CN101928716A - 丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种法呢基焦磷酸合酶基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次利用cDNA芯片技术从丹参中克隆而得，填补了从我国传统名贵中药材丹参中分离克隆出法呢基焦磷酸合酶基因的空白。本发明所提供的法呢基焦磷酸合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的法呢基焦磷酸合酶基因可以通过生物技术提高丹参中二萜类活性成分丹参酮类的含量，有助于丹参药材的品质改良，同时可以进行品种选育，具有很好的应用前景。

Description

丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及利用cDNA芯片技术克隆丹参萜类酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。 

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。 

萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，在药用植物中很多活性成分如紫杉醇、人参皂苷类、丹参酮IIA、雷公藤甲、乙素等均为萜类化合物。药用植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.为一味常用中药，素有“一味丹参，功同四物”的美称，具有活血化瘀，理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成分。丹参主要含有两类活性成分：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。目前在植物萜类生物合成途径研究中，法呢基焦磷酸(法呢基焦磷酸合酶的产物)不但可以作为二萜类酶的底物，同时也是植物体内三萜类合酶的底物，它的活性程度直接影响到植物体内二萜类、倍半萜类和三萜类的物质的含量及比例。因此法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的克隆和分析，为用基因工程手段提高丹参有效部位的含量提供重要基础。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参萜类酶基因及其氨基酸序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因。 

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。 

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。 

本发明所提供的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)，为以下核苷酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。 

该基因所编码的蛋白质为丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)，是以下氨基酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列； 

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。 

含有本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围。 

含有本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。 

所述宿主细胞为有价值的活体材料。 

本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。 

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下： 

所说的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因的DNA分子包括：编码具有丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1494位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1494的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1494位的核苷酸序列。本发明分离出的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因多肽包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。 

本发明中术语“丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)(或多肽)”基因指：编码具有丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-1494位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-1494位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1，中第1-1494位核苷酸序列同源性低至约70％的简 并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1494位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1494位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为，1-90个，较佳地，1-60个，更佳地，1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。 

本发明中术语“丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)蛋白或多肽”指：具有丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的丹参丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)多肽的血清获得的多肽或蛋白。 

本发明中丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)保守性变异多肽指：与SEQ ID NQ.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可根据表1，进行替换而产生。 

本发明还包括丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)或多肽的类似物。这些类似物与天然丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基 酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。 

表1：保守性变异多肽中的取代残基 

最初的残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；IIe	Val
Arg(R)	Lys；GIn；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu

Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

在生产本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)原酶多肽时，可以将丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 

本发明还可用Northern印迹法技术分析丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因产物的表达，即分析丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)的RNA转录物在细胞中的存在和数量。 

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)源基因或同源蛋白。 

为了得到与丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)相关的丹参cDNAs的点阵，可以用DNA 探针筛选丹参cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自丹参的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)的基因家族的核苷酸序列。 

本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)的基因家族的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-hase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。 

本发明所提供的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因是首次从丹参中克隆制备的，填补了从我国药物植物丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因的空白。利用本发明可以通过基因工程技术来提高丹参等植物中萜类活性成分丹参酮类物质的含量，转基因结果显示，丹参丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用。丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因可通过转基因技术用于提高丹参酮含量的研究和产业化，尤其可用于中药材丹参的品质改良，能缓解丹参酮类药源严重匾乏问题，对提高丹参酮类物质产量具有较好的促进作用，具有很好的应用前景。 

附图说明：

图1：SmFPS系统进化树(邻接法)； 

图2：SmFPS功能域预测分析(来源于NCBI数据库)； 

图3：YE+Ag⁺处理丹参毛状根后，SmFPS RNA相对量：0；1；2；4；6；9分别代表0；1；2；4；6；9天； 

图4：YE+Ag⁺处理丹参毛状根后，SmFPS RNA相对含量及隐丹参酮和丹参酮II A增长倍数； 

图5：SmFPS转基因载体； 

图6：SmFPS转基因毛状根GFP验证； 

图7：SmFPS转基因毛状根HPLC分析：1；2；3和4分别为二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA； 

图8：SmFPS转基因毛状根四个丹参酮类主要成分含量测定。 

具体实施方式

实施例1、丹参cDNA芯片的制作 

1、丹参总RNA的分离和检测 

取陕西商洛丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25mmol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。 

2、cDNA文库的构建 

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司)分离mRNA后，通过在cDNA分子两端加上EcoR I/Not I接头，在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化，与表达载体λZAP Express Predigested Vector(ZAP Express Predigested VectorKit，stratagene公司)连接，然后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack CloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)将包装蛋白在体外包装连接产物，感染E.coli XL1-Blue MRF’构建成cDNA文库。 

