CN101928715A - 丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents
丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101928715A CN101928715A CN 200910148593 CN200910148593A CN101928715A CN 101928715 A CN101928715 A CN 101928715A CN 200910148593 CN200910148593 CN 200910148593 CN 200910148593 A CN200910148593 A CN 200910148593A CN 101928715 A CN101928715 A CN 101928715A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- smp450
- gene
- cytochrome
- sequence
- red sage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白酶和用途,该基因为首次利用cDNA芯片技术从丹参中克隆而得,填补了从我国传统名贵中药材丹参中分离克隆出结构修饰型功能基因:细胞色素P450(SmP450)基因的空白。本发明所提供的细胞色素P450(SmP450)基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的细胞色素P450(SmP450)基因可以通过生物技术提高丹参中二萜类活性成分丹参酮类的含量,有助于丹参药材的品质改良,同时可以进行品种选育,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,主要涉及利用cDNA芯片技术克隆丹参中各种跟其活性成分生物合成相关的酶基因及其编码产物与应用,尤其涉及丹参主要活性成分酚酸类和二萜醌类化合物在生物合成中的参与其结构修饰的酶基因及其编码产物与应用,属于药用植物基因工程领域。
背景技术
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛及深入,独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点,这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础,同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。
药用植物中有很多活性成分如紫杉醇、青蒿素、人参皂苷Rg3、喜树碱、长春碱、丹参酮IIA、雷公藤甲、乙素等等。这些化合物的体内生物合成过程中,均涉及到不同程度的生物结构修饰,其中细胞色素P450的修饰作用非常关键。由于大多数P450在植物体内的含量很低且不稳定,直接分离纯化P450酶非常困难,因此克隆P450基因,研究P450基因的表达与调控,通过异源表达、缺失突变和突变体互补等方法研究P450的功能就成为一条重要途径。基因芯片技术是20世纪80年代发展起来的一项高新技术,它可以对生物整个基因组的所有基因表达同时进行实时监测,作为一个全新的、强有力的技术平台,已广泛地应用于功能基因组的研究中,也成为挖掘新基因的强有力手段。药用植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为一味常用中药,含有丰富的生物活性成分,其中主要有两类活性成分:脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物,它们结构上基本存在细胞色素P450修饰作用的痕迹。本发明系为应用Gene-Chip技术,结合5’RACE对丹参中与有效成分密切相关的细胞色素P450进行克隆和分析,并且应用生物工程技术对其进行了研究与开发。在本发明被公布之前,尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的细胞色素P450基因及其氨基酸序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹参细胞色素P450(SmP450)基因。
本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。
本发明所提供的丹参细胞色素P450(SmP450),为以下核苷酸序列之一:
(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
该基因所编码的蛋白质为丹参细胞色素P450(SmP450),是以下氨基酸序列之一:
(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;
(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
含有本发明的丹参细胞色素P450(SmP450)基因全序列或部分序列的重组载体,如原核表达类载体,真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围。
含有本发明的丹参细胞色素P450(SmP450)基因全序列或部分序列的宿主细胞,如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
所述宿主细胞为有价值的活体材料。
本发明的丹参细胞色素P450(SmP450)基因的应用,包括用所述的重组载体,如植物过表达载体或干扰载体转化的植物细胞;或者用所述含重组载体的农杆菌与相关活体材料共培养,得到转基因的植物发根系和转基因植株;或者用所述的丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。
本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下:
所说的丹参细胞色素P450(SmP450)基因的DNA分子包括:编码具有丹参细胞色素P450(SmP450)活性的多肽的核苷酸序列,而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1512位的核苷酸序列有至少70%的同源性;或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1512的核苷酸序列杂交。较佳地,所述的序列编码具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地,所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1512位的核苷酸序列。本发明分离出的丹参细胞色素P450(SmP450)基因多肽包括:具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段,或其活性衍生物。较佳地,该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中,“分离的”、“纯化的”DNA是指,该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来,还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开,而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
