CN113388589B - 一种细胞色素p450单加氧酶cyp109b2突变体及其应用 - Google Patents

一种细胞色素p450单加氧酶cyp109b2突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用，其中所述CYP109B2突变体包括：在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第68位、第70位、第84位、第85位、第240位、第241位、第245位、第288位、第291位、第292位、第294位、第387位或第388位中具有至少一个氨基酸突变。本发明从Bacillus sonorensis中发现了一个可对甾体化合物16β位进行羟基化修饰的细胞色素P450单加氧酶CYP109B2，在此基础上对该P450酶的关键活性位点进行突变，构建突变体库，并筛选得到了一系列催化活性显著提高和/或选择性位点发生改变的突变体，这为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了新的资源，且催化效率显著提高、生产过程经济环保。

Description

一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物催化酶技术领域，具体涉及一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用。
背景技术
甾体类(激素)化合物通常都具有环戊烷多氢菲的基本母核骨架的生物活性化合物，甾体类激素在生物机体内广泛参与新陈代谢合成，对生物的生命活动起着非常重要的调节作用。而甾体类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，在临床上广泛用于治疗心血管、风湿、炎症、内分泌失调和抗肿瘤等疾病。目前，甾体类药物是市场上仅次于抗生素的第二大类药物。
对甾体化合物的四个环进行化学修饰能赋予甾体类药物更强的生理和药理活性，且不同位置碳原子的化学修饰产物也会表现出不同的药理活性。相比于甾体底物而言，甾体母核上非活泼碳的羟基化修饰不仅能够通过改变甾体药物本身的极性来增强其生理和药理活性，而且还为甾体药物中间体的进一步衍生修饰提供更广阔的改造空间。如通过特异性羟基化修饰可以得到治疗风湿、哮喘和脑水肿的地塞米松(dexamethasone)，具有抗炎特效的氢化可的松(hydrocortisone)，合成避孕药的重要中间体11α-羟基孕酮(11α-hydroxylated progesterone)以及具有增加糖皮质激素活性的功能的16α-羟基化的类固醇(16α-hydroxylated steroids)等等。甾体分子结构的复杂性决定了甾体母核功能化的多样性，将近20个甚至更多的羟基化位点为甾体类化合物的定点修饰带来了巨大挑战。
生物催化法可以选择性地在惰性C-H键之间引入氧原子，实现羟基化甾醇的一步合成，利用生物催化法合成羟基化甾体表现出传统化学合成方法所不具备的选择性高、环境污染小以及反应条件温和等巨大优势，因此日益成为国际公认的合成高附加值化学品最具潜力的方案。细胞色素P450单加氧酶作为已报道的甾体羟基化酶的主体，为甾体药物的绿色合成提供了重要的开发资源，而对细胞色素P450单加氧酶的结构进行改造，实现一系列羟基化甾醇的高效合成，促进甾体类药物工业化生产具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用，本发明从索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis中发现了一个可以对甾体化合物的16β位进行高效选择性的羟基化修饰的新的细胞色素P450单加氧酶CYP109B2蛋白酶，在此基础上对该蛋白酶的关键活性位点进行突变，构建了突变体库，并筛选得到了一系列催化活性显著提高和/或选择性位点发生改变的多种突变体，这为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了新的资源，且催化效率显著提高、生产过程经济环保。
本发明的目的之一在于提供一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体，所述CYP109B2突变体包括：在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第68位、第70位、第84位、第85位、第240位、第241位、第245位、第288位、第291位、第292位、第294位、第387位或第388位中具有至少一个氨基酸突变。
进一步的，所述突变体为单一位点的点突变，所述点突变包括：F70W、F70Y、S85G、S85L、S85M、S85R、L240V、A241H、T245C、I291A、I291C、I291G、I291L、I291M、I291N、I291S、V292A、V292C、V292F、V292G、V292L、V292M、V292N、F294C、F294G、F294T、F294P、F294I、S387F和S387H。
进一步的，所述突变体包括：包含L240V突变位点在内的至少两个位点的突变体。
进一步的，所述突变体包括：包含L240V突变位点以及第84位、第85位、第288位、第291位、第292位、第387位或第388位中至少一个突变位点的突变体。
进一步的，所述突变体包括：包含L240V突变位点以及V84I、V84L、V84N、V84Y、S85V、S85W、S85Y、I291A、I291G、I291M、F294I、S387F、S387Q中至少一个突变位点的突变体。
