载体； 

图4：SmSQS RNAi转化毛状根GFP检测； 

图5：SmSQS RNAi毛状根丹参酮类化合物含量测定。 

具体实施方式

实施例1、丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因克隆 

1.丹参总RNA的分离和检测 

取陕西商洛丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25mmol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。 

2.RACE-Ready First-Strand cDNA的合成 

取总RNA样品1.0μg，按BD SMART^TM RACE cDNA amplification kit进行合成，产物加100μL Tricine-EDTA buffer混合均匀，72℃，7min后，置于-70℃保存备用。 

3.SmSQS核心基因片段的获得 

根据鲨烯合酶的同源保守区设计简并引物：Fp320：5′-TTGAYACYGTTGAGGATG-AYACNAGY-3′；Rp1022：5′-AGACCTCGCCTCANTTTNACNACNCCYC-3′。按照BDAdvantage^TM 2PCR kit操作。模板为5′RACE-Ready First-Strand cDNA；PCR条件为：94℃3min，1cycle；94℃30sec；55℃30sec；72℃2min，32cycles；72℃8min，1cycle；4℃终止。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后，测序得到DNA的序列信息。 

4.5′和3′RACE 

以PSS核心基因片段为模板，Primer 5.0设计5′和3′RACE反应引物，5PSS：5′-TAACC-CCAATCCAACAAGGCCAGCCACG-3′和3PSS：5′-AGAGGTGTCGTGAAACTGAGGCGAG-GTC-3′，按照BD SMART^TM RACE cDNA amplification kit操作。5′和3′RACE的PCR条件相同：94℃30sec；68℃30sec；72℃3min，30cycles；72℃8min，1cycle；4℃终止。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后，测序得到DNA的序列信息。 

5.获得全长PSS cDNA 

用DNAstar软件拼接出全长序列，用Primer 5.0设计扩增全长PSS cDNA PCR引物：FPSS：5′-ggtcacaatt acaaacgcac acacat-3′和RPSS：5′-gcgtgacaagcttaaacagaaacagg-3′，用5′RACE-ReadyFirst-Strand cDNA为模板，按照BD Advantage^TM 2PCR kit操作。PCR条件为：94℃30sec；59℃30sec；72℃2min，32cycles；72℃10min，1cycle；4℃终止。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收后，插入pMD19-T载体，转入大肠杆菌DH5α中。菌株在含 50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB平板上筛选，经菌落PCR验证后再测序验证。用阳性单克隆菌株提取质粒，-20℃保存。 

实施例2、SmSQS基因的生物信息学分析 

本发明涉及的丹参二萜合酶基因全长cDNA的长度为1457bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于120～1360bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的鲨烯合酶有较高的同源性，同时具有萜类酶典型的DXXDD结构域，图1。 

实施例3、丹参鲨烯合酶的功能验证 

1.表达载体构建 

含Xho I和Nco I酶切位点的F-A DNA制备 

以含全长PSS cDNA的质粒为模板，FNco：5′-GG CCATGGGGAGTTTACGTGCGATTTTGAG-3′和RXho：5′-GCCTCGAGTTAGACGGCTCTCTTTGGTGCAAAG-3′为引物，用Pyrobest DNA Polymerase高保真酶进行PCR得到目标F-A DNA。PCR反应条件：94℃4min，1cycle；94℃35sec；59℃30sec；72℃2min，32cycles；72℃8min，1cycle；4℃终止。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后，-20℃保存。 

酶切和连接反应将F-A DNA和pET-32a(+)Vector分别用Xho I，Nco I双酶切，并回收。双酶切反应体系：Xho I，1μL；Nco I，1μL；10×K buffer，2μL；BSA(0.01％)，2μL；F-A or pET-32a(+)，1μg；加去离子水至20μL。混合均匀后，瞬时离心，37℃温育3h，1％琼脂糖凝胶分离后，切胶回收。将酶切和回收后的F-A DNA与pET-32a(+)DNA经T4连接酶连接，获得F-A-Vector。将F-A-Vector转入大肠杆菌DH5α中，菌株在含50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB平板上筛选，经菌落PCR验证后再测序验证。用阳性单克隆菌株提取质粒，-20℃保存。 