本发明中术语“丹参细胞色素P450(SmP450)(或多肽)”基因指:编码具有丹参细 胞色素P450(SmP450)活性的多肽的核苷酸序列,如SEQ ID NO.1中第1-1512位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指,位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-1512位核苷酸中,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与SEQ ID NO.1,中第1-1512位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下,更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1512位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQID NO.1中从核苷酸第1-1512位的核苷酸序列的同源性至少70%,较佳地至少80%,更佳地至少90%,最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的丹参细胞色素P450(SmP450)相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为,1-90个,较佳地,1-60个,更佳地,1-20个,最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为10个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。
本发明中术语“丹参细胞色素P450(SmP450)蛋白或多肽”指:具有丹参细胞色素P450(SmP450)活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然丹参细胞色素P450(SmP450)相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括丹参细胞色素P450(SmP450)的活性片段和活性衍生物,还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的丹参丹参细胞色素P450(SmP450)多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与丹参细胞色素P450(SmP450)DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用丹参细胞色素P450(SmP450)多肽的血清获得的多肽或蛋白。
本发明中丹参细胞色素P450(SmP450)保守性变异多肽指:与SEQ ID NQ.2的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可根据表1,进行替换而产生。
本发明还包括丹参细胞色素P450(SmP450)或多肽的类似物。这些类似物与天然丹参细胞色素P450(SmP450)多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的 修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中,可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体,包括质粒,粘粒等。
表1:保守性变异多肽中的取代残基
最初的残基 | 代表性的取代残基 | 优选的取代残基 |
Ala(A) | Val;Leu;IIe | Val |
Arg(R) | Lys;GIn;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
在生产本发明的丹参细胞色素P450(SmP450)原酶多肽时,可以将丹参细胞色素P450(SmP450)基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列,从而形成丹参细胞色素P450(SmP450)表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况,即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如,如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌,那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录,那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时,那么它是可操作地连于编码序列。一般,“可操作地连于”意味着相邻,而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌;常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
本发明还可用Northern印迹法技术分析丹参细胞色素P450(SmP450)基因产物的表达,即分析丹参细胞色素P450(SmP450)的RNA转录物在细胞中的存在和数量。
此外,本发明中可用作探针的核酸分子通常具有丹参细胞色素P450(SmP450)核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸,较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码丹参细胞色素P450(SmP450)的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在丹参细胞色素P450(SmP450)核苷酸序列的方法,它包括用上述的探针与样品进行杂交,然后检测探针是否发生了结合。较佳地,该样品是PCR扩增后的产物,其中PCR扩增引物对应于丹参细胞色素P450(SmP450)核苷酸编码序列,并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外,根据本发明的丹参细胞色素P450(SmP450)核苷酸序列和氨基酸序列,可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上,筛选丹参细胞色素 P450(SmP450)源基因或同源蛋白。
为了得到与丹参细胞色素P450(SmP450)相关的丹参cDNAs的点阵,可以用DNA探针筛选丹参cDNA文库,这些探针是在低严谨条件下,用32P对丹参细胞色素P450(SmP450)基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自丹参的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外,许多这样的cDNA文库也可以购买到,例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别丹参细胞色素P450(SmP450)的基因家族的核苷酸序列。