3、cDNA芯片的制备 

3.1PCR扩增 

挑取分离良好的噬菌斑溶于100μL SM缓冲液(Amresco公司)中混匀后作为PCR模板。 PCR扩增引物为λZAP Express多克隆位点两侧的部分序列：M13-20引物：5′-GTAAAACGACGGCCAGTG-3′，BK反向引物：5′-GGAAACAGCTATGACCTTG-3′。96孔板PCR反应体系，准备如下混合物：dNTP(25mmol·L^-1)，600μL；Mg2⁺600μL，10×缓冲液1000μL；Taq(Takara Ex Taq，5U·μL^-1)，40μL；M13-20引物(12.5μmol·L-1)，200μL；BK反向引物(12.5μmol·L^-1)200μL；高纯水补足至10mL。混合均匀后，用排枪分装至96孔PCR板。然后各加入6μL DNA模板，混合均匀。在ABI9700型基因扩增仪上进行PCR反应，反应条件为94℃预变性3分钟，然后进行35个循环，为94℃30s，54℃30s，72℃2分钟，循环结束后72℃后延伸5分钟。取3μL反应产物在含EB的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照。 

3.2PCR产物纯化 

使用96孔Multiscreen filter plates(Millipore公司)纯化板进行PCR产物的纯化。将琼脂糖凝胶检测为单一条带的PCR产物(100μL)转入纯化板中；将纯化板放于Millipore的真空装置上，于15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；加入100μL水，15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；从真空抽滤装置上取下PCR纯化板，加入40μL(pH8.0左右)的水，将纯化板放至摇床上轻摇20～30分钟重悬DNA；将纯化产物吸出，置于酶标板上测定浓度和纯度；取1μL纯化产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测；将纯化产物真空干燥。 

3.3cDNA芯片点制 

根据上述测定的浓度差异加入适量50％DMSO作为点样液，调节浓度至约250ng·μL^-1后，将样品转移至384孔板中准备芯片点制。点样仪为GeneMachine公司OmniGrid 100。点样参数为：针：2×12，X：8000，Y：6000；点间距：300microns；点阵：13×14；点阵间距：500microns；矩阵模式：4×12。 

实施例2：丹参相关基因的克隆 

1、芯片杂交分析 

丹参毛状根为发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导的毛状根。取生长良好的丹参毛状根(各0.1g)继代培养于6，7V固体培养基上，置于25℃培养箱中暗培养，分别于30天、45天、60天收获复。将30天材料作为参照，分别与45天和60天的材料进行杂交，重复两次，每组均采用正反标记以消除染料的误差。 

采用间接标记法进行探针标记，包括双链cDNA合成、T7介导的RNA体外转录合成cRNA、随机引物反转录、cDNA用KLENOW酶标记等步骤。 

(1)双链cDNA合成：取5g总RNA，以T7-Oligo(dT)15，5′-AAACGACGGCCAGTGAATGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′，V可以是G、C和A，上海博 亚生物技术有限公司)为引物，用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)合成双链cDNA；双链合成以后用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。 

(2)体外转录合成cRNA：用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA；然后用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)纯化。 

(3)随机引物反转录：取2g cRNA，用SuperscriptII反转录酶，200U·μL^-1(Invitrogen公司)，9 Random Primer进行反转录，反转录产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。 

(4)cDNA用KLENOW酶标记：取1g cRNA反转录产物，用随机引物进行KLENOW标记，标记产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化，纯化后抽干。标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120M，dCTP使用浓度为60M，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用浓度为40M。 

将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30L杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30L杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后用Ttest方法结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。 

2、差异基因的获得和分析 

将每组芯片两次重复的共同差异基因进行5’单向测序，获得的EST序列采用Windows系统下的Staden Pachage(gap4)(http://staden.sourceforge.net)软件进行序列前处理以及拼接聚类。去掉载体、接头以及低质量序列和较短的序列。使用BLASTX(6 December 2005：BLAST2.2.13 released；http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较，结果目标点样点在60/30天杂交结果中表现为上调基因，BlASTX注释为丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因，命名为SmFPS，该片段具有终止密码子，为丹参SmFPS基因的3’末端。 

3、5`-RACE 

采用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)试剂盒进行扩增SmFPS的5’末端，按照说明书进行操作。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。根据上述SmFPS基因基因设计特异引物为：GSP1：5`-TGAGCAACGCACAAGCAACTGGGAGG-3`，进行cDNA5’末端的扩增。PCR条件为94℃5min，94℃30s，68℃30s，72℃3min(35个循环)，72℃7min。扩增出约700bp的DNA片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段，按pMD19T载体(Takara)试剂盒操作手册将上述片段克隆至pMD19-T载体中，鉴定阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。 