2.IPTG诱发原核表达和粗蛋白的提取 

将pET-32a(+)Vector(空载体)和F-A-Vector分别转入表达菌株BL21(DE3)中，挑取阳性菌株(测序验证)转接于50mL含50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(A₆₀₀＝0.3～0.5)，约2.5h。再向LB培养基中加入100mmol·L^-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)至终浓度为0.4mmol·L^-1，32℃继续培养3.5h，离心收集表达菌体后，保存于-80℃。粗蛋白的提取参考Bacterial proteinextraction kit进行操作。提取的可溶性粗蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳分析后，将含目的蛋白的提取液过Sephadex G-25小柱，用5mmol·L^-1Tris-HCl(pH7.5)缓冲液洗脱，去除小分子后作酶液使用。 

3.体外酶功能验证 

以FPP为反应底物进行体外酶功能研究^[9]，反应体系为：3mmol·L^-1NADPHNa₄；100mmol·L^-1Tris-HCl(pH7.5)；10mmol·L^-1MgCl₂；1mmol·L^-1DTT；2％Glycerin；500μg·L^-1酶液；40μg·L^-1FPP。混匀，水浴32℃，10h。直接加入1倍体积n-hexane，vortex提取三次(1mL×3次)，合并提取液，用MgSO₄脱水30min.。真空浓缩至干，加15μL n-hexane复溶，取10μL进样，以鲨烯作为标准品，结合GC和GC-MS对产物定性，图2。 

实施例4、SmSQS RNAi载体转基因发根毛状根丹参酮类含量分析 

1.Gateway RNAi载体的构件： 

设计扩SmSQS部分基因的引物(SmSQS-RNAi-B1：GCACAAGTTTGTACAAAAA-AGCAGGCTTCACC-gatgacactagcatagcaaca；SmSQS-RNAi-B2：GCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT-tttcccagaagcatggaatagctt)。应用高保真酶进行PCR，将产物切胶回收。 

BP反应 

PCR产物	50-100ng(3.5uL)
		PDONR221	50-100ng(0.5uL)
BP Clonase酶	1.0uL(用前轻轻混合下)

A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)， 

B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。 

C.将BP反应产物经过DH5α克隆 

D.含40ug/ml kan(卡那霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证，提质粒。 

LR反应 

BP反应质粒	50-150ng(3.5uL)
		pK7GWIWG2D(ll)载体	150ng(0.5uL)
LRClonase酶	1.0uL(用前轻轻混合下)

A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)， 

B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。 

C.将BP反应产物经过DH5α克隆。 

D.含50ug/ml Spe(壮观霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证。 

所得质粒如图3，然后提质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中。 

2.ACCC10060介导基因转化 

1.外植体预培养： 

选取10天的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm 2的小块，并用刀片将叶片表面划伤，以背面向上的方式将叶片置于MS固体培养基上，于25℃左右光照16h/黑暗8h的条件下预培养2天。 

2.农杆菌的活化扩增： 

4℃保存的平板上挑取单菌落于新的含有50mg/L Rif和100mg/L壮观霉素的YEB培养基上，划线，20℃培养过夜(活化)，挑取单菌落接种于15ml含50mg/L Rif和100mg/L壮观霉素的YEB的液体培养基中，于28℃振荡培养至OD2600.5左右(250rpm约23h)，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，弃上清液，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于浸染；同时用ACCC10060菌株作为对照浸染，。 

3、浸染及共培养： 

将预培养材料放入MS重悬液中，浸染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，黑暗中共培养48-72h。 

4、选择培养： 

将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400mg/L cef水浸泡5min左右，无菌水清洗1次，吸干水分而后移入含Kan 50mg/L，400mg/L cef和适量固醇的MS固体培养基上，于黑暗中进行筛选培养，每10天更换一次培养基。选择生长迅速长至2.0cm～3.0cm的抗性毛状根，将其切下，单独标号转入50mg/L Kan，400mg/L cef和适量固醇的MS固体培养基上，将除菌后的阳性根转入含50mg/L Kan和适量固醇的MS培养基上继代培养。 