本发明的丹参细胞色素P450(SmP450)的基因家族的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外,本发明蛋白的片段还可用固相技术,通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人,(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WHFreeman Co.,San Francisco;Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如,可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段,然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的丹参细胞色素P450(SmP450),通过各种常规筛选方法,可筛选出与丹参细胞色素P450(SmP450)发生相互作用的物质,或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明所提供的丹参细胞色素P450(SmP450)基因是首次从丹参中克隆制备的,填补了从我国药物植物丹参细胞色素P450(SmP450)基因的空白。利用本发明可以通过基因工程技术来提高丹参等植物中萜类活性成分丹参酮类物质的含量,转基因结果显示,丹参丹参细胞色素P450(SmP450)基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用。丹参细胞色素P450(SmP450)基因可通过转基因技术用于提高丹参酮含量的研究和产业化,尤其可用于中药材丹参的品质改良,能缓解丹参酮类药源严重匾乏问题,对提高丹参酮类物质产量具有较好的促进作用,具有很好的应用前景。
附图说明:
图1:SmP450的功能域预测(来源于NCBI数据库);
图2:YE+Ag+处理丹参毛状根后,SmP450RNA相对含量及隐丹参酮和丹参酮IIA增长倍数;
图3:SmP450转基因载体;
图4:SmP450转基因毛状根端口部分愈伤组织GFP验证;
图5:SmP450转基因毛状根四个丹参酮类主要成分含量分析。
具体实施方式
实施例1、丹参cDNA芯片的制作
1、丹参总RNA的分离和检测
取陕西商洛丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge)根2g,在研钵中用液氮快速研磨成粉末,快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2%,Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L-1,EDTA 25m mol·L-1,NaCl 2.0mol·L-1,PVP402%,亚精胺0.5g/L,巯基乙醇2%),充分振荡混匀;用等体积氯仿抽提两次,7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl,混匀后放置4℃沉淀过夜;7500g离心20分钟,沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5%,NaCl 1mol·L-1,Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L-1,EDTA 1mmol·L-1,在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提,13000g离心5分钟;上清液加入2倍体积无水乙醇,-70℃放置2h;4℃13000g离心20分钟,沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中,用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性,用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。
2、cDNA文库的构建
采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit,Pharmacia公司)分离mRNA后,通过在cDNA分子两端加上EcoR I/Not I接头,在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化,与表达载体λZAP Express Predigested Vector(ZAP Express Predigested VectorKit,stratagene公司)连接,然后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack CloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)将包装蛋白在体外包装连接产物,感染E.coli XL1-Blue MRF’构建成cDNA文库。
3、cDNA芯片的制备
3.1PCR扩增
挑取分离良好的噬菌斑溶于100μL SM缓冲液(Amresco公司)中混匀后作为PCR模板。PCR扩增引物为λZAP Express多克隆位点两侧的部分序列:M13-20引物:5′-GTAAAACGACGGCCAGTG-3′,BK反向引物:5′-GGAAACAGCTATGACCTTG-3′。96孔 板PCR反应体系,准备如下混合物:dNTP(25mmol·L-1),600μL;Mg2+600μL,10×缓冲液1000μL;Taq(Takara Ex Taq,5U·μL-1),40μL;M13-20引物(12.5μmol·L-1),200μL;BK反向引物(12.5μmol·L-1)200μL;高纯水补足至10mL。混合均匀后,用排枪分装至96孔PCR板。然后各加入6μL DNA模板,混合均匀。在ABI9700型基因扩增仪上进行PCR反应,反应条件为94℃预变性3分钟,然后进行35个循环,为94℃30s,54℃30s,72℃2分钟,循环结束后72℃后延伸5分钟。取3μL反应产物在含EB的1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照。
3.2PCR产物纯化
使用96孔Multiscreen filter plates(Millipore公司)纯化板进行PCR产物的纯化。将琼脂糖凝胶检测为单一条带的PCR产物(100μL)转入纯化板中;将纯化板放于Millipore的真空装置上,于15mmHg真空抽滤10分钟,直至抽干;加入100μL水,15mmHg真空抽滤10分钟,直至抽干;从真空抽滤装置上取下PCR纯化板,加入40μL(pH8.0左右)的水,将纯化板放至摇床上轻摇20~30分钟重悬DNA;将纯化产物吸出,置于酶标板上测定浓度和纯度;取1μL纯化产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测;将纯化产物真空干燥。
3.3cDNA芯片点制
根据上述测定的浓度差异加入适量50%DMSO作为点样液,调节浓度至约250ng·μL-1后,将样品转移至384孔板中准备芯片点制。点样仪为GeneMachine公司OmniGrid 100。点样参数为:针:2×12,X:8000,Y:6000;点间距:300microns;点阵:13×14;点阵间距:500microns;矩阵模式:4×12。
实施例2:丹参SmP450基因的克隆
1、芯片杂交分析
