CN109136203B

CN109136203B - 一种p450bm3突变体及其在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用

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Publication number: CN109136203B
Application number: CN201811127439.5A
Authority: CN
Inventors: 李爱涛; 周航宇; 余小娟; 王斐
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2038-09-27
Also published as: CN109136203A

Abstract

本发明提供了一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，细胞色素P450BM3单加氧酶突变体及其编码基因，含有P450BM3单加氧酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化子、该突变体的制备方法，以及该突变体在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用。与野生型细胞色素P450BM3单加氧酶相比，本发明的P450BM3突变体表现出了高活性和优异的区域选择性，使用该突变体能够更好地制备纯的对苯二酚，同时能大幅度降低生产成本，从而更好地用于对苯二酚的工业化生产中。

Description

一种P450BM3突变体及其在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，细胞色素P450BM3单加氧酶突变体及其编码基因，含有P450BM3单加氧酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化子、该突变体的制备方法，以及该突变体在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用。

背景技术

对苯二酚(Hydroquinone；HQ)是化学和制药领域中的重要中间体。它可被用作照相的显影剂、橡胶和汽油的抗氧化剂，是制造染料和医药化合物的原料，以及制备生物活性天然产物和功能性材料如聚合物液晶和其他聚合物的基本原料。对苯二酚也是一种天然产物，以信息素的形式存在于白蚁中，同时以被称为熊果苷的单糖基化形式存在于各种高等植物中。

目前，化学催化对苯二酚合成的最原始途径是通过苯胺的氧化，苯胺被MnO₂在H₂SO₄水溶液中氧化形成苯醌，然后通过Fe⁰或氢化作用还原苯醌，最后得到产物氢醌。虽然目前全球约10％的对苯二酚仍然采用这种方式生产，但是Krumenacker,L等(InKirkOthmer Encyclopedia of Chemical Technology；Kroschwitz,J.I.,HoweGrant,M.,Eds.；Wiley:New York,1995；Vol.13,p996.)报道，这种通过中间体硝基苯和苯胺合成对苯二酚的方法会产生大量的氧化铁盐、MnSO₄及(NH₄)₂SO₄等有毒物质，因此未获得工业认可。另外，全球约60％的化学合成对苯二酚的方法仍然是利用苯作为原料。苯或异丙苯与烷基化剂丙烯或异丙醇发生傅式反应合成1,4-二异丙基苯，1,4-二异丙基苯在空气中氧化产生二氢过氧化物，羟基过氧化氢和二甲醇。经过H₂O₂处理后，羟基过氧化氢和二甲醇被转化为二氢过氧化物，二氢过氧化物再经过酸催化裂解产生对苯二酚。然而，该方法同时也会产生副产物丙酮，且在酸催化裂解期间，会形成爆炸性丙酮氢过氧化物。由此看出，这种方法不仅步骤繁琐，而且操作安全性差。再者，化学催化合成对苯二酚还可以通过在酸催化剂存在下苯酚与H₂O₂的反应获得，但此反应的产物为对苯二酚和邻苯二酚的混合物。这种方法在工业上尚未成为一种实用的替代方案。

此外，Ningqing Ran等(Journal of the American Chemical Society,2001,123(44):10927-10934.)报道了一种以葡萄糖为原料通过微生物发酵法生产奎尼酸，然后通过化学法对奎尼酸进行脱羧反应合成对苯二酚的方法，然而此方法同样需要化学催化剂参与。而且当纯化的奎宁酸在酸化的水溶液中与MnO₂反应时，产物是苯醌而不是对苯二酚，因此化学法所用的试剂需要足够温和以避免氢醌过氧化成苯醌。总之，就“绿色化学”而言，以上的化学法或“化学-生物法”合成对苯二酚的缺点是显而易见的。

针对以上化学法或“化学-生物法”合成对苯二酚存在的问题，生物法以苯或者苯酚为底物催化合成对苯二酚已经报道。丁烷-分解代谢细菌Mycobacterium sp.HB50可以催化苯酚氧化合成对苯二酚，而甲烷分解代谢细菌Methylosinus trichosporium.OB3b可以催化苯连续的羟基化获得对苯二酚。Yoshikawa,A等(In Industrial Application ofImmobilized Biocatalysis；Tanaka,A.,Tosa,T.,Kobayashi,T.,Eds.；Marcel Dekker:New York,1993；Chapter 10,p)报道，通过开发连续反应体系，可以使Mycobacteriumsp.HB50将苯酚转化为对苯二酚的比容积达到2-3g/L/h。Hall,M等报道(Hall,M.C.European Patent 0 073 134 A2,1982.)通过使用恒化器控制反应条件，可以使Methylosinus trichosporium.OB3b催化苯合成约1g/L的对苯二酚。总的来说，两种菌体催化合成对苯二酚的产量都很低(1g/L)，并且菌体内起催化作用的关键酶尚没有报道，导致对其进行改造来提高对苯二酚的产量显得非常困难。