通过cDNA杂交所得EST序列和5’-RACE获得的部分片段测序结果可得到序列表SEQID NO.1所示的SmFPS基因全长cDNA序列，其所推导的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

4、全长cDNA的克隆和测序 

根据5`-RACE的结果和已知部分的序列，采用5`和3`末端引物直接扩增5`-RACE所逆转录的5`-RACE-Ready cDNA，使用LA Taq(Takara)进行LA-PCR方法扩增SmFPS全长序列。引物：SmFPS-F：5`-gatcaatact tctctttttt ttct-3`；SmFPS-R：5`-agcacaaagc atatactcct atccta-3`。扩增出约1500bp片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T载体中(Takara)，鉴定阳性克隆并进行双向测序(北京三博远志生物有限公司)。 

实施例3、SmFPS基因的生物信息学分析 

本发明涉及的丹参二萜合酶基因全长cDNA的长度为1494bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于58～1107bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的FPS有较高的同源性，同时具有萜类酶典型的DXXDD结构域。如图1和2。 

实施例4、YE+Ag⁺处理后SmFPS基因表达与隐丹参酮、丹参酮IIA含量的分析 

利用YE+Ag⁺处理丹参毛状根，收集不同时间点的材料用于丹参SmFPS基因表达量与隐丹参酮、丹参酮IIA的含量分析。SmFPS基因表达量采用荧光实时定量PCR。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。取1μg RNA模板按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABI Prism 7000 SequenceDetection System(Applied Biosystems，USA)和SYBGREEN PCR Master Mix(AppliedBiosystems，UK)试剂盒，以丹参actin基因(GenBank登录号DQ243702)(引物序列actin-222：5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’，actin-488：5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’)作 为对照，确证不同时间都符合要求而且cDNA的量都相差不多。SmFPS基因引物为：SmFPSF 5’-TTTTACCTCCCAGTTGCTTGTG-3’；SmFPS R 5’-TTTACAACCAGCCAAGAACATT-3’。按94℃ for 5min，(94℃ for 30sec，55℃ for 30 sec and 72℃ for 1min)40 cycles，72℃ 7min的PCR条件进行扩增。结果表明：经过YE+Ag⁺处理后，SmFPS基因表达水平于24h内迅速升高，之后逐渐降低到对照组水平。经actin内参基因均一化之后，与对照组比较，处理后24h，YE+Ag⁺处理组是同时期对照组的4.5倍，说明丹参毛状根经YE+Ag⁺处理后，SmFPS基因表达水平内迅速升高，从而有利于提高SmFPS活性，有利于推动代谢流向目的产物丹参酮类成分流动。 

采用HPLC测定隐丹参酮和丹参酮II A含量，色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm，5μm)柱，检测波长：270nm；柱温：30℃，其流动相条件为：流速1.0mL.min^-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。结果显示：经过YE+Ag⁺处理后1d、2d、4d、6d、9d，隐丹参酮含量分别是对照组的3.5，3.9，10.2，15.7，38.5倍；丹参酮IIA含量分别是对照组的3.2，3.1，5.2，7.4，9.0倍；结果表明：丹参毛状根经YE+Ag⁺处理后，丹参SmFPS基因表达量能被显著的诱导表达，且伴随隐丹参酮，丹参酮IIA的迅速积累。可知所得到的丹参SmFPS基因为丹参酮类成分生物合成途径的关键酶基因，如图3和4。 

实施例5、SmFPS基因原核表达分析 

1、大肠杆菌表达工程菌的构建 

依据丹参SmFPS基因全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)的ORF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点Noc I和Xoh I。以全长cDNA片段为模板，经PCR扩增后，将经酶切的丹参SmFPS基因的目的片段克隆至酶切过的pET32a表达载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行重组子的PCR鉴定和测序鉴定。 

2、蛋白表达的诱导 

挑取工程菌接种于2mL的LB液体培养基(含氨苄霉素)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1∶100稀释加入到50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.3-0.5，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导目标蛋白表达，继续于37℃摇床培养3-4小时。当细菌培养至OD₆₀₀为1.0时，10000rpm离心5分钟，弃上清，收集菌体。 