丹参毛状根为发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导的毛状根。取生长良好的丹参毛状根(各0.1g)继代培养于6,7V固体培养基上,置于25℃培养箱中暗培养,分别于30天、45天、60天收获复。将30天材料作为参照,分别与45天和60天的材料进行杂交,重复两次,每组均采用正反标记以消除染料的误差。
采用间接标记法进行探针标记,包括双链cDNA合成、T7介导的RNA体外转录合成cRNA、随机引物反转录、cDNA用KLENOW酶标记等步骤。
(1)双链cDNA合成:取5g总RNA,以T7-Oligo(dT)15,5′-AAACGACGGCCAGTGAATGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′,V可以是G、C和A,上海博亚生物技术有限公司)为引物,用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)合成双链cDNA;双链合成以后用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。
(2)体外转录合成cRNA:用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA;然后用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)纯化。
(3)随机引物反转录:取2g cRNA,用SuperscriptII反转录酶,200U·μL-1(Invitrogen公司),9 Random Primer进行反转录,反转录产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。
(4)cDNA用KLENOW酶标记:取1g cRNA反转录产物,用随机引物进行KLENOW标记,标记产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化,纯化后抽干。标记过程中dATP,dGTP,dTTP使用浓度为120M,dCTP使用浓度为60M,Cy5-dCTP,Cy3-dCTP使用浓度为40M。
将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记,然后溶于30L杂交液中(3×SSC,0.2%SDS,5×Denhart’s,25%甲酰胺),于42℃杂交过夜。杂交结束后,先在42℃左右含0.2%SDS,2×SSC的液体中洗5分钟,而后在0.2×SSC中室温洗5分钟,玻片甩干后进行扫描。将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记,然后溶于30L杂交液中(3×SSC,0.2%SDS,5×Denhart’s,25%甲酰胺),于42℃杂交过夜。杂交结束后,先在42℃左右含0.2%SDS,2×SSC的液体中洗5分钟,而后在0.2×SSC中室温洗5分钟,玻片甩干后进行扫描。芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号;然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化;最后用Ttest方法结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。
2、差异基因的获得和分析
将每组芯片两次重复的共同差异基因进行5’单向测序,获得的EST序列采用Windows系统下的Staden Pachage(gap4)(http://staden.sourceforge.net)软件进行序列前处理以及拼接聚类。去掉载体、接头以及低质量序列和较短的序列。使用BLASTX(6 December 2005:BLAST2.2.13 released;http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较,结果目标点样点在60/30天杂交结果中表现为上调基因,BlASTX注释为丹参细胞色素P450(SmP450)基因,命名为SmP450,该片段具有终止密码子,为丹参SmP450基因的3’末端。
3、5`-RACE
采用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)试剂盒进行扩增SmP450的5’末端,按照说明书进行操作。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取,步骤详 见试剂盒操作手册。根据上述SmP450基因基因设计特异引物为:GSP1:5`-gtaggcgaggacgtcctgcgccacccc-3`,进行cDNA5’末端的扩增。PCR条件为94℃5min,94℃30s,68℃30s,72℃3min(35个循环),72℃7min。扩增出约400bp的DNA片段,琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段,按pMD19T载体(Takara)试剂盒操作手册将上述片段克隆至pMD19-T载体中,鉴定阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。
通过cDNA杂交所得EST序列和5’-RACE获得的部分片段测序结果可得到序列表SEQID NO.1所示的SmP450基因全长cDNA序列,其所推导的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4、全长cDNA的克隆和测序
根据5`-RACE的结果和已知部分的序列,采用5`和3`末端引物直接扩增5`-RACE所逆转录的5`-RACE-Ready cDNA,使用LA Taq(Takara)进行LA-PCR方法扩增SmP450全长序列。引物:SmP450-F:5`-atgaaatctcacatcatggagctaaac-3`;SmP450-R:5`-tcacgcacgcaaag-gccgcttcaa-3`。扩增出约1500bp片段,琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段,按上述方法克隆至pMD19-T载体中(Takara),鉴定阳性克隆并进行双向测序(北京三博远志生物有限公司)。
实施例3、SmP450基因的生物信息学分析
本发明涉及的丹参二萜合酶基因全长cDNA的长度为1512bp,详细序列见序列表中的序列1,其中开放读码框位于1~1512bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的P450有较高的同源性,同时具有的FxxGxRxCxG特征结构域。图1。
实施例4、YE+Ag+处理后SmP450基因表达与隐丹参酮、丹参酮IIA含量的分析