进一步的，所述突变体包括：L240V/I291A(即同时包含L240V和I291A突变位点的突变体)，L240V/F294I，L240V/S387F，L240V/S387F/I291A，L240V/S387F/F294I，L240V/V84L/S387F，L240V/V84L/S387F/I291T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F/F294I。
进一步的，所述突变体为组合突变体，包括：F79A/V292P，V84I/S85M，V84L/S85M，V84F/I291T，S85M/I291A，S85M/S387H，S85L/292L，F70M/V292C，L240V/V84I，L240V/V84L，L240V/V84N，L240V/V84Y，L240V/S85F，L240V/S85L，L240V/S85V，L240V/S85W，L240V/S85Y，L240V/I291A，L240V/I291G，L240V/I291M，L240V/F294I，L240V/S387F，L240V/S387Q，L240V/F70Y，S387F/F70Y，V292R/S387F，A73Q/S387F/L170T，F70Y/S387F/I291A，V84F/I291T/A288F，V84F/I291T/V292F，V84F/I291T/S387F，V84F/I291T/F294I，L240V/S387F/Y175I，L240V/S387F/Y175K，L240V/S387F/Y175Q，L240V/S387F/Y175S，L240V/S387F/Y175T，L240V/S387F/I291A，L240V/S387F/V292R，L240V/S387F/F294C，L240V/S387F/F294G，L240V/S387F/F294V，L240V/S387F/F294P，L240V/S387F/F294T，L240V/S387F/F294I，L240V/S387F/N385G，L240V/V84I/S85N，L240V/I291A/F70Y，L240V/I291A/Y175S，L240V/V84L/F294I，L240V/V84L/Y175S，L240V/S85L/F294I，L240V/V84L/S387F，L240V/F294I/F79I，L240V/V84F/I291T/S387F，L240V/S85L/F294I/F70Y，L240V/S85L/F294I/Y175S，L240V/S85L/F294I/S387F，L240V/S387F/F294I/F70Y，L240V/S387F/F294I/Y175S，L240V/V84L/F294I/Y175S，L240V/V84L/I291A/Y175S，L240V/V84L/F294I/F70Y，L240V/V84F/S387F/I291T，L240V/V84L/S387F/I291T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292A，L240V/V84L/S387F/I291T/V292H，L240V/V84L/S387F/I291T/V292K，L240V/V84L/S387F/I291T/V292I，L240V/V84L/S387F/I291T/V292M，L240V/V84L/S387F/I291T/V292N，L240V/V84L/S387F/I291T/V292P，L240V/V84L/S387F/I291T/V292T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292Y，L240V/V84L/S387F/I291T/V292Q，L240V/V84L/S387F/I291T/V292L，L240V/V84L/S387F/I291T/V292G，L240V/V84L/S387F/I291T/V292C，L240V/V84L/S387F/I291T/A288N，L240V/V84L/S387F/I291T/A288L，L240V/V84L/S387F/I291T/A288G，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M388L，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/S85T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/S85W，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/S85N，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F/F294I。
本发明的目的之二在于提供了一种载体，所述载体中包含编码上述CYP109B2突变体的基因。
进一步的，所述载体上还包含：氧化还原伴侣蛋白的基因和/或P450单加氧酶氧化还原结构域基因。
进一步的，所述氧化还原伴侣蛋白为铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白。
进一步的，所述铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白为：来源于聚球藻Synechococcuselongates PCC7942的细胞色素P450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白，或来源于菠菜E.C.1.18.1.2的细胞色素P450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白。
