CN116254240A - 一种葡萄糖脱氢酶突变体及应用 - Google Patents

一种葡萄糖脱氢酶突变体及应用 Download PDF

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CN116254240A CN202111455159.9A CN202111455159A CN116254240A CN 116254240 A CN116254240 A CN 116254240A CN 202111455159 A CN202111455159 A CN 202111455159A CN 116254240 A CN116254240 A CN 116254240A
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glucose dehydrogenase
gly
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glu
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

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  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体，能够应用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。该葡萄糖脱氢酶突变体的活力是野生型葡萄糖脱氢酶的活力的7.2倍，提高了催化辅酶再生的能力，更适于工业化应用。

Description

一种葡萄糖脱氢酶突变体及应用
技术领域：
本发明属于酶基因工程技术领域，具体涉及一种高活力催化辅酶再生的葡 萄糖脱氢酶突变体及应用。
背景技术：
氧化还原酶被广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸等药物中间体，绝大多 数氧化还原反应都需要辅酶NAD(P)H的参与。因辅酶价格昂贵，稳定性差、难 以重复利用，严重限制了氧化还原酶的工业化应用，构建高效、经济的辅酶再 生体系对于解除辅酶含量对反应的限制、降低生产成本极为重要。
葡萄糖脱氢酶(GDH)是一类能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的氧化 还原酶，催化过程中可以提供氢离子，因此在辅酶的再生体系中有着重要的应 用价值。
葡萄糖脱氢酶根据其所结合的辅酶可分为三种类型：吡咯喹啉醌依赖型、 FAD依赖型及NAD(P)+依赖型。其中NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶可特异性催 化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，见图1，同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H， 从而解决NADH以及更为昂贵的NADPH的再生问题。由于其对辅酶NAD(P)+的比活高，对还原性辅酶NAD(P)H的再生能力强，且既可用于NADH的再生， 又可用于NADPH的再生，NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶得到了广泛的应用。
Figure RE-GDA0003445762440000021
当前的葡萄糖脱氢酶的催化能力比较弱，在工业化应用中成本比较高，而 且会增加后期的环保处理压力，为了提升葡萄糖脱氢酶的催化效率，可以利用 蛋白质工程手段，对葡萄糖脱氢酶进行基因改造。
发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高活力催化辅酶再生能 力的葡萄糖脱氢酶突变体。
一方面，本发明提供的葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列是以SEQ ID NO.2 所示的野生型葡萄糖脱氢酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为88 位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V88I)，165位的异亮氨酸突变为甘氨酸(I165G)， 190位的丙氨酸突变为丝氨酸(A190S)，197位的丙氨酸突变为蛋氨酸(A197M)， 205位的谷氨酰胺突变为甘氨酸(Q205G)，214位的脯氨酸突变体精氨酸(P214R) 和252位的谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q252L)。
进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体的野生型基因序列来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，野生型模板NCBI的登录号为WP_119899028.1。
更进一步，葡萄糖脱氢酶突变体表达于基因工程菌，优选大肠杆菌或酵母 菌。
另一方面，本发明提供的葡萄糖脱氢酶突变体可以应用于氧化还原反应中 辅酶NADH以及NADPH的再生。
进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体为葡萄糖脱氢酶酶粉或含有该葡萄糖脱 氢酶的全细胞或细胞破碎液。
本发明的有益效果在于，本发明利用蛋白质工程方法改造出一种新的葡萄 糖脱氢酶突变体，该葡萄糖脱氢酶突变体的活力是野生型葡萄糖脱氢酶的活力 的7.2倍，提高了催化辅酶再生的能力，更适于工业化应用。
附图说明
图1实施例1中核酸电泳图
图2实施例2中破碎细胞电泳图
图3实施例3中饱和引物能够扩增出清晰的基因条带电泳图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了 更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：野生型葡萄糖脱氢酶的工程菌构建
从NCBI收录的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的信息中，挖掘到葡萄糖脱氢 酶的基因序列(WP_119899028.1)，通过人工全合成技术完成基因片段的体外合 成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将该基因引入到pET-21a的多克隆位 点区域，转入到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，在含有Amp+抗性的LB平板上， 利用通用引物(T7/T7TER)鉴定出阳性克隆，转到LB培养基中活化，用于后 期表达研究。
PCR扩增鉴定基因的引物信息为：
T7-F TAATACGACTCACTATAGGG
T7-ter-R TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
PCR扩增的体系为：
PCR mixture Concentration Volume
ddH2O(灭过菌) / 73μL
Dream Taq buffer 10X 10μL
T7/T7-ter 10μM 4μL/个
Template / 1uL
dNTP mix 2.5mM 8μL
Dream Taq / 1μL