综上所述，现有的化学法、“化学-生物”法均存在步骤繁琐，操作安全性差，副产物多，产品得率低等问题，生物酶法催化制备对苯二酚同样产量低且存在技术瓶颈。因此有必要寻找一种绿色安全的方法提高对苯二酚的产量，同时能降低生产成本。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于以细胞色素P450-BM3野生型为基础，通过蛋白质工程和定向进化的手段对其进行改造，提高其催化苯一锅法合成对苯二酚的活性或以苯酚为底物合成对苯二酚的活性。

为了实现上述技术目的，本发明人基于已报道的细胞色素P450-BM3单加氧酶的结构，在含有结构小的底物(环己酮)的P450-BM3的结合口袋内的8个残基处，进行基于NNK的探索性饱和诱变，通过分析获得的每个位置的突变指纹图谱，意外发现在野生型细胞色素P450BM3单加氧酶氨基酸序列的基础上对第78位的缬氨酸残基，第82位的丙氨酸残基和第328位的丙氨酸残基进行单点替换后，蛋白质表现出显著增强的酶催化活性和区域选择性。以此为基础，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：

首先，本发明提供了一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，该突变位点位于野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的如下氨基酸处：

(1)第78位缬氨酸处；

或(2)第82位丙氨酸处；

或(3)第328位丙氨酸处；

或(4)第78位缬氨酸和第82位丙氨酸处；

或(5)第78位缬氨酸和第328位丙氨酸处；

或(6)第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；

或(7)第78位缬氨酸、第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；

将所述突变位点的氨基酸突变为苯丙氨酸后，细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著提高。

其次，由于按上述突变位点突变后得到的细胞色素P450BM3单加氧酶作为催化剂，其催化苯或苯酚合成产物对苯二酚时具有更高的活性和区域选择性，因此本发明还提供了上述的突变位点在提高细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活及催化选择性中的应用，所述的比酶活是细胞色素P450BM3单加氧酶催化苯一锅法合成对苯二酚的活性或/和以苯酚为底物合成对苯二酚的活性，所述的催化选择性是底物苯或苯酚的对位选择性羟基化。

另外，根据上述与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，本发明还提供了一系列比酶活提高的细胞色素P450BM3单加氧酶突变体，包括：

(1)将野生型细胞色素P450BM3单加氧酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的第78位的缬氨酸残基替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450V78F；

(2)将野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的第82位的丙氨酸残基替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450A82F；

(3)将野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的第328位的丙氨酸残基替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450A328F；

(4)将野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的第78位的缬氨酸残基和第82位的丙氨酸残基同时替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450V78F/A82F；

(5)野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的第78位的缬氨酸残基和第328位的丙氨酸残基同时替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450V78F/A328F；

(6)将野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的第82位的丙氨酸残基和第328位的丙氨酸残基同时替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450A82F/A328F；

(7)将野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的第78位的缬氨酸残基，第82位的丙氨酸残基以及第328位的丙氨酸残基都同时替换为苯丙氨酸。所得突变体命名为P450V78F/A82F/A328F。

上述突变体的获得方法为：以来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450-BM3单加氧酶野生酶BM3基因为模板，利用含有突变位点的突变引物(选取需要突变的氨基酸位点上下游各15～20bp的一段碱基序列，将突变位点的碱基替换为突变后的氨基酸密码子，作为PCR正向引物；选取需要突变的氨基酸位点上(下)游150bp左右的一段碱基序列作为PCR反向引物)构建定点饱和突变库，对所得到的突变基因库进行高通量筛选，得到对苯或苯酚催化活力提高的突变体P450V78F，P450A82F和P450A328F；分别以这三个突变体基因为模板，以同样的方法PCR扩增出组合双突变体和三突变体。