3、SmFPS活性的分析 

取上述PBS洗两次，然后加入1/10体积的Buffer(20mM Mopso，pH 7.0，10％(v/v)glycerol and 10mM MgCl₂，2mM DTT)重新悬，冰浴条件下用超声波处理，12000rpm，4℃离心15分钟，过0.22um膜，取1ml粗酶液，加入0.25nmol的GPP和IPP，30℃条件下反应2小时，经去磷酸化处理后，用GC-MS分析，检测FPP是否存在，同时以未加入粗酶液的反应作为对照。结果表明，在酶溶液，GPP和IPP存在的情况下，可以检测到FPP的存在。 

实施例6、SmFPS转基因发根毛状根丹参酮类含量分析 

1.Gateway过表达载体的构件： 

设计扩SmFPS基因全长的引物(SmFPS-B1：GCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG-GCTTCACCATGGCGAATCTGAACGGAGAG；SmFPS-B2：GCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTATTTCTGCCTCTTGTATATC)。应用高保真酶进行PCR，将产物切胶回收。 

BP反应 

PCR产物	50-100ng(3.5uL)
		PDONR221	50-100ng(0.5uL)
BP Clonase酶	1.0uL(用前轻轻混合下)

A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)， 

B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。 

C.将BP反应产物经过DH5α克隆 

D.含40ug/ml kan(卡那霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证，提质粒。 

LR反应 

BP反应质粒	50-150ng(3.5uL)
		PH7WG2D载体	150ng(0.5uL)
LRClonase酶	1.0uL(用前轻轻混合下)

A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)， 

B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。 

C.将BP反应产物经过DH5α克隆 

D.含50ug/ml Spe(壮观霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证。 

所得质粒，然后提质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中，同时用敲出毒基因的空载体做对照，如图5。 

2.ACCC10060介导基因转化 

1.外植体预培养： 

选取10天的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm²的小块，并用刀片将叶片表面划伤，以背面向上的方式将叶片置于MS固体培养基上，于25℃左右光照16h/黑暗8h的条件下预培 养2天。 

3.农杆菌的活化扩增： 

4℃保存的平板上挑取单菌落于新的含有50mg/L Rif和100mg/L壮观霉素的YEB培养基上，划线，20℃培养过夜(活化)，挑取单菌落接种于15ml含50mg/L Rif和100mg/L壮观霉素的YEB的液体培养基中，于28℃振荡培养至OD2600.5左右(250rpm约23h)，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，弃上清液，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于浸染。 

4、浸染及共培养： 

将预培养材料放入MS重悬液中，浸染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，黑暗中共培养48-72h。 

5、选择培养： 

将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400mg/L cef水浸泡5min左右，无菌水清洗1次，吸干水分而后移入含Hgy(潮霉素)2.5mg/L和400mg/L cef的MS固体培养基上，于黑暗中进行筛选培养，每10天更换一次培养基。选择生长迅速长至2.0cm～3.0cm的抗性毛状根，将其切下，单独标号转入2.5mg/L Hgy和400mg/L cef的MS固体培养基上，将除菌后的阳性毛状根根转入含2.5mg/LHgy的MS培养基上继代。 

6、选择培养： 

毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP)，再经过特异引物PCR检测，选择阳性株系进行放大培养(6，7V培养基)。如图6。 

7、丹参酮类含量测定： 

取鲜毛状根500mg真空干燥，用MeOH提取后分析，HPLC条件同上，测定丹参脂溶性成分含量。结果表明，在过表达SmFPS基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比对照组分别提高：1.5、2.5、2和1.8倍(如图7，8)。因此转基因结果证明，丹参SmFPS基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用，SmFPS基因可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。 

SEQUENCE LISTING 

<110>中国中医科学院中药研究所 

<120>丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因及其编码的蛋白和应用 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>1494 

<212>DNA 

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.) 

