CN114507646B

CN114507646B - 细胞色素p450突变体蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114507646B
Application number: CN202011285843.2A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 李晓东; 王平平; 严兴
Original assignee: Shenghe Everything Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenghe Everything Suzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: WO2022105729A1; JP2023554233A; US20240035062A1; CN114507646A; KR20230117150A

Abstract

本发明提供了一种细胞色素P450(CYP716A53v2)突变体蛋白及其应用。本发明人经过大量的突变研究，确定了与CYP716A53v2酶的催化活性相关的氨基酸位点，通过进行定点改造，获得酶催化活性的大大提高的CYP716A53v2突变体。本发明还提供了表达所述突变体基因工程细胞。

Description

细胞色素P450突变体蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和天然产物药物等领域，具体地，本发明涉及一种细胞色素P450(CYP716A53v2)的突变体蛋白及其应用。

背景技术

人参皂苷是五加科人参属植物(如人参、三七、西洋参等)中的主要活性物质，近年来在葫芦科植物绞股蓝中也发现一些人参皂苷。目前，国内外科学家已经从人参、绞股蓝等植物中分离出了至少100多种人参皂苷，这些皂苷在人参中的含量差别非常大。其中一些疗效显著的三萜皂苷在天然总皂苷中含量极低(亦被称为稀有皂苷)，由于提取的成本很高，所以价格就非常昂贵。目前多种皂苷已经应用于药品和保健品，如以人参皂苷Rg3单体为主要成分的药物参一胶囊可改善肿瘤患者的气虚症状，提高机体免疫功能；以人参皂苷Rh1等16种稀有人参皂苷混合物为主要成分的瑞得生胶囊可以抑制肿瘤部位新生血管生成，促进癌变细胞凋亡，并降低化疗耐药。

由于稀有人参皂苷往往具有独特生物活性或更显著疗效，传统制备稀有人参皂苷都是从人参或三七中提取的大量皂苷经过化学水解法、酶法水解和微生物法水解来制备。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参总皂苷资源目前主要来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，并且人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。另一方面，以人参总皂苷为原料来制备单一成分的皂苷，因为总皂苷中还有大量的成份无法转化为目标人参皂苷单体(例如原人参三醇型皂苷)无法得到利用，不仅造成资源的浪费，还会增加抽提纯化成本。

合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成稀有人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)，因此，通过合成生物学技术制备稀有人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度稀有人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。

利用合成生物学方法来人工合成具有药用活性的原人参三醇型人参皂苷，首要需要解析与重构原人参三醇PPT的合成代谢途径。由于人参皂苷属于三萜化合物，植物中MVA和MEP代谢途径提供了萜类化合物的共同前体IPP和DMAPP，为三萜化合物前体角鲨烯和2,3-环氧角鲨烯的合成奠定了基础。2006年韩国与日本科学家从人参中分别克隆并鉴定了由环氧角鲨烯转化为达玛烯二醇的合酶DS(Han,J.Y.,et al.,Plant Cell Physiol,2006.47(12):p.1653-62.；Tansakul,P.,et al.,FEBS Lett,2006.580(22):p.5143-9)，韩国研究者Han JY分别在2011年(Han,J.Y.,et al.,Plant Cell Physiol,2011.52(12):p.2062-73)和2012年(Han,J.Y.,et al.,Plant Cell Physiol,2012.53(9):p.1535-45)从人参的cDNA文库中克隆并鉴定了合成原人参二醇和原人参三醇的关键细胞色素P450，CYP716A47和CYP716A53v2。CYP716A47可以催化达玛烯二醇C12位羟基化生成原人参二醇PPD，CYP716A53v2可以催化原人参二醇C6位羟基化生成原人参三醇PPT。在WAT21酵母中共表达了DS和这两个细胞色素P450以及拟南芥来源的P450还原酶ATR2-1，并获得了可以生产原人参二醇和原人参三醇的重组菌株。进一步研究表明，CYP716A53v2催化原人参二醇向原人参三醇的转化是整个合成途径中的一个关键限速步骤。