5、选择培养： 

毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP)，再经过特异引物PCR检测，选择阳性株系进行放大培养(加适量固醇的6，7V培养基)，图4。 

6、丹参酮类含量测定： 

取鲜毛状根500mg真空干燥，用MeOH提取，HPLC条件同上，测定丹参脂溶性成分含量。结果表明，含SmSQS RNAi载体的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非干扰对照组分别提高：1.5、1.3、2.0和1.4倍(如图5)。因此转基因结果证明，应用RNAi技术抑制丹参SmSQS活性，对促进丹参酮类含量的提高有明显作用，因此针对SmSQS基因的RNAi技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中具有很好的应用前景。 

SEQUENCE LISTING 

<110>中国中医科学院中药研究所 

<120>丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因及其编码的蛋白和应用 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>1457 

<212>DNA 

<213>丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 

<400>1 

ggtcacaatt acaaacgcac acacattctc tctctatatc tctctcacac acgcacacga    60 

attccatcgt cctcgcttca cgcagctgat tggaagtatt ttcagaacca cagtttgaga    120 

tggggagttt acgtgcgatt ttgaggcatc cggatgattt gtatccattg ctgaagctga    180 

aatacgcggc gagaaatgcg gagaagcaga tcccgccgga gccacactgg ggattttgtt    240 

acaccatgct tcacaaggtt tctagaagct tcggtctcgt tattcagcag ctcgataccg    300 

atcttcgcga tgctatatgc attttctatt tggttcttcg agcacttgac actgttgagg    360 

atgacactag catagcaaca gagctaaaag tacctattct gatggctttc catcgtcaca    420 

tatttgaccg agaatggcat ttttcatgcg gtacaaagga atatagagtt ctgatggacc    480 

agttccatca cgtttccact gcttttctgg agctcgcgcc tggttatcag gatgcaattg    540 

aggatattac catgagaatg ggtgcaggga tggcaaaatt tatttgcaag gaggtagaaa    600 

ccactaatga ttatgatgaa tattgtcatt acgtggctgg ccttgttgga ttggggttat    660 

ccaagctatt ccatgcttct gggaaagaag atctggctac agatgctatg tccaattcaa    720 

tgggtttatt tcttcagaaa acaaacatta tcagagatta ccttgaggat atcaatgaga    780 

taccaaagtc acgtatgttt tggcctcgtc aaatatggag taaatacgtt aacaaacttg    840 

aggacttgaa gagccaggaa aactctgtta aagcagtgca gtgcctaaat gatatggtca    900 

caaatgcttt agtgcatgta gaggactgcc tcaagtacat gtctgatttg agagatccag    960 

ctatctttcg cttttgtgcg attccacaga taatggcaat tgggacatta gctttatgct    1020 

acgacaacat tgaagtcttc agaggtgttg tgaaaatgag aagaggcctt actgctaaaa    1080 

ttatcgacag aactaaaaca atgtttgatg tgtatggtgc tttctatgac ttctctcgga    1140 

tgctgaaatt taaggttgat gacaaagatc ctaatgcggg aacgacaaaa gacagattag    1200 

atagtatctt gaaaatttgc agggactctg gcaccttaaa tgacaggaaa tcttacatta    1260 

ttgagagcgg gccccagtac aatgctgcta ttatggttgc tattttcttc atcatattag    1320 

caattcttca agcatacttt gcaccaaaga gagccgtcta atatatgatt ggtttatgcg    1380 

gatgagaact tctccttgtt gctatctacc tataagagct aattccacat acctgtttct    1440 

gtttaagctt gtcacgc                                                   1457 

<210>2 

<211>413 

<212>PRT 

<213>丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 

<400>2 

Met Gly Ser Leu Arg Ala Ile Leu Arg His Pro Asp Asp Leu Tyr Pro 

1               5                   10                  15 

Leu Leu Lys Leu Lys Tyr Ala Ala Arg Asn Ala Glu Lys Gln Ile Pro 

            20                  25                  30 

Pro Glu Pro His Trp Gly Phe Cys Tyr Thr Met Leu His Lys Val Ser 

        35                  40                  45 

Arg Ser Phe Gly Leu Val Ile Gln Gln Leu Asp Thr Asp Leu Arg Asp 

    50                  55                  60 

Ala Ile Cys Ile Phe Tyr Leu Val Leu Arg Ala Leu Asp Thr Val Glu 