再者，本发明还提供了一种比酶活提高的细胞色素P450BM3单加氧酶突变体的编码基因，该基因编码突变体P450V78F、P450A82F、P450A328F、P450V78F/A82F、P450V78F/A328F、P450A82F/A328F或P450V78F/A82F/A328F。

进一步地，本发明还提供了包含上述编码基因的重组表达载体，以及包含该重组表达载体的重组表达转化体。

需要说明的是，所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将发明上述任一种突变后的编码基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的细胞色素P450BM3单加氧酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pRSFDuet-1质粒。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pRSFDuet-1分别用限制性内切酶BamHⅠ和PacⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的细胞色素P450单加氧酶基因的重组表达质粒。所述重组表达转化体可通过本领域常规技术，将上述重组表达载体转化至相应宿主细胞中获得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所编码的细胞色素P450BM3单加氧酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌BL21(DE3)。

再进一步地，本发明还提供了一种细胞色素P450BM3单加氧酶突变体的制备方法，该方法包括培养上述的重组表达转化体，并由培养物中收集细胞色素P450BM3单加氧酶突变体，比如P450V78F、P450A82F、P450A328F、P450V78F/A82F、P450V78F/A328F、P450A82F/A328F或P450V78F/A82F/A328F。

最后，本发明还提供了一种酶法转化制备对苯二酚的方法，该方法选自如下任一种：

(1)使用上述的细胞色素P450BM3单加氧酶突变体作为催化剂，催化苯或苯酚进行选择性羟基化反应，制备对苯二酚；

(2)使用上述的重组表达转化体直接作为催化剂，催化苯或苯酚进行选择性羟基化反应，制备对苯二酚。

上述酶法转化制备对苯二酚的方法中，对苯二酚的分离、精制步骤为：将反应液离心取上清，使用有机溶剂萃取，萃取液洗涤、干燥、纯化后浓缩结晶，获得精制的对苯二酚纯品。

本发明的进步性和优点在于：与野生型的细胞色素P450BM3单加氧酶相比，本发明中的P450BM3突变体具有更高的催化活性，同时具有很好的对位羟基化的区域选择性。由于比酶活及催化选择性显著提高，因此在使用本发明的P450BM3突变体催化制备对苯二酚HQ时，具有酶用量少，酶制剂成本低，反应时间短，产品收率和纯度高的显著优势，可大幅度降低对苯二酚的生产成本，具有很强的工业应用潜力。

附图说明

图1为细胞色素P450-BM3单加氧酶野生型和七种突变体纯化的SDS-PAGE电泳效果图谱。M：蛋白分子量标准；1：3mM P450BM3WT；2：5mM P450BM3V78F；3：3.1mM P450BM3A82F；4：3.5mM P450BM3A328F；5：5mM P450BM3 V78F A82F；6：1.7mM P450BM3A82F/A328F；7：2mMP450BM3 V78F/A328F；8：3.7mM P450BM3A82F/V78F/A328F。

图2为P450BM3突变体P450A82F/A328F催化苯合成对苯二酚的HPLC分析；其中P为苯酚，H为对苯二酚。

图3为P450BM3突变体P450A82F/A328F催化苯酚合成对苯二酚的HPLC分析；其中P为苯酚，H为对苯二酚。

图4为产物对苯二酚的GC/MS分析图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征做进一步的描述，所列举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。另外，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：细胞色素P450-BM3单加氧酶的定点突变

利用大引物PCR诱变技术对野生型细胞色素P450-BM3单加氧酶的基因(基因序列如SEQ ID NO.2所示)进行定点诱变。

以突变第328位氨基酸为例，先针对突变位点设计一对引物。

使用的引物为：

上游引物：5’-CTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTC-3’，

下游引物：5’-CGCAGGaaaAGTTGGCCATAAGCGCAGC-3’，其中下划线所示序列为突变位点。

PCR体系(20μL)为：模板0.5～20ng，一对突变引物各1μL(10μM)，10μL Prime STARMax DNA聚合酶，加灭菌蒸馏水至20μL。

PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸50sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。

扩增得到的PCR产物用0.7％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察到了一条与P450-BM3基因长度相当的两条带，由此判断编码目的突变体的基因已被扩增出来，故直接往PCR产物中加入限制性内切酶DpnI，37℃消化6～8h后转化E.coliDH5ɑ感受态细胞，并均匀涂布至含有50μl/mg卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆至3mL含有50μl/mg卡那霉素的LB液体培养基进行培养，然后送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。测序结果用SnapGene软件与P450-BM3单加氧酶序列进行比对，328位突变为苯丙氨酸。得到的突变体命名为P450A328F。

