CN114591938B - 羧化酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羧化酶突变体及其制备方法和应用。羧化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第492位氨基酸由Val突变为Pro得到。本发明的羧化酶突变体实现了以糠醛和甲醛为原料生产呋喃铵盐前体物质1‑(2‑呋喃基)‑2‑羟基乙酮的高效催化，显著降低了呋喃铵盐的生产成本，产物1‑(2‑呋喃基)‑2‑羟基乙酮的纯度大大提高。

Description

羧化酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羧化酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
头孢类抗生素是近年来临床应用中最为广泛的抗感染类药物。头孢呋辛具有抗菌广、耐β-内酰胺酶、对肾脏毒副作用小等优点，是近年来发展势头很好的头孢类抗生素。头孢呋辛是一种非经胃肠给药的半合成广谱头孢素菌类抗生素，呋喃铵盐是临床上运用很广的抗生素头孢呋辛的中间体之一。
中国专利CN 112876436 A公开一种高选择性制备呋喃铵盐的方法，包括以下步骤：往氧化釜中加入水、酸性溶液和2-乙酰呋喃，升温滴加氧化剂反应，得2-氧代-2-呋喃乙酸；将2-氧代-2-呋喃乙酸降温后加甲氧胺反应，得2-甲氧胺-2-呋喃乙酸；向氨化成盐釜中加入甲醇，加2-甲氧胺-2-呋喃乙酸，通入氨气反应，得呋喃铵盐。
中国专利CN 113999194 A公开一种呋喃铵盐的制备方法，将亚硝酸钠溶液分批次加入2-乙酰呋喃、金属盐催化剂与混合酸溶液的反应体系中，反应，得到呋喃酮酸溶液；在高盐、强酸环境下由呋喃酮酸溶液制得呋喃酮酸盐，呋喃酮酸盐再先后与甲氧胺盐溶液、醇氨溶剂反应得到呋喃铵盐。
上述专利均是目前市场上呋喃铵盐的主流生产工艺，采用乙酰呋喃为原料首先经过氧化制得呋喃酮酸，再经甲氧胺肟化、成盐得到呋喃铵盐。而现在市场销售的乙酰呋喃基本采用糠醛脱羰基制得呋喃，再用醋酐酰化制备乙酰呋喃。乙酰呋喃的原材料价格较高，随着市场竞争越来越激烈，导致呋喃铵盐的产品利润逐渐下滑，价格由2020年的每吨30万元左右下滑至目前的每吨18万元左右。
如果以糠醛为原料制得1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮，然后再通过化学氧化制得呋喃铵盐中间体呋喃酮酸，用1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮替代乙酰呋喃用于呋喃铵盐的生产将显著降低呋喃铵盐的生产成本。
目前，亟需提供一种可以高效催化糠醛与甲醛的羧化反应的羧化酶突变体。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧化酶突变体，可以高效催化糠醛与甲醛的羧化反应制备1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮，产物纯度高；本发明同时提供了羧化酶突变体的制备方法和应用。
本发明所述的羧化酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
所述的SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第492位氨基酸由Val突变为Pro得到。
所述的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
所述的SEQ ID NO:3的编码基因为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
本发明所述的羧化酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因，得到SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到SEQ ID NO:3的编码基因；
(3)将SEQ ID NO:3的编码基因进行基因克隆，得到含有羧化酶突变体编码基因的质粒；
(4)将含有羧化酶突变体编码基因的质粒导入感受态细胞中，得到羧化酶突变体的表达菌株；
(5)羧化酶突变体的表达菌株进行诱导发酵，得到羧化酶突变体。
步骤(2)中所述的定点突变的引物序列如下：
上游引物V-492-P-F：5′-CCAAGGGCTATGGTCCGCAAGCGCTGAAAG-3′，
下游引物V-492-P-R：5′-CGGCTTTCAGCGCTTGCGGACCATAGCCCT-3′。
步骤(3)中所述的基因克隆的引物序列如下：
上游引物NcoI-F：5′-CATGATGGCTTCGGTACACGGCACCAC-3′，
下游引物XhoI-R：5′-CCGCTCGAGCTTCACCGGGCTTACGGTGCT-3′。
本发明所述的羧化酶突变体的应用是以羧化酶突变体为催化剂，糠醛和甲醛为底物，进行催化反应，得到1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮。
所述的糠醛的浓度为20-60g/L，甲醛的浓度为20-60g/L，羧化酶突变体的用量为8-12g/L。
所述的催化反应的温度为20-37℃，催化反应的pH＝6.0-8.0，催化反应的时间为8-20h。
本发明中羧化酶突变体催化糠醛与甲醛制备1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的工艺路线如下：
糠醛(CAS：98-01-1)甲醛(CAS：50-00-0)1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮(CAS:17678-19-2)
本发明以糠醛为原料经过羧化酶突变体催化一步制得1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮，然后再通过化学氧化制得呋喃铵盐中间体呋喃酮酸，用1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮替代乙酰呋喃用于呋喃铵盐的生产将显著降低呋喃铵盐的生产成本。