利用YE+Ag+处理丹参毛状根,收集不同时间点的材料用于丹参SmP450基因表达量与隐丹参酮、丹参酮IIA的含量分析。SmP450基因表达量采用荧光实时定量PCR。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取,步骤详见试剂盒操作手册。取1μg RNA模板按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABI Prism 7000 SequenceDetection System(Applied Biosystems,USA)和SYBGREEN PCR Master Mix(AppliedBiosystems,UK)试剂盒,以丹参actin基因(GenBank登录号DQ243702)(引物序列actin-222:5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’,actin-488:5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’)作为对照,确证不同时间都符合要求而且cDNA的量都相差不多。SmP450基因引物为:SmP450F 5-gagatcccagcagggacc-3’;SmP450R 5’-caagtattgcagatcgtt-3’。按94℃ for 5min,(94℃ for 30sec,55℃ for 30sec and 72℃ for 1min)40 cycles,72℃7min的PCR条件进行扩增。结果表明:经过YE+Ag+处理处理后,SmP450基因表达水平于24h内迅速升高,之后逐渐降低到对照组水平。经actin内参基因均一化之后,与对照组比较,处理后24h,YE+Ag+处理处理组是同时期对照组的5.6倍,说明丹参毛状根经YE+Ag+处理后,SmP450基因表达水平内迅速升高,从而有利于提高SmP450活性,有利于推动代谢流向目的产物丹参酮类成分流动。
采用HPLC测定隐丹参酮和丹参酮IIA含量,色谱条件为:Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2996二极管阵列检测器,Millennium 32工作站,色谱甲醇(天津);水为三重蒸馏水,氯仿(分析纯),无水乙醇(分析纯)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm,5μm)柱,检测波长:270nm;柱温:30℃,其流动相条件为:流速1.0mL.min-1,流动相为0.5%醋酸甲醇(A)和0.5%醋酸水(B)线性梯度洗脱:0~25min,30%~60%A;25~30min,60%~65%A;30~50min,65%~70%A;50~60min,70%~80%A;60~61min,80%~30%A。结果显示:经过YE+Ag+处理后1d、2d、4d、6d、9d,隐丹参酮含量分别是对照组的3.5,3.9,10.2,15.7,38.5倍;丹参酮IIA含量分别是对照组的3.2,3.1,5.2,7.4,9.0倍;结果表明:丹参毛状根经YE+Ag+处理后,丹参SmFPS基因表达量能被显著的诱导表达,且伴随隐丹参酮,丹参酮IIA的迅速积累。可知所得到的丹参SmFPS基因为丹参酮类成分生物合成途径的关键酶基因,如图2。
实施例5、SmP450转基因发根毛状根丹参酮类含量分析
1.Gateway过表达载体的构件:
设计扩SmP450基因全长的引物(SmP450-B1:GCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-atgaaatctcacatcatggag;SmP450-B2:GCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT-tcacgcacgcaaaggccgctt)。应用高保真酶进行PCR,将产物切胶回收。
BP反应
PCR产物 | 50-100ng(3.5uL) |
PDONR221 | 50-100ng(0.5uL) |
BP Clonase酶 | 1.0uL(用前轻轻混合下) |
A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪),
B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟,终止BP反应。
C.将BP反应产物经过DH5α克隆。
D.含40ug/ml kan(卡那霉素)LB培养板上过夜,PCR验证,测序验证,提质粒。
LR反应
BP反应质粒 | 50-150ng(3.5uL) |
[0083]
PH7WG2D载体 | 150ng(0.5uL) |
LR Clonase酶 | 1.0uL(用前轻轻混合下) |
A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪),
B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟,终止BP反应。
C.将BP反应产物经过DH5α克隆。
D.含50ug/ml Spe(壮观霉素)LB培养板上过夜,PCR验证,测序验证。
所得质粒,然后提质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中,同时用敲出毒基因的空载体做对照,如图3。
2.ACCC10060介导基因转化
1.外植体预培养:
选取10天的丹参无菌苗,将叶片剪成0.5×0.5cm 2的小块,并用刀片将叶片表面划伤,以背面向上的方式将叶片置于MS固体培养基上,于25℃左右光照16h/黑暗8h的条件下预培养2天。
3.农杆菌的活化扩增:
4℃保存的平板上挑取单菌落于新的含有50mg/L Rif和100mg/L壮观霉素的YEB培养基上,划线,20℃培养过夜(活化),挑取单菌落接种于15ml含50mg/L Rif和100mg/L壮观霉素的YEB的液体培养基中,于28℃振荡培养至OD2600.5左右(250rpm约23h),将菌液倒入无菌离心管中,4000rpm离心10min,弃上清液,用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体,用于浸染。
4、浸染及共培养:
将预培养材料放入MS重悬液中,浸染10min,取出外植体,用无菌滤纸吸去菌液,放入新的MS固体培养基上,黑暗中共培养48-72h。
5、选择培养:
将共培养的外植体用无菌水清洗3次,400mg/L cef水浸泡5min左右,无菌水清洗1次,吸干水分而后移入含Hgy(潮霉素)2.5mg/L和400mg/L cef的MS固体培养基上,于黑暗中进行筛选培养,每10天更换一次培养基。选择生长迅速长至2.0cm~3.0cm的抗性毛状根,将其切下,单独标号转入2.5mg/L Hgy和400mg/L cef的MS固体培养基上,将除菌后的阳性毛状根转入含2.5mg/LHgy的MS培养基继代。
5、丹参酮类含量测定:
6、选择培养:
毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP),再经过特异引物PCR检测,选择阳性株系进行 放大培养(6,7V培养基),图4。
7、丹参酮类含量测定:
取鲜毛状根500mg真空干燥,用MeOH提取,HPLC条件同上,测定丹参脂溶性成分含量。结果表明,在过表达SmP450基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮,隐丹参酮,丹参酮I和丹参酮IIA含量比对照组分别提高:1.2、3.0、2.0和1.7倍,如图5。因此转基因结果证明,丹参SmP450基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用,SmP450基因可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中,具有很好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110>中国中医科学院中药研究所
<120>丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1512
<212>DNA
<213>丹参Salvia miltiorrhiza Bge.