其他定点突变方法与突变第328位氨基酸所用的方法一致。

其中突变第78位氨基酸使用的引物为：

上游引物：5’-GCTTAAATTTTTTCGTGATTTTGCAGGAGACG-3’，其中下划线所示序列为突变位点，

下游引物：5’-CGCATGATAGCCTTTCATTGCCTG-3’。

突变第82位氨基酸使用的引物为：

上游引物：5’-CGTGATTTTTTCGGAGACGGGTTATTTACAAG-3’，其中下划线所示序列为突变位点，

下游引物：5’-CGCATGATAGCCTTTCATTGCCTG-3’。

实施例2：细胞色素P450-BM3单加氧酶突变体的表达、纯化和酶活性测定

将实施例1中所得细胞色素P450-BM3单加氧酶突变体的表达菌株接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中，37℃振荡培养过夜，取500μL菌液接入装有200mL TB培养基(蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油0.4％，KH₂PO₄2.31g/L,K₂HPO₄12.54g/L)的500mL三角瓶中，置于37℃、220rpm摇床振荡培养，当培养液的吸光度OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为25℃，诱导14～20个小时后，将培养液离心，收集细胞，并用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤两次，得静息细胞。再将所得的静息细胞悬浮于50mL0.1M的磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，在冰水浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组酶的粗酶液。

实施例3：细胞色素P450-BM3单加氧酶的组合突变

在单点饱和突变获得突变点V78F、A82F和A328F的基础上，分别将V78F、A82F和A328F这三个突变位点进行组合，进一步得到组合突变体P450V78F/A82F、P450V78F/A328F、P450A82F/A328F和P450V78F/A82F/A328F。

将含有组合突变重组表达质粒的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L)中，37℃振荡培养过夜，取500μL菌液接入装有200mL TB培养基(蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油0.4％，KH₂PO₄2.31g/L,K₂HPO₄12.54g/L)的500mL三角瓶中，置于37℃、220rpm摇床振荡培养，当培养液的吸光度OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为25℃，诱导14～20个小时。培养液6000rpm离心3min，收集细胞，并用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤两次，得静息细胞。再将所得的静息细胞悬浮于50mL0.1M的磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，在冰水浴中超声破碎，离心收集上清液，即得到细胞色素P450-BM3单加氧酶组合突变体的粗酶液。

实施例4：细胞色素P450-BM3单加氧酶的纯酶制备

对实施例3中得到的粗酶进行纯化，具体方法如下：纯化所用的镍柱(柱体积3mL)预先用缓冲液A(50mM磷酸钾缓冲液，500mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)平衡，待平衡后上样，用5倍柱体积(15mL)的结合液洗脱亲和柱中的未结合蛋白，再用20倍柱体积(100mL)的缓冲液B(50mM磷酸钾缓冲液，500mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)进行梯度洗脱。收集含目的蛋白的洗脱液，透析过夜去除其中的咪唑。然后用截留分子量为50kDa的超滤管离心进行蛋白浓缩至2mL左右，分装后于-80℃环境中长期保存，备用。

用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测收集到的蛋白样品。取40μL样品加入10μL 5×SDS上样缓冲液进行处理，上样量均为10μL，三色预染蛋白分子量标准(10-180kDa)购于上海翊圣生物科技有限公司。SDS-PAGE胶浓度为12％，选用20mA电流进行电泳。结果表明通过上述方法纯化获得高纯度的突变体蛋白，分子量大小在110kDa左右(见图1)。

通过检测340nm处吸光值变化的方式对纯酶进行P450酶活力测定，具体方法如下：于1mL反应体系(0.1M的磷酸钾缓冲液，pH8.0)中加入终浓度为10mM的底物苯酚，终浓度为5mM的NADPH，30℃保温10min后迅速加等体积甲醇混匀，终止反应，采用紫外分光光度计检测340nm处吸光值的变化，采用HPLC检测反应的转化速率，色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱，流动相为：甲醇/超纯水(0.1％TFA)＝45：55，流速0.5mL/min，紫外检测，检测波长为220nm。结果见表1，组合突变体纯酶活力提高显著，特别是组合突变体P450A82F/A328F。

