CN113913400B - 催化活性提高的l-山梨酮脱氢酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了催化活性提高的L‑山梨酮脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明以氧化葡萄糖酸杆菌来源的L‑山梨酮脱氢酶为出发序列，通过定点突变获得了酶活提升的L‑山梨酮脱氢酶突变体M167L、S453A、L460V、E471D和M167L‑S453A‑E471D，使突变体的比酶活达4.20U/mg、1.67U/mg、3.00U/mg、1.73U/mg、2.82U/mg，与野生酶相比提高了1.1～2.6倍，有助于实现L‑山梨酮脱氢酶参与的代谢途径相关产物产量的提高。

Description

催化活性提高的L-山梨酮脱氢酶突变体
技术领域
本发明涉及催化活性提高的L-山梨酮脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
维生素C，又称抗坏血酸，是人体必须的一种维生素。广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料领域。2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是生产维生素C的直接前体物质。目前工业生产2-KLG利用三菌两步发酵法。和一步发酵相比，三菌两步发酵法具有高能耗、高物耗、混菌发酵难以精确调控和育种困难等劣势。探索一步发酵生产2-KLG成为了研究者的共同目标。由于从山梨醇生产2-KLG只涉及3个酶的催化过程，分别为D-山梨醇脱氢酶、L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶。因此，目前研究者大多通过代谢工程进行一步菌的研究。主要方法是将2-KLG合成途径中关键酶基因进行异源表达进行2-KLG的生产，但效果并不能和工业化媲美。YOSHIMASA SAITO于1997年通过对菌株进行诱变，得到了一株利用山梨醇高产2-KLG的菌株，但是由于信息提供不足，无法得到重复。
发明内容
发明人前期通过筛选获得了一株可以直接将D-山梨醇转化为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004，并鉴定了其中的L-山梨糖脱氢酶与L-山梨酮脱氢酶。本发明通过基因工程和酶工程的手段，制备出了酶活性提高的L-山梨酮脱氢酶。
本发明提供了具有酶活提高的L-山梨酮脱氢酶的突变体，以来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004的L-山梨酮脱氢酶为出发序列，对第167、453、460和471位的氨基酸中的一个或多个进行取代，所获得的突变体与野生型L-山梨酮脱氢酶相比，酶活提升。
在一种实施方式中，所述出发序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将第167位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M167L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将第453位置的丝氨酸(Ser)变成丙氨酸(Ala)，突变体命名为S453A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将第460位置的亮氨酸(Leu)变成缬氨酸(Val)，突变体命名为L460V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在一种实施方式中，所述突变体是将第471位置的谷氨酸(Glu)变成天门冬氨酸(Asp)，突变体命名为E471D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将第167位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，将第453位置的丝氨酸(Ser)变成丙氨酸(Ala)，将第471位置的谷氨酸(Glu)变成天门冬氨酸(Asp)，突变体命名为M167L-S453A-E471D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，编码突变体M167L的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第167位密码子由AUG替换为CUC。
在一种实施方式中，编码突变体S453A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第453位密码子由AGC替换为GCG。
在一种实施方式中，编码突变体L460V的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第460位密码子由CTG替换为GUU。
在一种实施方式中，编码突变体E471D的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第471位密码子由GAG替换为GAC。
在一种实施方式中，编码突变体M167L/S453A/E471D的核苷酸序列是在SEQ IDNO.7的基础上将第167位、453位、471位密码子分别
由AUG、AGC和GAG替换为CUC、GCG和GAC。
本发明还提供所述L-山梨酮脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带L-山梨酮脱氢酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清液即为L-山梨酮脱氢酶突变体的粗酶液；
(4)将粗酶液经过亲和层析与凝胶过滤纯化，最终得到纯酶溶液。
本发明还提供携带所述基因的重组质粒。
在一种实施方式中，所述质粒为pET系列质粒。
本发明还提供表达所述L-山梨酮脱氢酶突变体或携带所述基因的微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞的宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在一种实施方式中，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
在一种实施方式中，所述质粒为pET系列质粒或pMD19-T。
在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主，以pMD19-T为表达载体，表达所述L-山梨酮脱氢酶突变体和2-KLG合成突进中关键酶基因。
在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
本发明还提供了一种生产L-山梨酮脱氢酶的方法，是将所述微生物细胞在培养基中培养一段时间，收集L-山梨酮脱氢酶。