<400>1 

gatcaatact tctctttttt ttctttcatt aatctaattt caatctgctc ttttgccatg    60 

gcgaatctga acggagagtc ggcggatctg agggcgacgt ttctgggggt ttattcggtg    120 

cttaaatctg agctcttgaa cgaccctgct ttcgagtgga ctgatggttc tcgtcaatgg    180 

gtcgagcgta tgctggacta taatgtacct ggagggaaat taaaccgagg cctgtcagtc    240 

attgatagct acaagttact aaaaggagga aaagatctaa ctgatgatga agtgtttcta    300 

gctagtgctc ttggctggtg tgttgaatgg ctccaggcat attttcttgt acttgatgat    360 

attatggata attctcacac acgacgtggt cagccatgct ggtttagagt ccccaaggtt    420 

ggtatgattg ccataaatga tggaatcatt ctccggaacc atatccccag aattcttaag    480 

aagcacttca gaacaaagcc ttactatgtt gatctgctgg atttgttcaa tgaggtggaa    540 

tttcaaactg cttctggaca gatgatagat ttaattacca ctattgaagg agaaaaggat    600 

ttatcaaaat actcattgcc tcttcatcgc cgcattgttc agtacaagac ggcctactac    660 

tcattttacc tcccagttgc ttgtgcgttg ctcatggcgg gtgaggacct ggagaaacat    720 

ccaacagtga aggatgtgct tattaatatg ggaatatact ttcaagtaca ggatgactat    780 

ttagattgct ttggtgagcc tgaaaagatt gggaagattg gaacagatat tgaagatttc    840 

aaatgttctt ggctggttgt aaaggccctg gagctttgta acgaagaaca gaagaaaact    900 

cttttcgagc actatggaaa ggaagatcca gctgatgttg caaaaatcaa agtcctctat    960 

aatgagatta atctacaagg tgtgtttgct gagtttgaga gcaagagcta cgagaaacta    1020 

aatagctcga ttgaagctca tcccagcaaa tctgtgcaag cagtgctcaa gtctttcttg    1080 

ggcaagatat acaagaggca gaaataagaa gatgaaactc tcaccacagg aatgaagcag    1140 

aatcaaaagg atcccacttc atatcctgtc ctgatgcatc tttgtagcta tcctgtttgt    1200 

ataactattt gtggttttta ttagtattct caagcggagc agtgtcattt tttcacaagg    1260 

gaaataacgt ttttctgcat tgtacttttt tttttaagaa ggtaacacac ataaaccgca    1320 

ttacaataaa aaggccaaat gtgtccaagc acatagattt acaacacgca ataaacttta    1380 

cagaagtaaa aagaaattac gatggacgat aattgtagtt ggaaacaccc gattatgttt    1440 

acaccactta ttacttcatc aaaacatata ggataggagt atatgctttg tgct          1494 

<210>2 

<211>349 

<212>PRT 

<213>丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.) 

<400>2 

Met Ala Asn Leu Asn Gly Glu Ser Ala Asp Leu Arg Ala Thr Phe Leu 

1               5                   10                  15 

Gly Val Tyr Ser Val Leu Lys Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe 

            20                  25                  30 

Glu Trp Thr Asp Gly Ser Arg Gln Trp Val Glu Arg Met Leu Asp Tyr 

        35                  40                  45 

Asn Val Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Ile Asp Ser 

    50                  55                  60 

Tyr Lys Leu Leu Lys Gly Gly Lys Asp Leu Thr Asp Asp Glu Val Phe 

65                  70                  75                  80 

Leu Ala Ser Ala Leu Gly Trp Cys Val Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe 

                85                  90                  95 

Leu Val Leu Asp Asp Ile Met Asp Asn Ser His Thr Arg Arg Gly Gln 

            100                 105                 110 

Pro Cys Trp Phe Arg Val Pro Lys Val Gly Met Ile Ala Ile Asn Asp 

        115                 120                 125 

Gly Ile Ile Leu Arg Asn His Ile Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe 

    130                 135                 140 

Arg Thr Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Leu Asp Leu Phe Asn Glu Val 

145                 150                 155                 160 

Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Ile 

                165                 170                 175 

Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ser Lys Tyr Ser Leu Pro Leu His Arg Arg 

            180                 185                 190 

Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala 

        195                 200                 205 

Cys Ala Leu Leu Met Ala Gly Glu Asp Leu Glu Lys His Pro Thr Val 

    210                 215                 220 

Lys Asp Val Leu Ile Asn Met Gly Ile Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp 

225                 230                 235                 240 

Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Glu Pro Glu Lys Ile Gly Lys Ile Gly Thr 

                245                 250                 255 

Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu 

            260                 265                 270 

Leu Cys Asn Glu Glu Gln Lys Lys Thr Leu Phe Glu His Tyr Gly Lys 

        275                 280                 285 

Glu Asp Pro Ala Asp Val Ala Lys Ile Lys Val Leu Tyr Asn Glu Ile 

    290                 295                 300 

Asn Leu Gln Gly Val Phe Ala Glu Phe Glu Ser Lys Ser Tyr Glu Lys 

305                 310                 315                 320 

Leu Asn Ser Ser Ile Glu Ala His Pro Ser Lys Ser Val Gln Ala Val 

                325                 330                 335 

Leu Lys Ser Phe Leu Gly Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys 

            340                 345 

Claims (5)

1.一种丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID No.1的DNA序列；

(2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

2.一种丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一：

(1)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID No.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

3.重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因全序列或部分序列。

4.活体材料，其特征在于：所述活体材料含有权利要求1所述的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因全序列或部分序列。

5.权利要求1所述的基因在丹参育种中的应用。 

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