因此，本领域需要对细胞色素P450 CYP716A53v2进行更多的研究和改造，以获得更高效的细胞色素P450蛋白元件从而促进人参皂苷细胞工厂合成效率。

发明内容

本发明对细胞色素P450 CYP716A53v2的蛋白编码序列进行了突变和优化获得了新的突变序列，在产原人参二醇的细胞内表达该突变序列可以显著提高原人参三醇的产量。

在本发明的第一方面，提供一种提高细胞色素P450 CYP716A53v2的催化活性的方法，包括：对细胞色素P450 CYP716A53v2的氨基酸序列进行突变，对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，突变选自下组的位点或其组合：第167位，第451位，第117位，第208位。

在一个优选例中，所述氨基酸位置编号基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，第167位突变为Val(V)，第451位突变为Asn(A)，第117位突变为Ser(S)，第208位突变为Cys(C)。

在本发明的另一方面，提供一种细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，选自下组的位点或位点组合发生突变的蛋白：第167位，第451位，第117位，第208位(较佳地，它们为核心氨基酸突变)；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；或，(d)(a)～(c)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的多肽。

在一个优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体具有显著高于其野生型的催化活性。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体中，第167位突变为Val(V)。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体中，第451位突变为Asn(A)。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体中，第117位突变为Ser(S)。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体中，第208位突变为Cys(C)。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体包括选自下组的蛋白：对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，

(1)第117位突变为Ser、第451位突变为Ala；

(2)第117位突变为Ser、第208位突变为Cys、第167位突变为Val、第451位突变为Ala；

(3)第117位突变为Ser、第208位突变为Cys；

(4)第117位突变为Ser、第208位突变为Cys、第451位突变为Ala；

(5)第167位突变为Val；

(6)第451位突变为Ala；

(7)第117位突变为Ser；

(8)第208位突变为Cys。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸是编码前面任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有前面任一所述的载体，或基因组中整合有前面任一所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞或原核细胞；较佳地，所述真核细胞包括(但不限于)：酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、霉菌细胞、哺乳动物细胞；更佳地，所述的酵母细胞包括(但不限于)：酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞(更优选地为酿酒酵母细胞)；更佳地，所述的植物细胞包括(但不限于)：人参细胞；较佳地，所述的原核细胞包括(但不限于)：大肠杆菌、枯草杆菌细胞。

在本发明的另一方面，提供一种前面任一所述的细胞色素P450CYP716A53v2突变体的制备方法，包含：

(i)培养所述的宿主细胞；

(ii)收集含有所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体的培养物；

(iii)从培养物中分离出所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体。

在本发明的另一方面，提供一种用于催化原人参二醇生成原人参三醇的组合物，含有有效量的：前面任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体；或，所述的宿主细胞或其培养物或裂解物；以及，食品学或工业上可接受的载体。

在一个优选例中，所述催化为高效催化，其催化效率比野生型高至少10％以上，较佳地高至少20％以上，更佳地高至少30％以上，如高40％以上、50％以上、60％以上。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的细胞色素P450CYP716A53v2突变体的用途，用于催化原人参二醇生成原人参三醇；较佳地，所述细胞色素P450 CYP716A53v2突变体在原人参二醇的C6位增加一个羟基，从而生成原人参三醇。

在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于催化原人参二醇生成原人参三醇；较佳地，所述细胞色素P450 CYP716A53v2突变体在原人参二醇的C6位增加一个羟基，从而生成原人参三醇。

在本发明的另一方面，提供一种催化原人参二醇生成原人参三醇的方法，所述方法包括：利用前面任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体或所述的组合物处理原人参二醇；较佳地，所述细胞色素P450 CYP716A53v2突变体在原人参二醇的C6位增加一个羟基，从而生成原人参三醇。

在本发明的另一方面，提供一种用于催化原人参二醇生成原人参三醇的试剂盒，其中含有：所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体或突变体的组合；所述的宿主细胞；或所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了在酿酒酵母底盘细胞中整合突变的CYP716A53v2的PPT产量。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过建立大量的CYP716A53v2突变体，进行突变体功能研究，确定了与酶催化活性相关的氨基酸位点，通过进行定点改造，获得酶催化活性显著提高的突变体。