进一步的，所述P450单加氧酶氧化还原结构域为：来源于巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium的细胞色素P450单加氧酶P450-BM3的还原酶结构域；或来源于红球菌Rhodococcus sp.NCIMB 9784的细胞色素P450单加氧酶P450-RhF的还原酶结构域。
本发明的目的之三在于提供了一种遗传工程菌，所述遗传工程菌中包含如上述载体。
本发明的目的之四在于提供了上述CYP109B2突变体、或上述载体，或上述遗传工程菌在催化甾体化合物羟基化修饰中的应用。
进一步的，所述羟基化修饰为15β或16β羟基化修饰。
进一步的，所述甾体化合物包括：睾酮、去甲睾酮、勃地龙、甲基双烯醇酮、雄烯二酮、肾上腺酮、18-甲基双酮、49物和炔孕酮。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首先从索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis中分离得到了一个细胞色素P450单加氧酶CYP109B2蛋白酶，验证发现该CYP109B2蛋白酶能够对甾体化合物的16β位进行高效选择性的羟基化修饰，在此基础上，发明人进一步对所述CYP109B2蛋白酶的13个关键活性位点进行单点饱和突变和简并引物突变，分别获得了13个位点的单点全突变体库，然后对突变酶的活性和选择性进行筛选得到了一系列催化活性显著提高的单点突变突变体。更进一步的，进行迭代饱和突变获得了一系列活性显著提高和/或催化选择性发生变化的组合突变体。这为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了更多资源，促进了甾体类药物的工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中CYP109B2催化睾酮转化后的HPLC色谱图；
图2为本发明实施例1中CYP109B2对多种不同甾体化合物的催化验证；
图3为本发明实施例2中CYP109B2活性口袋中活性氨基酸位点；
图4为本发明实施例2中CYP109B2突变体库的构建流程图；
图5为本发明实施例3中CYP109B2活性氨基酸位点的全饱和突变体催化热点图；
图6为本发明实施例3中单点突变得到的突变体与野生型CYP109B2对于睾酮的羟基化催化活性；
图7为本发明实施例4中野生型CYP109B2及多种突变体、组合突变体催化睾酮的动力学曲线；
图8为本发明实施例4中野生型CYP109B2及多种突变体、组合突变体的催化活性和催化选择性；
图9为本发明实施例4中野生型CYP109B2及其7突变体VLFTSFI催化多种甾体底物的液相图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1细胞色素P450单加氧酶CYP109B2的获得与活性验证
1、CYP109B2基因克隆
在海水2216琼脂平板培养基上采用本领域常规方法培养索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)，然后利用本领域常规方法提取Bacillus sonorensis的基因组，并以此为模板，进行常规PCR扩增获得目的基因，所用引物为：
CYP109B2-F：ATGAACTCGGCAAAACAGCAGAAC(SEQ ID NO:3所示)
CYP109B2-R：TCATGATGAAAGCAGCGCCTCTTTG(SEQ ID NO:4所示)
扩增产物进行电泳检测并测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。由于该酶与已报道的CYP109家族的CYP109B1氨基酸序列同源性达61.9％，由此确认了新型P450单加氧酶是细胞色素单加氧酶CYP109B亚家族的一员，将该蛋白酶命名为CYP109B2。
2、CYP109B2的异源表达和功能验证
(1)CYP109B2重组质粒构建(pRSFDuet-1-CYP109B2)
采用引物：pRSFDute-1-F1:GCGGCCGCATAATGCTTAAG；
pRSFDute-1-R1:AAGCTTGTCGACCTGCAGGC；对质粒pRSFDuer-1进行扩增获得线性化载体片段pRSFDuer-1，然后通过常规方法将该片段与如SEQ ID NO:2所示的CYP109B2基因连接在一起，转化后测序验证得到正确重组子pRSFDuet-1-CYP109B2。
(2)氧化还原伴侣重组质粒(pETDuet-1-Fdr_0978-Fdx_1499)构建
CYP109B2在大肠杆菌中发挥其催化活性时，需氧化还原伴侣蛋白酶或氧化还原结构域进行电子传递。可采用本领域的常规氧化还原伴侣蛋白酶或氧化还原结构域。现以来源于聚球藻Synechococcus elongates PCC7942的细胞色素P450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白酶：铁氧还蛋白还原酶Synpcc7942_0978(Fdr_0978)和铁氧还蛋白Synpcc7942_1499(Fdx_1499)为例，构建相应的重组质粒。
采用引物：pETDuet-F:GCCTGCAGGTCGACAAGCTT；
pETDuet-R:GCGCCGAGCTCGAATTCG；对质粒pETDuet-1进行扩增获得线性化载体片段pETDuet-1，然后通过常规方法将该线性化载体片段与Fdr_0978基因以及Fdx_1499基因连接在一起，转化后测序验证得到正确重组子pETDuet-1-Fdr_0978-Fdx_1499。
(3)重组质粒pRSFDuet-1-CYP109B2-Fdr_0978-Fdx_1499构建
采用引物：pRSFDute-1-F2:GGCCGGCCACGCGATCGCT；