<400>1
atgaaatctc acatcatgga gctaaacact tcatcaacac tcatagctct actttccttc 60
ctctttctct tcatctttct caaatatgta acaatcacaa aatccgcaaa ccgctactca 120
cacatcccaa ctcccaaaac cctccctctc atcggaaacc ttcacctcat gctcggcacc 180
gacgcccccc accgcctctt ccgggagctc gccgccaagc acggccccct catgcacctc 240
cagctcggcg agatccactt catcatcgtc tcgtccgtgg atctcgccaa gcaggtgctc 300
aaaatccacg acatcaactt cgccaaccgg cccccggggg tggcgcagga cgtcctcgcc 360
tacaacatga ccgacgtcgt ggccgccccc tacggcgact actggcgctt gctgcggaag 420
atctgcacgc tcgagcttct gagcacgcgg cgcgtgcagt ccttccgccc cataagagaa 480
gaggagaatc tgaatctttg cagatacctc gcttcctgcg ggggatcgcc ggcgaatctg 540
tcggagaaga tccatctgtc gtcgtacgac gtgatcacga gggcggcggt ggggacgaga 600
acgacggggc gcgtgatgga gagttcggtg atttcagaga tttcggaggt ggggtcggga 660
ttcatgaccg ccgatttcta tccttccgtc agatcactgc ggtggatcac catagcgccg 720
tacaagatcc aacacattcg ccgcaaattg gacaagctgt tcgacagcat catcgaggag 780
cataaatcaa acagagataa ggatgccaag tatgaagatt ttgtggatgt tctccttcag 840
attcaaaaag acgggagtat aactactgac aacatcaaag cagtgctcgt ggatgtgttc 900
agtgctggaa ctggcacgtc agccacagcc acagagtggg caatgacaga gttgatgaaa 960
aatcctagca cactcaccaa ggctcaagag gaggtaagaa gggttttcga cgacaaggga 1020
tacgtggacg aagacaagtt cgaggagctc aaatacctca aactgatcat caaagagaca 1080
ctgagattcc acccgccaac gccgctttta atccccagaa tcaacacaga gagatgcgaa 1140
atcaatggat acgagatccc agcagggacc agtttgatcg tgaatgcgtg ggcactggga 1200
agagaccccg agtattggaa cgatccggag aagtttatac cagaaagatt tgaggaaagc 1260
gccgttgatt tcaaagggaa cgatctgcaa tacttgccct ttggttcggg aaggagaatg 1320
tgccccggca taatctacgg cctcgcgaac gtcgagttca ttcttgcgac gcttctctat 1380
catttcgatt ggaagttgcc gaaagggatg aaaatagatg aattggatgt ggtggaggca 1440
tttggctcga gtctaaaaag gaaaaatcct ttgcttttga ttcccgtttt gaagcggcct 1500
ttgcgtgcgt ga 1512
<210>2
<211>503
<212>PRT
<213>丹参Salvia miltiorrhiza Bge.