本发明突变体及其编码核酸

本发明人利用合成原人参二醇PPD的酿酒酵母底盘细胞ZW，建立了细胞色素P450(CYP716A53v2)的突变体库：通过将随机突变的CYP716A53v2基因转化酿酒酵母底盘细胞ZW构建了一个单拷贝插入酵母基因组并合成原人参三醇PPT的CYP716A53v2酵母突变体文库。基于菌株PPT产量，本发明人确定了提高CYP716A53v2活性的关键氨基酸位点。本发明发现，对细胞色素P450(CYP716A53v2)的关键位点进行改造后获得的一些突变体，可以提高PPT产量。

如本文所用，术语“突变体(蛋白)”、“CYP716A53v2突变体”、“突变型CYP716A53v2”可互换使用，均指非天然存在的具有催化原人参二醇生成原人参三醇的蛋白，且所述突变蛋白为SEQ ID NO:1所示蛋白，或基于SEQ ID NO:1所示蛋白进行人工改造的蛋白(包括其非活性位点发生变化的变体、衍生物等)，其中，所述的突变蛋白含有与酶催化活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有催化原人参二醇(PPD)的C6羟基化形成原人参三醇(PPT)的酶活性。

术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO:1，且与SEQ ID NO:1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO:1所示的序列，核心氨基酸为：第167位氨基酸为V；第451位氨基酸为A；第117位氨基酸为S；第208位氨基酸为C；第117位氨基酸为S和第208位氨基酸为C；第117位氨基酸为S和第451位氨基酸为A；第117位氨基酸为S、第208位氨基酸为C和第451位氨基酸为A；第117位氨基酸为S、第167位氨基酸为V、第208位氨基酸为C和第451位氨基酸为A。

应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID NO:1，当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO:1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似酶活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

本发明突变体(突变蛋白)是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

表达载体及宿主细胞

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质

本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

应用

本发明的CYP716A53v2突变体可特异性作用于原人参二醇，在其C6位加上羟基，从而生成原人参三醇，并且，其催化活性高于野生型的CYP716A53v2。所述催化为高效催化，其催化效率比野生型高至少10％以上，较佳地高至少20％以上，更佳地高至少30％以上，如高40％以上、50％以上、60％以上。

在获得了本发明的CYP716A53v2突变体后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用本发明的突变体来发挥对于底物原人参二醇的催化作用，并获得显著由于野生型的CYP716A53v2的技术效果。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的CYP716A53v2突变体或其衍生多肽还可被固定于固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

作为一种可选的方式，可利用本发明的CYP716A53v2突变体进行体外生产，可以通过规模化生产的本发明的CYP716A53v2突变体(可以是其提取物(包括粗提物)或发酵液，也可以是其经分离纯化后的产物)，在存在人参原二醇的情况下(作为底物)进行反应，以获得人参原三醇产物。

作为本发明的另一优选方式，利用生物合成的方法进行生产。这通常包括：(1)提供一工程细胞，该细胞具有选自下组的至少一方面特征：包含原人参三醇(PPT)的合成代谢途径或生产途径；(2)在(1)所述工程细胞中表达本发明所述的CYP716A53v2突变体，或以本发明的CYP716A53v2突变体取代该代谢途径中的野生型CYP716A53v2；以及(3)培养(2)的工程细胞，生产原人参三醇产物。在更为优选的方式中，所述方法还包括：从工程细胞的培养物中，分离纯化所述产物的步骤。

在利用生物合成的方法进行生产时，作为本发明的优选方式，还包括在细胞中强化原人参三醇(PPT)合成代谢途径中其它化合物代谢途径/生产途径。也可以通过强化其合成代谢途径的上游途径的化合物的产生，来提供更多的上游底物，作为本发明的催化反应的前体。应理解，其它一些强化原人参三醇(PPT)合成代谢途径的方法也可被包含于本发明中。

本发明的CYP716A53v2突变体还能被应用于制备具有催化作用的组合物。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中CYP716A53v2突变体的有效量。