在一种实施方式中，所述方法是将所述微生物细胞在TB培养基中，于35～40℃培养至菌体浓度达到OD600＝0.6～1.0时降温至18～25℃，并添加IPTG至终浓度0.5mM诱导12-24h时间，以表达L-山梨酮脱氢酶。
本发明还提供了所述L-山梨酮脱氢酶在生产2-酮基-L-古龙酸中的应用。
本发明还提供了所述微生物细胞或所述重组大肠杆菌在生产维生素C或其前体物方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004中L-山梨酮脱氢酶为目标，通过定点突变生物技术改造L-山梨酮脱氢酶氨基酸序列，最终获得5株酶活提升的L-山梨酮脱氢酶突变体M167L、S453A、L460V、E471D和M167L-S453A-E471D，使突变体的比酶活(U/mg)达4.20、1.67、3.00、1.73、2.82，分别为野生酶的2.6倍、1.1倍、1.9倍、1.2倍、1.7倍，有助于实现L-山梨酮脱氢酶参与的代谢途径相关产物产量的提高。
附图说明
图1为定点突变改造的L-山梨酮脱氢酶表达载体(pET28a(+)-SNDH)构建图。
图2为L-山梨酮脱氢酶经superdex 200pg 26/600凝胶柱的出峰图。
图3为SDS-PAGE分析纯化后L-山梨酮脱氢酶的电泳图。
图4为L-山梨酮脱氢酶突变体M167L、S453A、E471D和M167L-S453A-E471D与野生型L-山梨酮脱氢酶对L-山梨酮的酶活比较图。
图5为本发明一种实施方式中质粒pMD19-scpA-M167L-SDH的示意图。
具体实施方式
1、培养基及试剂：
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。配制固体培养基还需加入18g/L琼脂粉。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，4mL甘油、KH2PO4 2.31g/L、K2HPO4 12.54g/L。
山梨醇培养基：酵母粉10g/L，山梨醇50g/L。加入18g/L琼脂粉，以配制山梨醇固体培养基。
A液：25mM Tris，150mM NaCl，25mM咪唑，pH＝8.0。
B液：25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，pH＝8.0。
C液：25mM Tris，150mM NaCl，pH＝8.0。
2、L-山梨酮脱氢酶的基因克隆：
将Gluconobacter oxydans WSH-004(菌株公开于论文《High-ThroughputScreening of a 2-Keto-L-Gulonic Acid-Producing Gluconobacter oxydans StrainBased on Related Dehydrogenases》)接种于山梨醇培养基培养。收集菌体，并利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组，利用PCR扩增L-山梨酮脱氢酶，扩增引物包含连接质粒时所需要的同源臂序列。PCR均使用2×Phanta Max Master Mix(购自南京诺唯赞公司)。PCR产物回收使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
3、L-山梨酮脱氢酶质粒构建与基因的表达：
1)利用pcr扩增载体，使载体线性化，并使之带有可以与扩增后的L-山梨酮脱氢酶基因互补的同源臂序列。
2)利用Infusion-Cloning试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将线性化载体载体和L-山梨酮脱氢酶进行无缝连接，构建完整的质粒。
3)将构建好的质粒转入目标感受态，并涂布至含有相应抗生素的平板上，挑选阳性克隆子进行测序。
4、L-山梨酮脱氢酶的表达及纯化：
1)将测序正确的菌株接种至添加有相应抗性的种子培养基制备种子液。待种子液制备完成，将其接种于表达培养基中，通过诱导进行L-山梨酮脱氢酶的表达。
2)离心样品后收集菌体，利用A液重悬菌体。
3)利用均质机对样品进行破碎。12000×g离心60min，去除杂质，收集上清，并将上清通过0.22μm滤膜，将样品放置冰上备用。
4)利用AKTA pure仪器(美国通用电气公司)将样品经过由A液平衡后的镍柱，并用A液再次平衡镍柱。用B液进行样品洗脱，收集目标并利用蛋白浓缩管(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)浓缩样品。最后将浓缩后样品经过由C液平衡后的凝胶柱(superdex200pg26/600)，并收集目标峰。
5)利用BCA试剂盒(购自碧云天生物)检测蛋白浓度。
6)L-山梨酮脱氢酶酶活测定方法：
在30℃下进行酶活测定。反应总体系200μl，包含2μL纯化后酶液、1μL 1mM NADP+、10μL 10g/L L-山梨酮，用C液补充至200μl，混匀后立即在340nm下检测5min内吸光值得变化，并将通过斜率(δA340/δmin)计算酶活，酶活/蛋白浓度即为比酶活。
酶活的定义：1个酶活单位(U)定义为：在30℃下，每分钟催化底物反应，所得产物消耗1umol的NADP+所需的酶量。
实施例1：野生型L-山梨酮脱氢酶基因克隆、质粒的构建及表达
(1)L-山梨酮脱氢酶表达载体的构建：
从保藏的甘油管中，将Gluconobacter oxydans WSH-004接种于山梨醇培养基中，37℃，220rpm培养48h，4000rpm离心，并收集菌体，提取Gluconobacter oxydans WSH-004基因组，利用引物对F1/R1进行L-山梨酮脱氢酶的扩增。并回收PCR产物。引物对F1/R1如下：
F1：aactttaagaaggagatataccATGAATGTTGTCTCAAAGACTGTATCTTTACCG；
R1：ggctttgttagcagccggatcTTACGAAATCCAGTGCGAACGTTTG。
使用引物对F2/R2对pET28a(+)载体进行扩增，并回收PCR产物。引物对F2/R2如下：
F2：gatccggctgctaacaaagcccgaaag；
R2：ggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagggg。
PCR反应体系均为：25μL 2×Phanta Max Master Mix，1μL正向引物(10μmol·L-1)，1μL反向引物(10μmol·L-1)，1μL模板DNA，加入蒸馏水至50μL。L-山梨酮脱氢酶PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入30个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，4℃保温。pET28a(+)质粒线性化PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入25个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