65                  70                  75                  80 

Asp Asp Thr Ser Ile Ala Thr Glu Leu Lys Val Pro Ile Leu Met Ala 

                85                  90                  95 

Phe His Arg His Ile Phe Asp Arg Glu Trp His Phe Ser Cys Gly Thr 

            100                 105                 110 

Lys Glu Tyr Arg Val Leu Met Asp Gln Phe His His Val Ser Thr Ala 

        115                 120                 125 

Phe Leu Glu Leu Ala Pro Gly Tyr Gln Asp Ala Ile Glu Asp Ile Thr 

    130                 135                 140 

Met Arg Met Gly Ala Gly Met Ala Lys Phe Ile Cys Lys Glu Val Glu 

145                 150                 155                 160 

Thr Thr Asn Asp Tyr Asp Glu Tyr Cys His Tyr Val Ala Gly Leu Val 

                165                 170                 175 

Gly Leu Gly Leu Ser Lys Leu Phe His Ala Ser Gly Lys Glu Asp Leu 

            180                 185                 190 

Ala Thr Asp Ala Met Ser Asn Ser Met Gly Leu Phe Leu Gln Lys Thr 

        195                 200                 205 

Asn Ile Ile Arg Asp Tyr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Ile Pro Lys Ser 

    210                 215                 220 

Arg Met Phe Trp Pro Arg Gln Ile Trp Ser Lys Tyr Val Asn Lys Leu 

225                 230                 235                 240 

Glu Asp Leu Lys Ser Gln Glu Asn Ser Val Lys Ala Val Gln Cys Leu 

                245                 250                 255 

Asn Asp Met Val Thr Asn Ala Leu Val His Val Glu Asp Cys Leu Lys 

            260                 265                 270 

Tyr Met Ser Asp Leu Arg Asp Pro Ala Ile Phe Arg Phe Cys Ala Ile 

        275                 280                 285 

Pro Gln Ile Met Ala Ile Gly Thr Leu Ala Leu Cys Tyr Asp Asn Ile 

    290                 295                 300 

Glu Val Phe Arg Gly Val Val Lys Met Arg Arg Gly Leu Thr Ala Lys 

305                 310                 315                 320 

Ile Ile Asp Arg Thr Lys Thr Met Phe Asp Val Tyr Gly Ala Phe Tyr 

                325                 330                 335 

Asp Phe Ser Arg Met Leu Lys Phe Lys Val Asp Asp Lys Asp Pro Asn 

            340                 345                 350 

Ala Gly Thr Thr Lys Asp Arg Leu Asp Ser Ile Leu Lys Ile Cys Arg 

        355                 360                 365 

Asp Ser Gly Thr Leu Asn Asp Arg Lys Ser Tyr Ile Ile Glu Ser Gly 

    370                 375                 380 

Pro Gln Tyr Asn Ala Ala Ile Met Val Ala Ile Phe Phe Ile Ile Leu 

385                 390                 395                 400 

Ala Ile Leu Gln Ala Tyr Phe Ala Pro Lys Arg Ala Val 

                405                 410 

Claims (5)

1.丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID No.1的DNA序列；

(2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

2.丹参鲨烯合酶(SmSQS)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一：

(1)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID No.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

3.重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因全序列或部分序列。

4.活体材料，其特征在于：所述活体材料含有权利要求1所述的丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因全序列或部分序列。

5.权利要求1所述的基因在丹参育种中的应用。 

Images