本发明所述的CYP716A53v2突变体、含有其的组合物，表达其的细胞等，可被包含在试剂盒中，以便于扩大化应用或商业应用。较佳地，所述试剂盒中还可包括适于进行所述基因工程细胞的培养的培养基或培养组分。较佳地，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书，以指导本领域技术人员以适当的方法来进行生产。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

野生型CYP716A53v2蛋白序列(SEQ ID NO:1)：

上述序列中，突变位点以黑体下划线表示。

实施例1、通过随机突变获得高效的细胞色素P450突变体蛋白

(1)以pUC57-synPPTS(含有CYP716A53v2编码基因的质粒)为模板，利用引物SJ-F(SEQ ID NO:2)和SJ-R(SEQ ID NO:3)进行易错PCR。所述易错PCR选用Stratagene公司GeneMorph II Random Mutagenesis Kit随机突变试剂盒。PCR程序为：95℃2min；95℃10s，55℃15s，72℃1min30s，共24个循环；72℃10min降至10℃，pUC57-synPPTS模板使用量为900ng。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收获得CYP716A53v2易错PCR产物。

SJ-F：atggatttgtttatttcttc(SEQ ID NO:2)；

SJ-R：ttacaatgtacatggagaca(SEQ ID NO:3)。

(2)以表2所述的引物与模板进行PCR反应，扩增目标DNA片段，用于菌株构建。所述PCR体系为擎科公司高保真PCR酶I-5^TM 2×High-Fidelity Master Mix标准体系。PCR程序为：98℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃1min，共30个循环；72℃10min降至10℃。经琼脂糖凝胶电泳回收后获得各PCR产物。所述PCR产物片段两端利用PCR引物分别带上70bp左右与其前后相邻的两端片段同源的序列，用于在酿酒酵母中同源重组。

表2

正向引物/反向引物	SEQ ID NO:	PCR模板	PCR产物
				PPT-UP-F/PPT-UP-R	4/5	酿酒酵母基因组	PPT-UP
PPT-TEF1-F/PPT-TEF1-R	6/7	酿酒酵母基因组	PPT-TEF1
				PPT-PPTS-F/PPT-PPTS-R	8/9	易错PCR产物	PPT-PPTS
PPT-PRM9-F/PPT-PRM9-R	10/11	酿酒酵母基因组	PPT-PRM9
				PPT-KAN-F/PPT-KAN-R	12/13	pLKAN质粒	PPT-KAN
PPT-DN-F/PPT-DN-R	14/15	酿酒酵母基因组	PPT-DN

PPT-UP-F：cccaaagctaagagtcccat(SEQ ID NO:4)；

PPT-UP-R：gtagaaacattttgaagctatggtgtgtgggggatcactctgctcttgaatggcgacag(SEQ ID NO:5)；

PPT-TEF1-F：aacactggggcaataggctgtcgccattcaagagcagagtgatcccccacacaccatag(SEQ ID NO:6)；

PPT-TEF1-R：aacaataacaattgtgaagaaataaacaaatccattttgtaattaaaacttagattaga(SEQ ID NO:7)；

PPT-PPTS-F：gaaagcatagcaatctaatctaagttttaattacaaaatggatttgtttatttcttcac(SEQ ID NO:8)；

PPT-PPTS-R：agtgtctcccgtcttctgtctaatgatgatgatgatgatgcaatgtacatggagacaat(SEQ ID NO:9)；

PPT-PRM9-F：attgtctccatgtacattgcatcatcatcatcatcattagacagaagacgggagacact(SEQ ID NO:10)；

PPT-PRM9-R：ctgtcgattcgatactaacgccgccatccagtgtcgaattttcaacatcgtattttccg(SEQ ID NO:11)；

PPT-KAN-F：cattatgcaacgcttcggaaaatacgatgttgaaaattcgacactggatggcggcgtta(SEQ ID NO:12)；

PPT-KAN-R：aattcaaaaaaaaaaagcgaatcttcccatgcctgttcagcgacatggaggcccagaat(SEQ ID NO:13)；

PPT-DN-F：agactgtcaaggagggtattctgggcctccatgtcgctgaacaggcatgggaagattcg(SEQ ID NO:14)；