<400>2
Met Lys Ser His Ile Met Glu Leu Asn Thr Ser Ser Thr Leu Ile Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Phe Leu Phe Leu Phe Ile Phe Leu Lys Tyr Val Thr Ile
20 25 30
Thr Lys Ser Ala Asn Arg Tyr Ser His Ile Pro Thr Pro Lys Thr Leu
35 40 45
Pro Leu Ile Gly Asn Leu His Leu Met Leu Gly Thr Asp Ala Pro His
50 55 60
Arg Leu Phe Arg Glu Leu Ala Ala Lys His Gly Pro Leu Met His Leu
65 70 75 80
Gln Leu Gly Glu Ile His Phe Ile Ile Val Ser Ser Val Asp Leu Ala
85 90 95
Lys Gln Val Leu Lys Ile His Asp Ile Asn Phe Ala Asn Arg Pro Pro
100 105 110
Gly Val Ala Gln Asp Val Leu Ala Tyr Asn Met Thr Asp Val Val Ala
115 120 125
Ala Pro Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Leu Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu
130 135 140
Glu Leu Leu Ser Thr Arg Arg Val Gln Ser Phe Arg Pro Ile Arg Glu
145 150 155 160
Glu Glu Asn Leu Asn Leu Cys Arg Tyr Leu Ala Ser Cys Gly Gly Ser
165 170 175
Pro Ala Asn Leu Ser Glu Lys Ile His Leu Ser Ser Tyr Asp Val Ile
180 185 190
Thr Arg Ala Ala Val Gly Thr Arg Thr Thr Gly Arg Val Met Glu Ser
195 200 205
Ser Val Ile Ser Glu Ile Ser Glu Val Gly Ser Gly Phe Met Thr Ala
210 215 220
Asp Phe Tyr Pro Ser Val Arg Ser Leu Arg Trp Ile Thr Ile Ala Pro
225 230 235 240
Tyr Lys Ile Gln His Ile Arg Arg Lys Leu Asp Lys Leu Phe Asp Ser
245 250 255
Ile Ile Glu Glu His Lys Ser Asn Arg Asp Lys Asp Ala Lys Tyr Glu
260 265 270
Asp Phe Val Asp Val Leu Leu Gln Ile Gln Lys Asp Gly Ser Ile Thr
275 280 285
Thr Asp Asn Ile Lys Ala Val Leu Val Asp Val Phe Ser Ala Gly Thr
290 295 300
Gly Thr Ser Ala Thr Ala Thr Glu Trp Ala Met Thr Glu Leu Met Lys
305 310 315 320
Asn Pro Ser Thr Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Val Arg Arg Val Phe
325 330 335
Asp Asp Lys Gly Tyr Val Asp Glu Asp Lys Phe Glu Glu Leu Lys Tyr
340 345 350
Leu Lys Leu Ile Ile Lys Glu Thr Leu Arg Phe His Pro Pro Thr Pro
355 360 365
Leu Leu Ile Pro Arg Ile Asn Thr Glu Arg Cys Glu Ile Asn Gly Tyr
370 375 380
Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ser Leu Ile Val Asn Ala Trp Ala Leu Gly
385 390 395 400
Arg Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Asp Pro Glu Lys Phe Ile Pro Glu Arg
405 410 415
Phe Glu Glu Ser Ala Val Asp Phe Lys Gly Asn Asp Leu Gln Tyr Leu
420 425 430
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Ile Ile Tyr Gly Leu
435 440 445
Ala Asn Val Glu Phe Ile Leu Ala Thr Leu Leu Tyr His Phe Asp Trp
450 455 460
Lys Leu Pro Lys Gly Met Lys Ile Asp Glu Leu Asp Val Val Glu Ala
465 470 475 480
Phe Gly Ser Ser Leu Lys Arg Lys Asn Pro Leu Leu Leu Ile Pro Val
485 490 495
Leu Lys Arg Pro Leu Arg Ala
500
Claims (5)
1.丹参细胞色素P450(SmP450)基因,其特征在于,它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID No.1的DNA序列;
(2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.丹参细胞色素P450(SmP450),其特征在于,是以下氨基酸序列之一:
(1)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列;
(2)SEQ ID No.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
3.重组载体,其特征在于:含有权利要求1所述的丹参细胞色素P450(SmP450)基因全序列或部分序列。
4.活体材料,其特征在于:所述活体材料含有权利要求1所述的丹参细胞色素P450(SmP450)基因全序列或部分序列。
5.权利要求1所述的基因在丹参育种中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200910148593 CN101928715A (zh) | 2009-06-30 | 2009-06-30 | 丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200910148593 CN101928715A (zh) | 2009-06-30 | 2009-06-30 | 丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101928715A true CN101928715A (zh) | 2010-12-29 |
Family
ID=43368144