pRSFDute-1-R2:GATATCCAATTGAGATCTGCCATATGTATATCTCCT；
通过常规方法对质粒pRSFDuet-1-CYP109B2进行扩增，获得线性化载体片段pRSFDuet-1-CYP109B2。
然后采用引物：
(pRSFDuet)-Fdr_0978-F1:TCTCAATTGGATATCATGTTGAATGCGAGTGTGGCTG；
(pRSFDuet)-Fdx_1499-R1:ATCGCGTGGCCGGCCCTAGTAGAGGTCTTCTTCTTTGTGGGTTTCG
通过常规方法对质粒pETDuet-1-Fdr_0978-Fdx_1499进行扩增，获得目的片段Fdr_0978-rbs-Fdx_1499。接着采用常规方法将目的片段Fdr_0978-rbs-Fdx_1499与线性化载体片段pRSFDuet-1-CYP109B2连接构建得到重组质粒pRSFDuet-1-CYP109B2-Fdr_0978-Fdx_1499。
(4)蛋白质表达和功能验证
将上述重组质粒pRSFDuet-1-CYP109B2-Fdr_0978-Fdx_1499转化至大肠杆菌细胞中得到重组细胞E.coli(pRSFDuet-1-CYP109B2-Fdr_0978_Fdx_1499)，采用本领域常规方法诱导目的蛋白的表达。接着收集菌体，用液氮速冻细胞(增强细胞膜通透性，促进底物进入细胞)，室温冻融后用于甾醇转化。
分别以睾酮、去甲睾酮、勃地龙、孕酮、甲基双烯醇酮、雄烯二酮、肾上腺酮、18-甲基双酮、49物、炔孕酮、坎利酮、泼尼松龙、孕烯醇酮和雌二醇等14种甾体化合物为底物，验证CYP109B2对于甾体化合物的催化能力(方法同上“细菌对于甾体化合物的转化”)，分离不同的反应产物，用核磁分析分离得到的产物，通过核磁碳谱和核磁氢谱及底物结构确定反应产物的分子结构。其中CYP109B2催化睾酮转化后的HPLC色谱图如图1所示，对不同底物的催化结果如图2所示。结果显示，CYP109B2蛋白酶对包括睾酮、去甲睾酮、勃地龙和甲基双烯醇酮等部分甾体化合物具有高效的16β羟基化作用，并且对雄烯二酮、肾上腺酮、18-甲基双酮、49物和炔孕酮等甾体底物也同样具备相对高效的催化作用，其中对雄烯二酮、18-甲基双酮、49物的转化率>99％，对肾上腺酮、炔孕酮的转化率>50％。然而CYP109B2对一些侧链比较大的甾体底物，如孕酮、坎利酮、泼尼松龙、孕烯醇酮和雌二醇未表现出催化活性，说明侧链大的甾体底物进入CYP109B2蛋白酶的活性口袋比较困难。
实施例2CYP109B2蛋白酶突变体库的构建
1、突变位点的确定
利用CYP109B2蛋白同源结构，分析CYP109B2活性口袋的形状及底物睾酮与酶分子口袋的绑定形式，并通过科研作图工具ChemBioDraw Ultra 14.0绘制甾体底物睾酮的分子结构，利用蛋白质晶体结构分析软件YASARA将能量最小化的睾酮3D分子结构与得到的CYP109B2晶体结构进行分子动力学模拟(MD)和分子对接，选取底物睾酮分子周围
Figure BDA0003090447530000092
范围内的氨基酸位点，分别为如N68、F70、V84、S85、L240、A241、T245、A288、I291、V292、F294、S387和M388(即如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第68、70、84、85、240、241、245、288、291、292、294、387和388位)，其结构如图3所示。
2、13个位点的单点全饱和突变体库的构建
通过本领域常规的突变方法，利用两步大引物PCR突变技术对野生型CYP109B2酶的基因进行单点饱和突变和简并引物突变，分别获得13个位点的单点全饱和突变体库，并针对突变位点应用Saturation mutagenesis(SM)技术设计一系列突变引物，突变体库的构建流程图如图4所示，引物记录表如表1所示。
表1 CYP109B2活性口袋热点氨基酸全饱和突变体构建引物记录表
Figure BDA0003090447530000091
Figure BDA0003090447530000101
Figure BDA0003090447530000111
Figure BDA0003090447530000121
注：其中N代表A、T、C、G四种碱基的混合；K代表G、T两种碱基的混合；M代表A、C两种碱基的混合；V代表A、C、G三种碱基的混合；S代表C、G两种碱基的混合；Y代表C、T两种碱基的混合；D代表A、G、T三种碱基的混合；H代表A、C、T三种碱基的混合。
实施例3CYP109B2突变体的表达和酶活性鉴定
1、CYP109B2突变体的表达
将实施例2中单点饱和突变和简并引物突变得到的PCR产物用限制性核酸内切酶Dpn I进行模板消化处理后，利用本领域常规的转化方法将PCR产物转化进大肠杆菌BL21中并测序，待目标位点的氨基酸除野生型外的其他19中氨基酸突变体全部得到，说明该位点的氨基酸全突变体库完成。然后将突变后的核苷酸序列按照实施例2中，重组细胞E.coli(pRSFDuet-1-CYP109B2-Fdr_0978_Fdx_1499)的构建方法，使CYP109B2突变体表达。
2、催化活性和选择性测定
采用上述方法使不同的CYP109B2突变体表达后，按照实施例2中CYP109B2对于甾体化合物的催化能力的检测方法，以睾酮为例，检测不同突变体的催化活性和产物选择性(即催化位点的选择性)，并绘制得到活性氨基酸位点的全饱和突变体催化热点图，如图5所示，其中列出了关键氨基酸位点的所有氨基酸突变(纵列字母为各氨基酸缩写)，其中数据条表示催化甾体转化的活性(横排“Conv”为conversion缩写)，催化选择性主要以15β和16β羟基化产物的热点图表示。