PPT-DN-R：tctggtgaggatttacggtatg(SEQ ID NO:15)。

(3)将上述所有产物DNA片段各100ng混匀后转化酿酒酵母菌株ZW(Wang,P.P.,etal.,Cell Discovery,2019.5(5))感受态。转化完成后菌株均匀涂布于YPD+200mg/L G418抗生素筛选平板，30℃静置培养48h。将所有克隆用牙签挑取转接到96孔板中，30℃震荡培养24h，以1:100的比例转接到一个新的96孔板中进行发酵96h。

化合物提取：向发酵液中加入等体积的正丁醇溶剂萃取24h，吸取上层有机相进行HPLC检测各个转化子原人参二醇和原人参三醇产量及其比例。

(4)经过大量的筛选工作，本发明人获得原人参三醇产量PPT提高20％且原人参三醇/原人参二醇的比例(PPT/PPD)提高20％以上的克隆共4个，编号分别为SJ-1、SJ-2、SJ-3和SJ-4。分别以上述4个克隆的基因组为模板，利用引物SJ-F和SJ-R进行PCR获得各克隆的细胞色素P450片段，进行测序检测获得各突变体蛋白序列。

上述获得的各野生型和突变体蛋白序列信息及PPT产量如表3和图1所示：

表3

实施例2、将突变位点进行整合，获得更高效CYP716A53v2突变体

通过实施例1的随机突变方法共获得了4个活性提高位点：F167V、T451A、I117S、L208C。

在野生型CYP716A53v2基因的基础上，将以上4个突变位点进行多种组合，获得一系列CYP716A53v2的突变基因。以实施例1中(2)和(3)所示的方法，将上述CYP716A53v2的组合突变基因分别转入到ZW酵母感受态中，构建一系列相应的菌株进行发酵。

发酵方法：每种突变体挑6个单克隆到96孔板中，30℃震荡培养24h，以1:100的比例转接到一个新的96孔板中进行发酵96h(酵母自身可以产生羟基供体)。

化合物提取：向发酵液中加入等体积的正丁醇溶剂把化合物从菌中萃取出来，萃取24h，吸取上层有机相进行HPLC检测各个转化子原人参二醇和原人参三醇产量及其比例。

表4

突变体	突变位点	PPT产量提高
			synPPTS	无	0
ZH-1	I117S、L208C	54.3％
			ZH-2	I117S、T451A	61.4％
ZH-3	I117S、L208C、T451A	48.4％
			ZH-4	I117S、L208C、F167V、T451A	58.9％

实施例3、利用所述细胞色素P450突变体蛋白进行原人参三醇高效异源合成

本实施例中，利用所述细胞色素P450突变体蛋白进行原人参三醇高效异源合成，具体方法如下：

(1)以表2所述的引物与模板进行PCR反应，扩增目标DNA片段，用于菌株构建。所述PCR体系为擎科公司高保真PCR酶I-5^TM 2×High-Fidelity Master Mix标准体系。PCR程序为：98℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃1min，共30个循环；72℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后获得各PCR产物。所述PCR产物片段两端分别带有70bp左右与其前后相邻的两端片段同源的序列，用于在酿酒酵母中同源重组。

将上述所有基因，同源臂及筛选标记基因PCR片段各100ng混匀后转化酿酒酵母菌株感受态ZW，获得生产原人参三醇的重组酿酒酵母菌株PPT-WT菌株。

(2)类似的分别以突变体基因ZH-1、ZH-2、ZH-3、ZH-4代替野生型CYP716A53v2基因为模板。进行上述PCR获得各个PCR片段，分别转化酿酒酵母感受态ZW，获得含各突变体蛋白的生产原人参三醇的重组酿酒酵母菌株PPT-ZH-1菌株、PPT-ZH-2菌株、PPT-ZH-3菌株、PPT-ZH-4菌株。

(3)配制固体培养基：配制培养基：1％酵母提取物，2％Bacto蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％琼脂粉。配制液体培养基：配制培养基：配制培养基：1％酵母提取物，2％Bacto蛋白胨，2％D-葡萄糖。