Total volume 100μL
扩增结果显示所挑选的单克隆都为阳性，具体核酸电泳图见图1。
实施例2：野生型葡萄糖脱氢酶的蛋白表达
将筛选到的阳性克隆转入含有Amp+抗性的LB试管中，37℃下培养过夜。 将种子液按照1.5％的接种量转接到含有Amp+抗性的2YT培养基中，在37℃下 培养细菌，待生物量OD600值达到0.6左右，进行IPTG诱导，温度降低到25℃， 表达16h后收集菌体，并破碎细胞进行电泳分析，结果见图2，蛋白的大小和 预期的一致，且有很好的可溶性表达。
实施例3：葡萄糖脱氢酶突变体的构建和筛选
根据对野生型葡萄糖脱氢酶结构的模拟和文献的支持，对蛋白结构中热点 的氨基酸：V88、I165、A190、A197、Q205、P214和Q252进行半理性设计， 完成饱和突变库的构建。具体饱和突变体引物见下表，突变位点的氨基酸全部 采用NNK/NNM来设计。利用PCR快速扩增技术，在饱和引物的指引下完成全 质粒扩增，每个位点筛选200个单克隆左右，使得突变率覆盖到95％以上。利 用每个突变体转化后生成的辅酶(NADPH)的量，在340nm下筛选出高活性 的突变体，在不同位点的迭代饱和突变下，最后筛选达到活性提升7.2倍的高突 变株Mut(V88I/I165G/A190S/A197M/Q205G/P214R/Q252L)，突变体Mut中涉及 到7个位点都发生了突变，且突变后蛋白表达没有受到影响。
Figure BDA0003386375540000051
Figure BDA0003386375540000061
全质粒扩增采用Prime STAR Max聚合酶的高效能力，在100uL体系中完 成扩增，具体PCR反应体系如下：
PCR mixture Volume
ddH2O(灭过菌) 41μL
饱和引物对 4μL/个
Template 1μL
Prime STAR Max 50μL
Total volume 100μL
PCR的循环条件为：
Figure BDA0003386375540000062
经过电泳显示出饱和引物能够扩增出清晰的基因条带，见图3。
实施例4：葡萄糖脱氢酶的突变前后的活力分析
向反应体系中加入10mL的Tris-HCL缓冲液(100mM，pH 8.0)，称量72 g葡萄糖固体和13.2g的NAD+固体加入到反应釜中溶解，最后加入50mg GDH 细胞，25℃条件下在线检测340nm下的吸收值变化，从反应开始连续测定4min 内的变化值，最后利用酶活的定义，计算出酶的活力。通过对野生型和突变体 细胞的检测，得到突变体的活力是野生型的7.2倍，具体见下表。
样品 活力(U/mg) 提升倍数
WT 1.36 1
Mut 9.82 7.2
实施例5：野生型葡萄糖脱氢酶在苯乙酮转化中的应用
向50mL反应体系中，加入5g苯乙酮，2.5mL的DMSO和7.5g的葡萄糖， 加入5mg的NADP和1.5g的KRED酶细胞，加入45mL的水和1mL的pH8.0 (1M)磷酸钾盐缓冲液，最后加入0.5g的野生型GDH细胞(含SEQ ID NO.1 所示的GDH酶)，在30℃下转化24h后，转化率87％。
实施例6：突变体葡萄糖脱氢酶在苯乙酮转化中的应用
向50mL反应体系中，加入5g苯乙酮，2.5mL的DMSO和7.5g的葡萄糖， 加入5mg的NADP和1.5g的KRED酶细胞，加入45mL的水和1mL的pH 8.0 (1M)磷酸钾盐缓冲液，最后加入0.1g的突变体GDH细胞(含SEQ ID NO.3 所示的GDH酶突变体)，在30℃下转化16h后，转化率99％，转化效果明显高 于野生型。
序列表
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> 一种葡萄糖脱氢酶突变体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 786
<212> DNA/RNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60
aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120
aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180
gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240
aaggagttcg gcacactcga tgtaatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300
tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360
tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420
attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccat tatttgtcca ctatgcggca 480
agtaaaggcg ggattaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540
attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc ggagaaattt 600
gctgacccta agcagaaggc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660
ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720
ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacagtatc cttcattcca ggcaggccgc 780
ggttaa 786
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val
35 40 45
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
100 105 110
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Glu Lys Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Glu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
<210> 3
<211> 786
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Gln Ala Gly Arg Gly
260

Claims (5)

1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体表达于基因工程菌。
4.如权利要求3所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶突变体表达菌株选自大肠杆菌或酵母菌。
5.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体应用于辅助氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。
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