表1突变体与野生型细胞色素P450-BM3单加氧酶对苯酚的纯酶活力比较

实施例6-13：P450BM3及其突变体催化苯酚合成HQ

将含有组合突变重组表达质粒的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中，37℃振荡培养过夜，取500μL菌液接入装有200mL TB培养基(蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油0.4％，KH₂PO₄2.31g/L,K₂HPO₄12.54g/L)的500mL三角瓶中，置于37℃、220rpm摇床振荡培养，当培养液的吸光度OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为25℃，诱导14～16个小时。培养液6000rpm离心3min，收集细胞，并用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤两次，得静息细胞。再将所得的静息细胞悬浮于一定体积的0.1M的磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，使得溶液在600nm处的吸光度为20。

100mL三角瓶中依次加入4mLOD₆₀₀＝20的湿细胞，0.2g葡萄糖，80μL0.5M苯酚，30℃，200rpm反应，反应5h时分别取样。反应液用甲醇稀释10倍，高速离心3min，取上清，用0.22μm的滤膜过滤至进样瓶中，采用HPLC检测反应的转化速率和产物分布。色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱，流动相为：甲醇/超纯水(0.1％TFA)＝45:55，流速0.5ml/min，紫外检测，检测波长为220nm。

表2 P450BM3突变体催化苯酚合成HQ

结果如表2，反应5h后，E.coli(P450V78F/A82F/A328F)对底物的转化率为84.51％，E.coli(P450A82F/A328F)对底物的转化率已经达到了99.19％(图3)，两种突变体都有极高的催化选择性，催化苯酚生成的对位产物HQ均占总产物的98％以上。结果表明，两个突变体催化合成HQ的效果均显著高于野生型P450BM3，其中突变体P450A82F/A328F的催化效果更好。

实施例14-15：P450BM3突变体催化苯合成HQ

100mL磨口三角瓶中依次加入4mLOD₆₀₀＝20的湿细胞，0.2g葡萄糖，3.58μL苯溶液，30℃，200rpm反应。反应5h时，将反应瓶移至4℃冰箱放置10min左右，加入相同体积(4mL)的甲醇溶液，振荡使之混合均匀，取1mL离心取上清，再用甲醇稀释1倍，采用HPLC检测反应的转化速率和产物分布。色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱，检测苯的残余量：流动相为：甲醇/超纯水(0.1％TFA)＝70：30，流速1ml/min，紫外检测，检测波长为254nm。检测产物分布：样品再用甲醇稀释5倍，流动相为：甲醇/超纯水(0.1％TFA)＝45：55，流速0.5ml/min，紫外检测，检测波长为220nm。

表3 P450BM3突变体催化苯合成HQ

结果如表3，反应5h后，E.coli(P450V78F/A82F/A328F)对底物的转化率为91.45％，E.coli(P450A82F/A328F)对底物的转化率为96.75％(图2)，两种突变体都有极高的催化选择性，催化苯酚生成的对位产物HQ均占总产物的93％以上，且中间产物苯酚的含量也均不超过6％，其中突变体P450A82F/A328F的催化效果更好。

实施例16：P450A82F/A328F催化苯酚制备HQ

准备四个500mL三角瓶，每个三角瓶中分别加入49mLOD₆₀₀＝40的E.coli(P450A82F/A328F)湿细胞，5g葡萄糖，1mL0.5M苯酚，30℃，220rpm反应。反应过程中每间隔半小时采用HPLC检测苯酚残余量，色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱，流动相为：甲醇/超纯水(0.1％TFA)＝45:55，流速0.5ml/min，紫外检测，检测波长为220nm。反应大约2.5h时，苯酚几乎完全被消耗完，将反应瓶取出，反应液8000rpm离心3min除去细胞，用等体积的乙酸乙酯萃取四次，萃取液中加入无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发至2mL左右除去多余的溶剂。

配层析液：石油醚：乙酸乙酯＝3:1，取适量硅胶粉至玻璃烧杯中，加入适量层析液，搅拌均匀后倒入层析柱中，待硅胶严实且上表面平整后打开层析柱阀门，待多余层析液流出后关闭阀门，将旋蒸后的样品液加入层析柱中，然后加入适量无水硫酸钠固体，倒入层析液，等待样品分离。打开阀门使液体流入玻璃小管中，用薄层层析分析样品成分，将不含底物苯酚的流出液旋转蒸发除去溶剂，得到0.168g白色固体，纯度高于99％(图4)。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种P450BM3突变体及其在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1048