(4)挑取在固体培养基平板上划线的重组酿酒酵母菌PPT-ZH-1菌株、PPT-ZH-2菌株、PPT-ZH-3菌株、PPT-ZH-4菌株，分别于含有5mL液体培养基的试管震荡培养过夜(30℃，250rpm，16h)；离心收集菌体，转移至10mL液体培养基的50mL三角瓶中，调OD600至0.05，30℃，250rpm震荡培养4天得到发酵产物。本方法对每一株重组酵母同时设置一个平行实验。

(5)原人参三醇提取及检测：从10mL发酵液中吸取100μL发酵液，用Fastprep震荡裂解酵母，加入等体积的正丁醇抽提，而后在真空条件下使正丁醇蒸干。用100μL甲醇溶解后通过HPLC检测目的产物的产量。

上述获得的各重组酿酒酵母菌株原人参三醇如表5和图1所示：

表5

菌株	PPT产量mg/L
		PPT-WT	59.3
PPT-ZH-1	91.5
		PPT-ZH-2	95.7
PPT-ZH-3	88.0
		PPT-ZH-4	94.2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 细胞色素P450突变体蛋白及其应用

<130> 208308

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> 人参(Panax L.)

<400> 1

Met Asp Leu Phe Ile Ser Ser Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Phe Cys

1 5 10 15

Leu Phe Leu Phe Trp Asn Phe Lys Pro Ser Ser Gln Asn Lys Leu Pro

20 25 30

Pro Gly Lys Thr Gly Trp Pro Ile Ile Gly Glu Thr Leu Glu Phe Ile

35 40 45

Ser Cys Gly Gln Lys Gly Asn Pro Glu Lys Phe Val Thr Gln Arg Met

50 55 60

Asn Lys Tyr Ser Pro Asp Val Phe Thr Thr Ser Leu Ala Gly Glu Lys

65 70 75 80

Met Val Val Phe Cys Gly Ala Ser Gly Asn Lys Phe Ile Phe Ser Asn

85 90 95

Glu Asn Lys Leu Val Val Ser Trp Trp Pro Pro Ala Ile Ser Lys Ile

100 105 110

Leu Thr Ala Thr Ile Pro Ser Val Glu Lys Ser Lys Ala Leu Arg Ser

115 120 125

Leu Ile Val Glu Phe Leu Lys Pro Glu Ala Leu His Lys Phe Ile Ser

130 135 140

Val Met Asp Arg Thr Thr Arg Gln His Phe Glu Asp Lys Trp Asn Gly

145 150 155 160

Ser Thr Glu Val Lys Ala Phe Ala Met Ser Glu Ser Leu Thr Phe Glu

165 170 175

Leu Ala Cys Trp Leu Leu Phe Ser Ile Asn Asp Pro Val Gln Val Gln

180 185 190

Lys Leu Ser His Leu Phe Glu Lys Val Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu

195 200 205

Pro Leu Asn Phe Pro Gly Thr Ala Phe Asn Arg Gly Ile Lys Ala Ala

210 215 220

Asn Leu Ile Arg Lys Glu Leu Ser Val Val Ile Lys Gln Arg Arg Ser

225 230 235 240

Asp Lys Leu Gln Thr Arg Lys Asp Leu Leu Ser His Val Met Leu Ser

245 250 255

Asn Gly Glu Gly Glu Lys Phe Phe Ser Glu Met Asp Ile Ala Asp Val

260 265 270

Val Leu Asn Leu Leu Ile Ala Ser His Asp Thr Thr Ser Ser Ala Met

275 280 285

Gly Ser Val Val Tyr Phe Leu Ala Asp His Pro His Ile Tyr Ala Lys

290 295 300

Val Leu Thr Glu Gln Met Glu Ile Ala Lys Ser Lys Gly Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Trp Glu Asp Ile Lys Arg Met Lys Tyr Ser Arg Asn Val