为了实现以糠醛为原料制备呋喃铵盐前体物质1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的目的，本发明开发了能够高效催化糠醛与甲醛羧化反应制备1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的羧化酶突变体。本发明从一级结构至高级结构多角度多层系比较了Genbank中ID为WP_016501746.1的羧化酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)与同源酶蛋白的异同，确定了影响羧化酶酶学性质的关键氨基酸位点为第492位氨基酸-缬氨酸，然后通过密码子替换将该位点的缬氨酸(Val)变为脯氨酸(Pro)，得到羧化酶突变体；利用分子克隆技术获得了突变体的编码基因(SEQ ID NO:4)，通过构建突变体基因的6×His融合表达载体并导入基因工程菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达，获得了突变体酶蛋白。
本发明提供了一种催化糠醛羧化制备1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的羧化酶突变体，所述的羧化酶突变体蛋白为非天然蛋白，且羧化酶突变体蛋白具有高效催化糠醛与甲醛反应制备呋喃铵盐前体物质1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的特点。羧化酶突变体是在WP_016501746.1的羧化酶的一个与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变得到。本发明的羧化酶突变体可以高效催化糠醛与甲醛的羧化反应，产物纯度达到95％以上。
本发明的有益效果如下：
本发明的羧化酶突变体实现了以糠醛和甲醛为原料生产呋喃铵盐前体物质1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的高效催化，显著降低了呋喃铵盐的生产成本，产物1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的纯度大大提高。
附图说明
图1是羧化酶突变体在不同宿主中表达的SDS-PAGE电泳图；其中，BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和OverexpressC43(DE3)为三种E.coli蛋白表达宿主，Marker为蛋白质分子量标准。
图2是实施例2制得的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的HPLC图。
图3是常规化学合成的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的HPLC图。
图4是对比例1制得的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的HPLC图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
主要试剂与耗材：PrimeSTAR Max DNA Polymerase(货号：R045A)购买自宝生物工程(大连)有限公司；KOD-Plus-(货号：KOD-201)购买自东洋纺(上海)生物科技有限公司；FastDigestDpnIDNA内切酶(货号：FD1703)、FastDigestNcoI限制性内切酶(货号：FD0574)、FastDigestXhoI限制性内切酶(货号：FD0694)和T4 DNA Ligase(货号：EL0011)，均购买自Thermo Fisher Scientific公司；pET28(a)质粒为已知的大肠杆菌表达载体，载体大小为5369bp，T7启动子，载体标签N-6×His和C-6×His，载体抗性Kanamycin(卡那霉素)，购自Novogen公司；E.coliDH5α感受态细胞(货号：G6016)，E.coliRosetta(DE3)感受态细胞(货号：G6031)，E.coliOverexpressC43(DE3)感受态细胞(货号：X17016)和E.coliBL21(DE3)感受态细胞(货号：G6030)，均购买自昂羽生物公司；琼脂粉(货号：A8190)，购买自Solarbio公司；TRYPTONE(货号：LP0042)和YEASTEXTRACT(货号：LP0021)均购买自OXOID公司，NaCl(货号：10019318)、K2HPO4·3H2O(货号：10017518)、KH2PO4(货号：10017618)和丙三醇(货号：10010618)等试剂均购买自国药集团化学试剂有限公司。
LB培养基
每100mLLB培养基含有：1gTRYPTONE、0.5gYEASTEXTRACT和1gNaCl，pH＝7.0-7.2。配制方法：在1L蒸馏水中溶解10gTRYPTONE、5gYEASTEXTRACT和10gNaCl，不调节pH值。若配制固体培养基，则100mL培养基中加入1.8g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。
TB培养基
每100mLTB培养基含有：1.2gTRYPTONE、2.4gYEASTEXTRACT、0.4mL丙三醇、1.6gK2HPO4·3H2O和0.23gKH2PO4，pH 7.0-7.2。配制方法：在1L蒸馏水中溶解12gTRYPTONE、24gYEASTEXTRACT、4mL丙三醇、16gK2HPO4·3H2O和2.3gKH2PO4，不调节pH值，121℃高压蒸汽灭菌20min。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中使用的方法均为本领域常规方法，使用的实验条件均为本领域常规实验条件，可参考相关实验手册或厂商说明书。
实施例1
一、羧化酶突变体设计