将40ng L-山梨酮脱氢酶(SNDH)pcr产物和20ng pET28a(+)线性化载体混合，利用Infusion-Cloning试剂盒进行连接，构建质粒pET28a(+)-SNDH(图1)。将10μL pET28a(+)-SNDH连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入1ml LB培养基，37℃，220rpm培养45min，3000rpm离心3min，去掉上清，将菌体重悬于100μlLB培养基中，涂布在含有50mg/L硫酸卡那霉素的LB平板中，培养过夜。次日，挑选阳性克隆进行测序，验证质粒的是否正确。
(2)L-山梨酮脱氢酶的表达：
将测序正确的克隆子转移至含有50mg/L硫酸卡那霉素的10ml LB中培养，培养过夜，制备种子液。将培养好的种子液以2％转接至含有50mg/L硫酸卡那霉素的50ml TB培养基中，于37℃温度下培养，待菌体浓度达到OD600＝0.8时降温至20℃，并添加IPTG至终浓度0.5mM诱导18h，以表达L-山梨酮脱氢酶。
实施例2：L-山梨酮脱氢酶突变体制备及表达
(1)单突变的制备
根据pET28a(+)-SNDH质粒序列，分别设计并合成引入M167L、S453A和E471D突变的引物，对L-山梨酮脱氢酶的基因序列进行定点突变，分别测序确认L-山梨酮脱氢酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到单突变L-山梨酮脱氢酶。
定点突变体编码基因的PCR扩增：利用PCR技术，以携带编码野生型L-山梨酮脱氢酶基因的表达载体pET28a(+)-SNDH质粒为模板，扩增携带突变体基因的重组质粒。
引入M167L突变的定点突变引物对F3/R3为：
F3：TTCCCGTTCctcATCCTGTGTGAGCGGGC(小写字母为突变碱基)
R3：CACAGGATgagGAACGGGAAGTTCCACGGC(小写字母为突变碱基)
引入S453A突变的定点突变引物对F4/R4为：
F4：ACCATCATGgcgGGTGGTCCCGAGACGCCG(小写字母为突变碱基)
R4：GGACCACCcgcCATGATGGTGTTCACCCAGAAGCGGC(小写字母为突变碱基)
引入L460V突变的定点突变引物对F5/R5为：
F5：AGACGCCGgttGGTGGTTTCAAGCAGTCGGGCT(小写字母为突变碱基)
R5：TGAAACCACCaacCGGCGTCTCGGGACCACC(小写字母为突变碱基)
引入E471D突变的定点突变引物对为F6/R6：
F6：GCCGTgacGCCGGTCTGTACGGCGTTGAGGAATA(小写字母为突变碱基)
R6：CGGCgtcACGGCCCCAGCCCGAC(小写字母为突变碱基)
PCR体系同实施例1。突变体质粒PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入25个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸4min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
(2)突变体的表达
按照实施例1步骤(2)的方法进行L-山梨酮脱氢酶突变体的表达。
实施例3：L-山梨酮脱氢酶M167L-S453A-E471D突变体的制备
(1)突变体M167L-S453A-E471D的制备
以实施例2构建的携带突变体M167L基因的重组质粒为初始模板，并利用实施例2设计的S453A突变的引物，利用PCR技术(方法如实施例2中所述)，对携带有编码突变体M167L基因的质粒进行定点突变，构建携带突变体M167L-S453A基因的重组质粒。并通过测序确认L-山梨酮脱氢酶M167L-S453A突变体是否正确。再以含有M167L-S453A突变体基因的质粒为模板，并利用实施例2设计的E471D突变的引物，利用PCR技术，对携带有编码突变体M167L-S453A基因的质粒进行定点突变，构建携带突变体M167L-S453A-E471D基因的重组质粒。并通过测序验证L-山梨酮脱氢酶M167L-S453A-E471D突变体的正确性。
(2)突变体的表达
突变体表达过程如实施例1步骤(2)中L-山梨酮脱氢酶的表达所述。
实施例4：L-山梨酮脱氢酶的纯化
将实施例1表达后野生型L-山梨酮脱氢酶发酵液4000rpm离心10min，弃掉上清，收集菌体。将菌体用A液重悬，重悬比例为1g湿菌体：5mL A液。利用均质机对菌体进行破碎，将破碎液12000rpm离心1h。收集上清，并将其经过0.22μm滤膜。利用AKTA pure将过滤后样品经过事先用A液平衡后的5mL体积的Ni-NAT亲和层析柱，待样品上样完毕后，再次用A液平衡Ni-NAT亲和层析柱。待A280检测波长稳定后改用B液等度洗脱样品(30min达到100％B液)，收集目标峰，并对其进行浓缩。将浓缩后样品通过事先用C液平衡后的凝胶过滤柱(superdex 200pg 26/600)，收集目标峰(图2)，即为野生型L-山梨酮脱氢酶纯酶溶液。随后测量蛋白浓度并利用SDS-PAGE(图3)进行分析。最后进行酶活性检测分析，结果显示，野生型L-山梨酮脱氢酶的比酶活为1.58U/mg。
实施例5：突变体L-山梨酮脱氢酶的纯化
突变体L-山梨酮脱氢酶的纯化过程同实施例4。具体而言，将表达突变体的重组大肠杆菌发酵液于4000rpm离心10min，弃掉上清，收集菌体。将菌体用A液重悬，重悬比例为1g湿菌体：5mL A液。利用均质机对菌体进行破碎，将破碎液12000rpm离心1h。收集上清，并将其经过0.22μm滤膜。利用AKTA pure将过滤后样品经过事先用A液平衡后的5mL体积的Ni-NAT亲和层析柱，待样品上样完毕后，再次用A液平衡Ni-NAT亲和层析柱。待A280检测波长稳定后改用B液等度洗脱样品(30min达到100％B液)，收集目标峰，并对其进行浓缩。将浓缩后样品通过事先用C液平衡后的凝胶过滤柱(superdex 200pg 26/600)，收集目标峰，即为突变体L-山梨酮脱氢酶纯酶溶液。随后测量蛋白浓度并利用SDS-PAGE进行分析，以及进行酶活检测分析，结果显示L-山梨酮脱氢酶突变体M167L、S453A、L460V、E471D和M167L-S453A-E471D的比酶活分别为4.20U/mg、1.67U/mg、3.00U/mg、1.73U/mg和2.82U/mg，分别是野生酶的2.6倍、1.1倍、1.9倍、1.2倍和1.7倍(图4)。
实施例6：突变体用于生产2-KLG
(1)将实施例2中构建的编码突变体M167L的基因SEQ ID NO.2，以多顺反子的形式连接至提到的pMD19-cspA-SDH质粒(质粒公开于《High Throughput Screening Platformfor a FAD-Dependent L-Sorbose Dehydrogenase》)中。使用引物F7/R7对pMD19-cspA-SDH进行线性化扩增，使用引物F8/R8对M167L进行线性化扩增。
引物对F7/R7如下：
F1：tggatttcgtaaTGACGAGCGGTTTTGATTACATCGTTGTCG；
R1：catAGTGTATTACCTTTAATAATTAAGTGTGCCTTTCGGCG。