325 330 335

Ile Asn Glu Ala Met Arg Leu Val Pro Pro Ser Gln Gly Gly Phe Lys

340 345 350

Val Val Thr Ser Lys Phe Ser Tyr Ala Asn Phe Ile Ile Pro Lys Gly

355 360 365

Trp Lys Ile Phe Trp Ser Val Tyr Ser Thr His Lys Asp Pro Lys Tyr

370 375 380

Phe Lys Asn Pro Glu Glu Phe Asp Pro Ser Arg Phe Glu Gly Asp Gly

385 390 395 400

Pro Met Pro Phe Thr Phe Ile Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys

405 410 415

Pro Gly Ser Glu Phe Ala Arg Leu Glu Val Leu Ile Phe Met His His

420 425 430

Leu Val Thr Asn Phe Lys Trp Glu Lys Val Phe Pro Asn Glu Lys Ile

435 440 445

Ile Tyr Thr Pro Phe Pro Phe Pro Glu Asn Gly Leu Pro Ile Arg Leu

450 455 460

Ser Pro Cys Thr Leu

465

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

atggatttgt ttatttcttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

ttacaatgta catggagaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cccaaagcta agagtcccat 20

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

gtagaaacat tttgaagcta tggtgtgtgg gggatcactc tgctcttgaa tggcgacag 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

aacactgggg caataggctg tcgccattca agagcagagt gatcccccac acaccatag 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

aacaataaca attgtgaaga aataaacaaa tccattttgt aattaaaact tagattaga 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

gaaagcatag caatctaatc taagttttaa ttacaaaatg gatttgttta tttcttcac 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

agtgtctccc gtcttctgtc taatgatgat gatgatgatg caatgtacat ggagacaat 59

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

attgtctcca tgtacattgc atcatcatca tcatcattag acagaagacg ggagacact 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ctgtcgattc gatactaacg ccgccatcca gtgtcgaatt ttcaacatcg tattttccg 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

cattatgcaa cgcttcggaa aatacgatgt tgaaaattcg acactggatg gcggcgtta 59

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

aattcaaaaa aaaaaagcga atcttcccat gcctgttcag cgacatggag gcccagaat 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

agactgtcaa ggagggtatt ctgggcctcc atgtcgctga acaggcatgg gaagattcg 59

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

tctggtgagg atttacggta tg 22

Claims

1. 一种提高细胞色素P450 CYP716A53v2的催化活性的方法，包括：对野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的氨基酸序列进行突变，对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，突变仅选自下组的位点或其组合：第451位突变为Ala，第117位突变为Ser；

所述野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，第451位突变为Ala且第117位突变为Ser。

3. 一种细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其是：

(a) 氨基酸序列对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，仅选自下组的位点或位点组合发生突变的蛋白：第451位突变为Ala，第117位突变为Ser；

(b) (a)所述突变体的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的多肽；

4. 如权利要求3所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其特征在于，(a)中，第451位突变为Ala，且第117位突变为Ser。

5. 分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是编码权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，或基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞包括：植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述真菌细胞包括酵母细胞或霉菌细胞。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述的酵母细胞包括：酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞。

12.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述的植物细胞包括：人参细胞。

13.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的原核细胞包括：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞。

14. 一种权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体的制备方法，包含：

(i) 培养权利要求7所述的宿主细胞；

(ii) 收集含有权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体的培养物；

(iii) 从培养物中分离出所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体。

15. 一种用于催化原人参二醇生成原人参三醇的组合物，含有有效量的：权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体以及食品学或工业上可接受的载体；或，权利要求7所述的宿主细胞或其培养物或裂解物以及食品学或工业上可接受的载体。

16. 权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体或权利要求15所述的组合物的用途，用于催化原人参二醇生成原人参三醇。

17. 如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述细胞色素P450 CYP716A53v2突变体在原人参二醇的C6位增加一个羟基，从而生成原人参三醇。

18. 一种催化原人参二醇生成原人参三醇的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体或权利要求15所述的组合物处理原人参二醇。

19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细胞色素P450 CYP716A53v2突变体在原人参二醇的C6位增加一个羟基，从而生成原人参三醇。

20.一种用于催化原人参二醇生成原人参三醇的试剂盒，其中含有：

权利要求3～4任一所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体；

权利要求7所述的宿主细胞；或

权利要求15所述的组合物。