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 1

Ala Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn

1 5 10 15

Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile

20 25 30

Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val

35 40 45

Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu

50 55 60

Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp

65 70 75 80

Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp

85 90 95

Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met

100 105 110

Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp

130 135 140

Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr

145 150 155 160

Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser

165 170 175

Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn

180 185 190

Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp

195 200 205

Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys

210 215 220

Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr

245 250 255

Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu

260 265 270

Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln

275 280 285

Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser

290 295 300

Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu

305 310 315 320

Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys

325 330 335

Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu

340 345 350

Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly

355 360 365

Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala

370 375 380

Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys

385 390 395 400

Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met

405 410 415

Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp

420 425 430

Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala

435 440 445

Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu

450 455 460

Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr

465 470 475 480

Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr

485 490 495

Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln

500 505 510

Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala

515 520 525

Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala

530 535 540

Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys

545 550 555 560

Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr

565 570 575

Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys

580 585 590

Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp

595 600 605

Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val

610 615 620

Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser

625 630 635 640

Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala

645 650 655

Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu

660 665 670

Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu

675 680 685

Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro

690 695 700

Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu

705 710 715 720

Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala

725 730 735

His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr

740 745 750

Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala

755 760 765

Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu

770 775 780

Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met

785 790 795 800

Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu

805 810 815

Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser

820 825 830

Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val

835 840 845

Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala

850 855 860

Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe

865 870 875 880

Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr

885 890 895

Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly

900 905 910

Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly

915 920 925

Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu

930 935 940

Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu

945 950 955 960

His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln

965 970 975

His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln

980 985 990

Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro Ala

995 1000 1005

Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val Ser

1010 1015 1020

Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg

1025 1030 1035 1040

Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly

1045

<210> 2

<211> 3147