引物对F8/R8如下：
F1：taattattaaaggtaatacactATGAATGTTGTCTCAAAGACTGTATCTTTACCG；
R1：accgctcgtcaTTACGAAATCCAGTGCGAACGTTTG。
PCR反应体系为：25μL 2×Phanta Max Master Mix，1μL正向引物(10μmol·L-1)，1μL反向引物(10μmol·L-1)，1μL模板DNA，加入蒸馏水至50μL。pMD19-cspA-SDH线性化PCR扩增程序设定为：95℃预变性3min；然后进入20个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min；最后72℃延伸5min，4℃保温。M167L线性化PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入30个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保温。线性化片段的连接如实施例1中所属。最终，构建质粒pMD19-cspA-M167L-SDH(图5)，并将其导入大肠杆菌BL2(DE3)中，构建具有2-KLG合成途径的重组大肠杆菌。
(2)与(1)中方法相同，利用野生型L-山梨酮脱氢酶基因构建质粒pMD19cspA-SNDH-SDH，并将其导入大肠杆菌BL2(DE3)中，作为菌株为对照。
(3)将步骤(1)和(2)构建的重组大肠杆菌在含L-山梨糖(10g/L)的25mL LB培养基中，于30℃发酵48小时，检测2-KLG的产量。结果显示，表达含有突变M167L的基因的大肠杆菌发酵48h后2-KLG的产量达3.01g/L，OD600达3.235，比对照(产量2.23g/L，OD600 3.486)提升了1.3倍。
对比例1：
按照实施例2相同策略设计引物，分别构建突变体E114D、H117A、H117F、H117G、F164A、F164L、M167A、M167W、E171L、E171W、F286A、F290A、F290V、C295E、C295S、V297N、R445T、M452A、G454A、G454S、G455S、G455A按照实施例1的方法表达突变体，并按照实施例4的方法纯化，检测各突变体的酶活，结果如表1所示：
表1不同单突变体的比酶活
突变体 比酶活(U/mg)
E114D 0.102869
H117A 0.460999
H117F 0.126343
H117G 0.486499
F164A 0.084321
F164L 0.084015
M167A 0.140535
M167W 0.170469
E171L 0.099634
E171W 0
F286A 0.091135
F290A 0
F290V 0.234122
C295E 0.014798
C295S 0.40658
V297N 0.031577
R445T 0
M452A 0.605973
G454A 0.761438
G454S 1.066871
G455S 0.513797
G455A 0.053578
对比例2：
按照实施例3相同策略，分别构建多突变体M167L/S453A、M167L/L460V、M167L/E471D、S453A/L460V、S453A/E471D、L460V/E471D、M167L/S453A/L460V、S453A/L460V/E471D、M167L/L460V/E471D、M167L/S453A/L460V/E471D；例如，以M167L为出发序列，对第453位进行突变，构建突变体M167L/S453A；以M167L/S453A为出发序列，构建三突变体M167L/S453A/L460V；以M167L/S453A/L460V为出发序列构建四突变体M167L/S453A/L460V/E471D。
按照实施例1的方法表达突变体，并按照实施例4的方法纯化，检测各突变体的酶活，结果如表2所示：
表2不同多突变体的比酶活
突变体 比酶活(U/mg)
M167L/S453A 0.2382
M167L/L460V 0.345705
M167L/E471D 0.757349
S453A/L460V 0.49743
S453A/E471D 0.967216
L460V/E471D 0.662801
M167L/S453A/L460V 0.860725
S453A/L460V/E471D 0.833002
M167L/L460V/E471D 1.550556
M167L/S453A/L460V/E471D 1.557293
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 催化活性提高的L-山梨酮脱氢酶突变体
<130> BAA211358A
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 498
<212> PRT
<213> Gluconobacter oxydans
<400> 1
Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe
20 25 30
Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala
50 55 60
Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile
85 90 95
Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys
100 105 110
Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu
130 135 140
Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr
145 150 155 160
Pro Trp Asn Phe Pro Phe Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser
180 185 190
Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro
195 200 205
Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln
210 215 220
Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val
290 295 300
Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met
305 310 315 320
Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val
355 360 365
Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val
370 375 380
Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp
420 425 430
Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val
435 440 445
Asn Thr Ile Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys
450 455 460
Gln Ser Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp
485 490 495
Ile Ser
<210> 2
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe
20 25 30
Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala
50 55 60
Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile
85 90 95
Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys
100 105 110
Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu
130 135 140
Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr
145 150 155 160
Pro Trp Asn Phe Pro Phe Leu Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser
180 185 190
Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro
195 200 205
Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln
210 215 220
Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val
290 295 300
Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met
305 310 315 320
Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val
355 360 365
Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val
370 375 380
Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp
420 425 430
Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val
435 440 445
Asn Thr Ile Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys
450 455 460
Gln Ser Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp
485 490 495
Ile Ser
<210> 3
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe
20 25 30
Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala
50 55 60
Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile
85 90 95
Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys
100 105 110
Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu
130 135 140
Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr
145 150 155 160
Pro Trp Asn Phe Pro Phe Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser
180 185 190
Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro
195 200 205
Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln
210 215 220
Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val
290 295 300
Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met
305 310 315 320
Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val
355 360 365
Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val
370 375 380
Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp
420 425 430
Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val
435 440 445
Asn Thr Ile Met Ala Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys
450 455 460
Gln Ser Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp
485 490 495
Ile Ser
<210> 4
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe
20 25 30
Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala
50 55 60
Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile
85 90 95
Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys
100 105 110
Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu
130 135 140
Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr
145 150 155 160
Pro Trp Asn Phe Pro Phe Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser
180 185 190
Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro
195 200 205
Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln
210 215 220
Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val
290 295 300
Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met
305 310 315 320
Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val
355 360 365
Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val
370 375 380
Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp
420 425 430
Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val
435 440 445
Asn Thr Ile Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Val Gly Gly Phe Lys
450 455 460
Gln Ser Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp
485 490 495
Ile Ser
<210> 5
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe
20 25 30
Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala
50 55 60
Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile
85 90 95
Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys
100 105 110
Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu
130 135 140
Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr
145 150 155 160
Pro Trp Asn Phe Pro Phe Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser
180 185 190
Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro
195 200 205
Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln
210 215 220
Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val
290 295 300
Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met
305 310 315 320
Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val
355 360 365
Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val
370 375 380
Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp
420 425 430
Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val
435 440 445
Asn Thr Ile Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys
450 455 460
Gln Ser Gly Trp Gly Arg Asp Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp
485 490 495
Ile Ser
<210> 6
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe
20 25 30
Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala
50 55 60
Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile
85 90 95
Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys
100 105 110
Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu
130 135 140
Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr
145 150 155 160
Pro Trp Asn Phe Pro Phe Leu Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser
180 185 190
Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro
195 200 205
Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln
210 215 220
Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val
290 295 300
Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met
305 310 315 320
Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val
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Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp
420 425 430
Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val