结果显示，相较于野生型CYP109B2，其中突变体F70W(即第70位的氨基酸由F突变为W)、F70Y、S85G、S85L、S85M、S85R、L240V、A241H、T245C、I291A、I291C、I291G、I291L、I291M、I291N、I291S、V292A、V292C、V292F、V292G、V292L、V292M、V292N、F294C、F294G、F294T、F294P、F294I、S387F和S387H对于甾体羟基化的催化活性均提高了。特别的，其中突变体L240V、I291A、V292A、F294I和S387F与野生型的催化活性比较图如图6所示，即这5种单点突变体相比于野生型表现出显著更优的催化活性。
而相比于野生型，其中单点突变体L240V、F294I和S387F对于甾体羟基化催化位点的选择性均发生了变化，具体而言，催化羟基化的15β位选择性有所提高，16β位的选择性有所降低。
实施例4CYP109B2组合突变体的构建、表达和酶活性鉴定
1、CYP109B2组合突变体的构建和酶活测定
根据实施例3中鉴定的突变体酶活，通过迭代饱和突变得到多个组合突变体；并结合CYP109B2的保守性分析，在突变体L240V的基础上，对关键氨基酸位点V84、S85、A288、I291、V292、S387和S388进行迭代饱和突变，得到一系列催化活性提高或催化选择性变化的组合突变体，包括：F79A/V292P(即同时包含F79A和V292P突变位点的突变体)、V84I/S85M、V84L/S85M、V84F/I291T、S85M/I291A、S85M/S387H、S85L/292L、F70M/V292C、L240V/V84I、L240V/V84L、L240V/V84N、L240V/V84Y、L240V/S85F、L240V/S85L等共88个CYP109B2组合突变体。并以睾酮为模式甾体底物，测定这些组合突变体相较于野生型全细胞催化1mM睾酮反应1小时的催化活性倍数，统计结果如表2所示。
表2 CYP109B2组合突变体相比于野生型的催化活性倍数统计表
Figure BDA0003090447530000141
Figure BDA0003090447530000151
注：表中所列数据为全细胞催化1mM睾酮反应1小时统计的数据。
结果显示，表2中所列突变体相较于野生型CYP109B2催化睾酮转化的能力均有所提高。特别的，相比于野生型，其中组合突变体L240V/I291A、L240V/F294I、L240V/S387F、L240V/S387F/I291A、L240V/S387F/F294I、L240V/V84L/S387F、L240V/V84L/S387F/I291T、L240V/V84L/S387F/I291T/V292S、L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F和L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F/F294I不仅表现出更优的催化活性，并且还有显著的选择性改变。
2、CYP109B2及其突变体与睾酮反应的动力学参数测定
将CYP109B2及其突变体、组合突变体分别构建重组质粒并转化至大肠杆菌细胞中表达后，采用本领域常规的蛋白纯化方法对酶进行分离纯化。制备纯化的目的蛋白纯酶液用液氮速冻后保存于-80℃，后续备用。-80℃取出的纯酶液在冰上解冻后，用CO差谱分析，测定蛋白酶浓度。
将CYP109B2及其突变体、分离纯化的Fdr_0978蛋白和Fdx_1499蛋白，按照浓度比为1：4：20的比例配成蛋白混合液，并向蛋白混合液中加入终浓度为1mM的MgCl2、终浓度为5％的葡萄糖和甘油、终浓度为1U的葡萄糖脱氢酶(GDH)，充分混匀后分装于30个1.5mL的EP管中，在这30个EP管中分别加入稀释于二甲基亚砜浓度梯度为25～1000μM的睾酮底物，每个梯度设置三个平行样，于振荡金属浴上30℃，700rpm充分振荡混匀2min。在每个EP管中加入终浓度为1mM的NADP+起始反应,控制总反应体系为200μL(用磷酸钾缓冲液补足)，于振荡金属浴上30℃，700rpm充分振荡混匀反应5min后，迅速向各个EP管中加入等体积(200μL)的乙腈终止反应。1200rpm离心2min，用0.22μm的滤膜过滤处理，用于HPLC分析，检测底物反应情况，通过计算蛋白酶的反应速率与底物浓度的关系依据米氏方程测定CYP109B2及其突变体的动力学参数，并以此绘制动力学曲线。通过kcat/Km衡量突变体的催化活性。动力学参数统计结果如表3所示，动力学曲线如图7所示。
表3 CYP109B2及其突变体催化睾酮动力学参数统计表
Figure BDA0003090447530000161
Figure BDA0003090447530000171
注：VF:L240V/S387F、VI:L240V/F294I、VFA:L240V/S387F/F294I、VFLT:L240V/V84L/S387F/I291T、VLFTS:L240V/V84L/S387F/I291T/V292S、VLFTSF:L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F、VLFTSFI:L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F/F294I.(M：CYP109B2的突变体)
根据表3的结果，其中多种突变体和组合突变体的催化活性相比于野生型，都有一定程度的提高。进一步的，其中VFA和VFLT，即突变体L240V/S387F/F294I和L240V/V84L/S387F/I291T相比于野生型，其酶活性提高了近40多倍，即针对CYP109B2活性口袋中的关键氨基酸位点进行定向进化，成功得到催化睾酮活性显著提高的多种突变体。