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200910148593 Pending CN101928715A (zh) | 2009-06-30 | 2009-06-30 | 丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101928715A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102337279A (zh) * | 2011-06-22 | 2012-02-01 | 上海师范大学 | SmHMGR和SmDXR双基因共转化提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法 |
CN103695441A (zh) * | 2013-10-24 | 2014-04-02 | 中国中医科学院中药研究所 | 一个参与丹参酮生物合成的cyp450基因及其编码产物与应用 |
CN105802924A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-07-27 | 上海交通大学 | 蚯蚓细胞色素p450基因及其编码的蛋白 |
CN108866016A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-11-23 | 中国中医科学院中药研究所 | 蛋白质及其在制备隐丹参酮中的应用 |
CN109517830A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-03-26 | 江苏师范大学 | 大戟二萜类化合物合成基因cyp71d452、其编码的蛋白质与应用 |
CN110747178A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-04 | 首都医科大学 | 雷公藤细胞色素p450氧化酶在制备松香烷型二萜化合物中的应用 |
-
2009
- 2009-06-30 CN CN 200910148593 patent/CN101928715A/zh active Pending
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102337279A (zh) * | 2011-06-22 | 2012-02-01 | 上海师范大学 | SmHMGR和SmDXR双基因共转化提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法 |
CN103695441A (zh) * | 2013-10-24 | 2014-04-02 | 中国中医科学院中药研究所 | 一个参与丹参酮生物合成的cyp450基因及其编码产物与应用 |
CN105802924A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-07-27 | 上海交通大学 | 蚯蚓细胞色素p450基因及其编码的蛋白 |
CN108866016A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-11-23 | 中国中医科学院中药研究所 | 蛋白质及其在制备隐丹参酮中的应用 |
CN108866016B (zh) * | 2017-05-16 | 2021-11-02 | 中国中医科学院中药研究所 | 蛋白质及其在制备隐丹参酮中的应用 |
CN109517830A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-03-26 | 江苏师范大学 | 大戟二萜类化合物合成基因cyp71d452、其编码的蛋白质与应用 |
CN110747178A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-04 | 首都医科大学 | 雷公藤细胞色素p450氧化酶在制备松香烷型二萜化合物中的应用 |
CN110747178B (zh) * | 2019-11-08 | 2021-05-07 | 首都医科大学 | 雷公藤细胞色素p450氧化酶在制备松香烷型二萜化合物中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101928716A (zh) | 丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPS)基因及其编码的蛋白和应用 | |
CN101928717A (zh) | 丹参鲨烯合酶(SmSQS)基因及其编码的蛋白和应用 | |
CN101475946B (zh) | 丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用 | |
CN101319220B (zh) | 一种丹参二萜合酶基因及其编码产物与应用 | |
CN101928715A (zh) | 丹参一细胞色素P450(SmP450)基因及其编码的蛋白和应用 | |
CN101538576A (zh) | 一个与丹参酮类化合物生成相关的二萜合酶基因及其编码产物与应用 | |
CN109055399B (zh) | 一种与黄芩中黄酮合成物相关的基因序列及其应用 | |
CN103602686A (zh) | 一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用 | |
KR20200121331A (ko) | 키메라 테르펜 합성효소 | |
CN112724217B (zh) | 一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108及其应用 | |
CN110885846B (zh) | 合成黄芩素和野黄芩素的微生物、其制备方法及其应用 | |
CN101830973B (zh) | 水稻OsAHL蛋白及其应用 | |
CN102465133B (zh) | 金银花查尔酮合酶(LjCHS)基因及其编码的蛋白和应用 | |
CN101613704A (zh) | 一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因的分析及应用 | |
CN101654678A (zh) | 一种丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)基因的分析及应用 | |
CN102465136B (zh) | 金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因及其编码的蛋白和应用 | |
CN101250544B (zh) | 丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因及其编码的蛋白质和应用 | |
CN101250543B (zh) | 日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及其编码的蛋白质和应用 | |
CN101698850A (zh) | 水稻OsMS2基因及其编码的蛋白 | |
CN106318920B (zh) | 黄酮-6-羟化酶及其在灯盏乙素合成中的应用 | |
CN114507646B (zh) | 细胞色素p450突变体蛋白及其应用 | |
CN101619320A (zh) | 麻疯树鲨烯合酶蛋白编码序列及其在植物中的应用 | |
CN101693739A (zh) | 绿原酸合成相关蛋白及其编码基因与应用 | |
CN102465135A (zh) | 黄芩咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶(SbCCOMT2)基因及其编码产物和应用 | |
CN102399798B (zh) | 斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20101229 |