435 440 445
Asn Thr Ile Met Ala Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys
450 455 460
Gln Ser Gly Trp Gly Arg Asp Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp
485 490 495
Ile Ser
<210> 7
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgaatgttg tctcaaagac tgtatcttta ccgttaaagc cgcgtgagtt cggattcttt 60
attgatggag aatggcgcgc aggtaaggat ttcttcgatc gttcctcgcc ggctcatgat 120
gttcccgtca cccgtattcc acgctgcacc cgtgaagacc ttgatgaggc agtcgctgct 180
gcacgtcgtg ctttcgagaa cggaagctgg gcgggtctgg cagccgcgga tcgtgcggcg 240
gttcttctga aagccgcggg ccttctgcgc gagcgccgtg atgacatcgc ttactgggaa 300
gttctcgaaa acgggaagcc catcagccag gcgaaaggtg agatcgatca ctgtatcgcc 360
tgtttcgaga tggcggccgg cgctgcgcgg atgctgcatg gtgatacgtt caacaatctg 420
ggcgaggggc tgtttggcat ggtcctgcgg gagcccatcg gtgtcgtcgg tctgattacg 480
ccgtggaact tcccgttcat gatcctgtgt gagcgggcgc ctttcattct cgcatccggc 540
tgcacgctgg tcgtcaagcc tgccgaagtc acgagtgcca cgacccttct tctggcagaa 600
atccttgccg atgccgggct gccgaagggt gtcttcaatg tcgtgacagg cacggggcgc 660
acggtcggtc aggccatgac cgagcatcag gatatcgaca tgctgtcctt cacgggctcc 720
acgggcgtcg gcaagtcctg tatccacgcg gcggctgaca gcaacctgaa gaaacttggc 780
ctcgaactgg gcggcaagaa cccgattgtc gtgttcgctg acagcaacct tgaggatgcg 840
gccgacgcgg tagccttcgg gatcagcttt aataccgggc agtgctgtgt gtcgtcgagc 900
cgcctgatcg tagagcggtc cgtggcggag aagttcgagc gcctcgtcgt ggcaaaaatg 960
gagaagatcc gcgttggtga tccgtttgat cccgaaacgc agattggcgc catcacgacg 1020
gaagcgcaga acaagaccat tctggactat atcgcgaaag gcaaggccga gggcgccaag 1080
ctgctctgtg gtggcgggat cgtcgatttc ggcaagggac agtatatcca gcccacgctt 1140
ttcacggatg tgaagccctc gatgggcatc gcgcgtgacg agatttttgg gccggttctg 1200
gcgtccttcc acttcgatac cgtcgatgag gcgatcgcga ttgccaatga cacggtttac 1260
ggcttggccg catcggtctg gagcaaggat atcgacaagg cgcttgccgt gacccgtcgt 1320
gttcgtgccg gccgcttctg ggtgaacacc atcatgagcg gtggtcccga gacgccgctg 1380
ggtggtttca agcagtcggg ctggggccgt gaggccggtc tgtacggcgt tgaggaatat 1440
acgcagatca aatctgtcca tatcgaaact ggcaaacgtt cgcactggat ttcgtaa 1497

Claims (10)

1.L-山梨酮脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-山梨酮脱氢酶为出发序列，将第167位置的甲硫氨酸替换为亮氨酸；或
以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-山梨酮脱氢酶为出发序列，将第453位置的丝氨酸替换为丙氨酸；或
以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-山梨酮脱氢酶为出发序列，将第460位置的亮氨酸替换为缬氨酸；或
以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-山梨酮脱氢酶为出发序列，将第471位置的谷氨酸替换为天门冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的L-山梨酮脱氢酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.2~5任一所示。
3.编码权利要求1或2所述L-山梨酮脱氢酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的载体或重组细胞。
5.表达权利要求1或2所述L-山梨酮脱氢酶突变体的微生物细胞。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达权利要求1或2所述的L-山梨酮脱氢酶突变体。
7.一种生产L-山梨酮脱氢酶的方法，其特征在于，将权利要求5所述的微生物细胞或权利要求6所述的重组大肠杆菌在培养基中培养一段时间，收集L-山梨酮脱氢酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在TB培养基中，于35~40℃培养至菌体浓度达到OD600=0.6~1.0时降温至18~25oC，并添加IPTG至终浓度0.5 mM诱导12-24 h时间，以表达L-山梨酮脱氢酶。
9.权利要求1或2所述的L-山梨酮脱氢酶突变体在生产2-酮基-L-古龙酸中的应用。
10.权利要求6所述的重组大肠杆菌，或权利要求7或8所述的方法在生产维生素C或其前体物方面的应用。
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