3、催化选择性测定
根据产物的差异，统计不同突变体对于睾酮的催化选择性，统计结果如图8所示，其中WT:CYP109B2；M1:S387F；M2:L240V/F294I；M3:L240V/S387F/I291A；M4:L240V/V84L/S387F/I291T；M5:L240V/V84L/S387F/I291T/V292S；M6:L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F；M7:L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F/F294I。随着多轮组合突变和迭代饱和突变的进行，筛选得到的CYP109B2的组合突变体催化睾酮羟基化的选择性逐渐从16β位向15β位翻转。结果显示，野生型CYP109B2催化睾酮转化主要产生16β位羟基化睾酮，而其他突变体对于催化位点的选择性都有不同程度的变化，其中CYP109B2的7突变体L240V/S387F/V84L/I291T/V292S/M290F/F294I主要产生15β位羟基化睾酮，实现睾酮的15β位高效高选择性羟基化。即通过对CYP109B2进行定向进化，得到了对甾体化合物的催化活性显著提高和催化选择性明显改变的突变体。
4、其他甾体化合物的催化位点
以上述筛选得到的催化活性显著提高并且催化选择性明显改变的7突变体L240V/S387F/V84L/I291T/V292S/M290F/F294I，验证其对于其他甾体化合物的催化效果，结果如图9所示。
结果显示，所述7突变体L240V/S387F/V84L/I291T/V292S/M290F/F294I不仅可催化甾体底物睾酮(Testosterone)、还可催化其他甾体化合物，如：去甲睾酮(Nandrolone)、勃地龙(Boldenone)和甲基双烯醇酮(9(10)Dehydronandrolone)的羟基化，并且催化选择性均从野生型的16β位转向15β位，进一步证实了通过定向突变得到CYP109B2的7突变体VLFTSFI实现了催化甾体羟基化选择性的转变。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 405
<212> PRT
<213> 索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)
<400> 1
Met Asn Ser Ala Lys Gln Gln Asn Pro Ile Gln Lys Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
Gly Lys Asn Arg Gln Asp Pro Tyr Asp Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Lys
20 25 30
Met Arg Lys Glu Ser Pro Val Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Val Trp
35 40 45
Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Arg Val Ile Ser Asp Lys Asp
50 55 60
Phe Phe Ser Asn Gln Phe Pro Gln Leu Glu Ser Gly Asn Thr Phe Ala
65 70 75 80
Lys Thr Met Val Ser Met Asp Pro Pro Lys His Thr Arg Ile Arg Ser
85 90 95
Ile Val Ser Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ile Met Lys Glu Trp Glu Pro
100 105 110
Arg Ile Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Leu Gly Lys Ala Arg Gly Arg
115 120 125
Asp Glu Ile Asp Leu Val Gln Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Met
130 135 140
Val Ile Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Glu His Lys Glu Lys Phe
145 150 155 160
Lys Glu Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Leu Pro Lys Ser Ala Tyr Glu
165 170 175
Glu Asp Val Met Glu Trp Arg Thr Ile Arg Asn Lys Gly Glu Glu Asp
180 185 190
Leu Ser Ala Phe Phe Glu Asn Val Ile Glu Glu Lys Arg Arg Asn Leu
195 200 205
Gly Asp Asp Ile Ile Ser Leu Leu Ile Gln Ala Glu Glu Asp Gly Asp
210 215 220
Arg Leu Ser Pro Asp Glu Leu Val Pro Phe Cys Asn Leu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Met Val Tyr Ser
245 250 255
Ile Leu Glu Lys Pro Gly Thr Phe Asp Glu Leu Ala Asn Gln Pro Asp