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 2

gcaattaaag aaatgcctca gccaaaaacg tttggagagc ttaaaaattt accgttatta 60

aacacagata aaccggttca agctttgatg aaaattgcgg atgaattagg agaaatcttt 120

aaattcgagg cgcctggtcg tgtaacgcgc tacttatcaa gtcagcgtct aattaaagaa 180

gcatgcgatg aatcacgctt tgataaaaac ttaagtcaag cgcttaaatt tgtacgtgat 240

tttgcaggag acgggttatt tacaagctgg acgcatgaaa aaaattggaa aaaagcgcat 300

aatatcttac ttccaagctt cagtcagcag gcaatgaaag gctatcatgc gatgatggtc 360

gatatcgccg tgcagcttgt tcaaaagtgg gagcgtctaa atgcagatga gcatattgaa 420

gtaccggaag acatgacacg tttaacgctt gatacaattg gtctttgcgg ctttaactat 480

cgctttaaca gcttttaccg agatcagcct catccattta ttacaagtat ggtccgtgca 540

ctggatgaag caatgaacaa gctgcagcga gcaaatccag acgacccagc ttatgatgaa 600

aacaagcgcc agtttcaaga agatatcaag gtgatgaacg acctagtaga taaaattatt 660

gcagatcgca aagcaagcgg tgaacaaagc gatgatttat taacgcatat gctaaacgga 720

aaagatccag aaacgggtga gccgcttgat gacgagaaca ttcgctatca aattattaca 780

ttcttaattg cgggacacga aacaacaagt ggtcttttat catttgcgct gtatttctta 840

gtgaaaaatc cacatgtatt acaaaaagca gcagaagaag cagcacgagt tctagtagat 900

cctgttccaa gctacaaaca agtcaaacag cttaaatatg tcggcatggt cttaaacgaa 960

gcgctgcgct tatggccaac tgctcctgcg ttttccctat atgcaaaaga agatacggtg 1020

cttggaggag aatatccttt agaaaaaggc gacgaactaa tggttctgat tcctcagctt 1080

caccgtgata aaacaatttg gggagacgat gtggaagagt tccgtccaga gcgttttgaa 1140

aatccaagtg cgattccgca gcatgcgttt aaaccgtttg gaaacggtca gcgtgcgtgt 1200

atcggtcagc agttcgctct tcatgaagca acgctggtac ttggtatgat gctaaaacac 1260

tttgactttg aagatcatac aaactacgag ctggatatta aagaaacttt aacgttaaaa 1320

cctgaaggct ttgtggtaaa agcaaaatcg aaaaaaattc cgcttggcgg tattccttca 1380

cctagcactg aacagtctgc taaaaaagta cgcaaaaagg cagaaaacgc tcataatacg 1440

ccgctgcttg tgctatacgg ttcaaatatg ggaacagctg aaggaacggc gcgtgattta 1500

gcagatattg caatgagcaa aggatttgca ccgcaggtcg caacgcttga ttcacacgcc 1560

ggaaatcttc cgcgcgaagg agctgtatta attgtaacgg cgtcttataa cggtcatccg 1620

cctgataacg caaagcaatt tgtcgactgg ttagaccaag cgtctgctga tgaagtaaaa 1680

ggcgttcgct actccgtatt tggatgcggc gataaaaact gggctactac gtatcaaaaa 1740

gtgcctgctt ttatcgatga aacgcttgcc gctaaagggg cagaaaacat cgctgaccgc 1800

ggtgaagcag atgcaagcga cgactttgaa ggcacatatg aagaatggcg tgaacatatg 1860

tggagtgacg tagcagccta ctttaacctc gacattgaaa acagtgaaga taataaatct 1920

actctttcac ttcaatttgt cgacagcgcc gcggatatgc cgcttgcgaa aatgcacggt 1980

gcgttttcaa cgaacgtcgt agcaagcaaa gaacttcaac agccaggcag tgcacgaagc 2040

acgcgacatc ttgaaattga acttccaaaa gaagcttctt atcaagaagg agatcattta 2100

ggtgttattc ctcgcaacta tgaaggaata gtaaaccgtg taacagcaag gttcggccta 2160

gatgcatcac agcaaatccg tctggaagca gaagaagaaa aattagctca tttgccactc 2220

gctaaaacag tatccgtaga agagcttctg caatacgtgg agcttcaaga tcctgttacg 2280

cgcacgcagc ttcgcgcaat ggctgctaaa acggtctgcc cgccgcataa agtagagctt 2340

gaagccttgc ttgaaaagca agcctacaaa gaacaagtgc tggcaaaacg tttaacaatg 2400

cttgaactgc ttgaaaaata cccggcgtgt gaaatgaaat tcagcgaatt tatcgccctt 2460

ctgccaagca tacgcccgcg ctattactcg atttcttcat cacctcgtgt cgatgaaaaa 2520

caagcaagca tcacggtcag cgttgtctca ggagaagcgt ggagcggata tggagaatat 2580

aaaggaattg cgtcgaacta tcttgccgag ctgcaagaag gagatacgat tacgtgcttt 2640

atttccacac cgcagtcaga atttacgctg ccaaaagacc ctgaaacgcc gcttatcatg 2700

gtcggaccgg gaacaggcgt cgcgccgttt agaggctttg tgcaggcgcg caaacagcta 2760

aaagaacaag gacagtcact tggagaagca catttatact tcggctgccg ttcacctcat 2820

gaagactatc tgtatcaaga agagcttgaa aacgcccaaa gcgaaggcat cattacgctt 2880

cataccgctt tttctcgcat gccaaatcag ccgaaaacat acgttcagca cgtaatggaa 2940

caagacggca agaaattgat tgaacttctt gatcaaggag cgcacttcta tatttgcgga 3000

gacggaagcc aaatggcacc tgccgttgaa gcaacgctta tgaaaagcta tgctgacgtt 3060

caccaagtga gtgaagcaga cgctcgctta tggctgcagc agctagaaga aaaaggccga 3120

tacgcaaaag acgtgtgggc tgggtaa 3147

Claims

1.一种突变位点突变为苯丙氨酸在提高细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活及催化选择性中的应用，所述的比酶活是细胞色素P450BM3单加氧酶催化苯一锅法合成对苯二酚的活性或/和以苯酚为底物合成对苯二酚的活性，所述的催化选择性是底物苯或苯酚的对位选择性羟基化；

所述的突变位点位于野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的如下氨基酸处：（1）第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；或（2）第78位缬氨酸、第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处。

2.一种细胞色素P450BM3单加氧酶突变体在以苯为底物一锅两步法或以苯酚为底物一步法合成对苯二酚中的应用；所述的细胞色素P450BM3单加氧酶突变体选自如下任一种：

（1）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第82位的丙氨酸残基和第328位的丙氨酸残基同时突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450A82F/A328F；

（2）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第78位的缬氨酸残基、第82位的丙氨酸残基以及第328位的丙氨酸残基都同时突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450V78F/A82F/A328F。