260 265 270
Leu Ile Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Val Arg Phe Arg Ala Pro Ala
275 280 285
Pro Met Ile Val Arg Phe Val Gln Gln Asp Thr Ala Ile Arg Gly Val
290 295 300
Asn Leu Lys Lys Gly Glu Gly Val Ile Ala Phe Leu Ala Ser Ala Asn
305 310 315 320
Arg Asp Glu Ala Ala Phe Glu Arg Ala His Glu Phe Asp Ile His Arg
325 330 335
His Pro Asn Arg His Ile Gly Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu
340 345 350
Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Thr Lys Ile Ala Leu Glu Ala Leu
355 360 365
Leu Lys Gln Tyr Ser Ala Met Glu Thr Ile Ser Thr Glu Pro Met Ala
370 375 380
Asn Ser Ser Met Tyr Gly Leu Lys His Phe Arg Leu His Val Lys Glu
385 390 395 400
Ala Leu Leu Ser Ser
405
<210> 2
<211> 1218
<212> DNA
<213> 索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)
<400> 2
atgaactcgg caaaacagca gaaccctatt caaaaagctc ttctaaacgg aaaaaaccgg 60
caggacccgt atgatccatt tccctggtac gaaaaaatgc gcaaggaatc acctgtctac 120
tatgatgagg acagcaaagt gtggagcgtg tttctttatg atgatgtcaa aagagtgatc 180
agcgacaaag actttttttc aaatcaattc cctcagcttg aatccggcaa tacatttgcg 240
aaaacaatgg tcagcatgga tccgccaaaa cataccagaa tcaggtcgat tgtaagcaaa 300
gctttcacac cgcgcatcat gaaagagtgg gaaccgcgca tccgggtgct gacggatgaa 360
ctgcttggaa aggcccgcgg ccgggacgaa atcgacctcg ttcaggattt ttcttatcct 420
cttcccgtta tggtcatttc agaattgctg ggtgttccat ctgagcataa ggagaaattc 480
aaagaatggt cagatctatt agtaagcttg ccgaagagcg cttatgaaga ggacgtcatg 540
gagtggcgga ccattaggaa taaaggtgaa gaagacttaa gcgcgttttt tgaaaacgtc 600
attgaagaaa aaagacggaa tctgggagat gatatcattt cacttttaat tcaagctgaa 660
gaagatgggg acaggctttc tcctgatgaa ttggttccgt tttgcaatct gctgctttta 720
gctggcaatg agacaacgac gaatttgatt tcaaatatgg tttacagcat tcttgaaaaa 780
ccgggtacgt ttgacgagtt ggcaaatcag cctgacctga tcccccaggc cgtcgaagaa 840
gctgtccgtt ttcgcgcgcc ggcgccgatg atcgtgcgct tcgtccagca ggataccgca 900
atcaggggag tgaatttgaa aaagggagag ggagtgatcg cttttcttgc ctcagccaac 960
cgggatgaag ctgcatttga acgggcgcac gaatttgata ttcaccgcca tccaaaccgg 1020
cacatcggct ttggccacgg catccatttc tgtttgggcg cccctttggc gaggctggag 1080
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gagccgatgg ccaacagcag catgtacggt ctgaaacatt ttcgcctcca tgtcaaagag 1200
gcgctgcttt catcatga 1218
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaactcgg caaaacagca gaac 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatgatgaa agcagcgcct ctttg 25

Claims (5)

1.一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体，其特征在于，所述CYP109B2突变体为：在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的点突变体或组合突变体，所述点突变为：F70W、F70Y、S85G、S85L、S85M、S85R、L240V、A241H、T245C、I291A、I291C、I291G、I291L、I291M、I291N、I291S、V292A、V292C、V292F、V292G、V292L、V292M、V292N、F294C、F294G、F294T、F294P、F294I、S387F或S387H；或者，所述突变体为组合突变体，具体为：F79A/V292P，V84I/S85M，V84L/S85M，V84F/I291T，S85M/I291A，S85M/S387H，S85L/292L，F70M/V292C，L240V/V84I，L240V/V84L，L240V/V84N，L240V/V84Y，L240V/S85F，L240V/S85L，L240V/S85V，L240V/S85W，L240V/S85Y，L240V/I291A，L240V/I291G，L240V/I291M，L240V/F294I，L240V/S387F，L240V/S387Q，L240V/F70Y，S387F/F70Y，V292R/S387F，A73Q/S387F/L170T，F70Y/S387F/I291A，V84F/I291T/A288F，V84F/I291T/V292F，V84F/I291T/S387F，V84F/I291T/F294I，L240V/S387F/Y175I，L240V/S387F/Y175K，L240V/S387F/Y175Q，L240V/S387F/Y175S，L240V/S387F/Y175T，L240V/S387F/I291A，L240V/S387F/V292R，L240V/S387F/F294C，L240V/S387F/F294G，L240V/S387F/F294V ，L240V/S387F/F294P，L240V/S387F/F294T，L240V/S387F/F294I，L240V/S387F/N385G，L240V/V84I/S85N，L240V/I291A/F70Y，L240V/I291A/Y175S，L240V/V84L/F294I，L240V/V84L/Y175S，L240V/S85L/F294I，L240V/V84L/S387F，L240V/F294I/F79I，L240V/V84F/I291T/S387F，L240V/S85L/F294I/F70Y，L240V/S85L/F294I/Y175S，L240V/S85L/F294I/S387F，L240V/S387F/F294I/F70Y，L240V/S387F/F294I/Y175S，L240V/V84L/F294I/Y175S，L240V/V84L/I291A/Y175S，L240V/V84L/F294I/F70Y，L240V/V84F/S387F/I291T，L240V/V84L/S387F/I291T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292A，L240V/V84L/S387F/I291T/V292H，L240V/V84L/S387F/I291T/V292K，L240V/V84L/S387F/I291T/V292I，L240V/V84L/S387F/I291T/V292M，L240V/V84L/S387F/I291T/V292N，L240V/V84L/S387F/I291T/V292P，L240V/V84L/S387F/I291T/V292T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292Y，L240V/V84L/S387F/I291T/V292Q，L240V/V84L/S387F/I291T/V292L，L240V/V84L/S387F/I291T/V292G，L240V/V84L/S387F/I291T/V292C，L240V/V84L/S387F/I291T/A288N，L240V/V84L/S387F/I291T/A288L，L240V/V84L/S387F/I291T/A288G，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M388L，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/S85T，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/S85W，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/S85N，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F，L240V/V84L/S387F/I291T/V292S/M290F/F294I。
2.一种载体，其特征在于，所述载体中包含编码如权利要求1所述的CYP109B2突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体上还包含：氧化还原伴侣蛋白的基因和/或P450单加氧酶氧化还原结构域基因。
4.一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌中包含如权利要求2所述的载体。
5.如权利要求1所述的CYP109B2突变体、或如权利要求2所述的载体，或如权利要求4所述的遗传工程菌在催化甾体化合物羟基化修饰中的应用。
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