通过基因挖掘，从NCBI数据库中筛选获得了Genbank ID为WP_016501746.1的羧化酶基因，该基因的开放阅读框全长1587bp，其编码的羧化酶由528个氨基酸组成，其氨基酸序列(528aa)为SEQ ID NO:1，编码该羧化酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
通过从一级结构至高级结构的多角度多层系比较该羧化酶与同源酶蛋白的异同，确定了影响羧化酶酶学性质的关键氨基酸位点为该羧化酶的第492位氨基酸，第492位氨基酸为缬氨酸(V)，其对应的核苷酸序列为第1474-1476位密码子。将该羧化酶基因序列的第1474-1476处密码子由GTC更改为CCG，从而将氨基酸序列的第492位由原来的缬氨酸(V)替换成脯氨酸(P)，得到酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
二、羧化酶突变体基因的获得
羧化酶突变体基因可以通过全基因合成方法或分子克隆方法获得。本实验采用全基因合成方法获得Genbank ID为WP_016501746.1的羧化酶基因，采用PCR法获得羧化酶突变体基因。
1、WP_016501746.1的羧化酶全基因合成
对Genbank ID为WP_016501746.1的羧化酶进行全基因合成，合成后的基因片段连入pUC57质粒中，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述基因。
2、羧化酶基因定点突变
(1)定点突变引物设计
对羧化酶突变体基因序列(SEQ ID NO:4)设计引物，引入定点突变。引物的核苷酸序列如下：上游引物V-492-P-F：5′-CCAAGGGCTATGGTCCGCAAGCGCTGAAAG-3′(SEQ ID NO:5)，下游引物V-492-P-R：5′-CGGCTTTCAGCGCTTGCGGACCATAGCCCT-3′(SEQ ID NO:6)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物。
(2)定点突变
以含有WP_016501746.1的羧化酶基因的pUC57质粒为模板，采用步骤(1)获得的上游引物和下游引物，按照下列PCR体系和程序扩增羧化酶突变体基因。PCR体系：KOD-Plus-0.5μL，质粒模板0.8μL，上游引物V-492-P-F(10μM)1μL，下游引物V-492-P-R(10μM)1μL，10×PCRBuffer2.5μL，dNTP(2mM)3μL，MgSO4(25mM)1.5μL，ddH2O 14.7μL。PCR程序如下：a.94℃预变性4min；b.94℃变性40sec，68℃退火并延伸7.5min；18个循环；c.68℃延伸20min。使用DpnI酶消化含有WP_016501746.1的羧化酶基因的模板质粒，37℃，消化30min。
(3)DH5α感受态细胞转化
将步骤(2)获得的含有羧化酶突变体基因的pUC57质粒转化到DH5α感受态细胞中。将DH5α感受态细胞放置于冰上，待细胞融化后加入10μL质粒溶液，冰上放置30min；42℃热激50s，然后冰上静置3min；加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床中培养1h；吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性(50μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(4)阳性克隆筛选
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养，用于质粒提取。使用OMEGA Plasmid Mini Kit I(货号：D6943)按照说明书提取质粒，并将提取后的质粒送金唯智(中国，苏州)公司测序，鉴定WP_016501746.1的羧化酶是否突变成功。
3、羧化酶突变体基因克隆
(1)克隆引物设计
用于羧化酶突变体基因克隆引物的核苷酸序列如下：上游引物NcoI-F：5′-CATGATGGCTTCGGTACACGGCACCAC-3′(SEQ ID NO:7)，下游引物XhoI-R：5′-CCGCTCGAGCTTCACCGGGCTTACGGTGCT-3′(SEQ ID NO:8)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物。
(2)基因克隆
以含有羧化酶突变体基因的pUC57质粒为模板，采用步骤(1)获得的上游引物和下游引物，按照下列PCR体系和程序扩增羧化酶突变体基因。PCR体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，质粒模板0.5μL，上游引物NcoI-F(10μM)2μL，下游引物XhoI-R(10μM)2μL，补ddH2O至总体积为50μL。PCR程序如下：a.98℃预变性2min；b.98℃变性10sec，65℃退火10sec，72℃延伸30sec；30个循环；c.72℃延伸3min。使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到大小约为1600bp的目的条带。在紫外灯下切取目的条带，使用Omega GelExtraction Kit(货号：D2500)，按照试剂盒说明书回收羧化酶突变体基因片段。
(3)表达载体构建
利用NcoI和Xho I限制性内切酶分别对羧化酶突变体基因和pET28(a)载体进行双酶切。酶切体系(基因)：羧化酶突变体基因25μL，NcoI酶2μL，Xho I酶2μL，10×Buffer 5μL，补无菌双蒸水至体系为50μL。酶切体系(载体)：pET28(a)载体2μL，NcoI酶0.5μL，XhoI酶0.5μL，10×Buffer 1μL，补无菌双蒸水至体系为10μL。酶切条件：37℃酶切30min。然后使用T4DNA连接酶连接经过双酶切后的羧化酶突变体基因和pET28(a)线性载体，16℃连接过夜，得到含有羧化酶突变体基因的pET28(a)质粒。
(4)DH5α感受态细胞转化
将步骤(3)获得的含有羧化酶突变体基因的pET28(a)质粒转化到DH5α感受态细胞中。将DH5α感受态细胞放置于冰上，待细胞融化后加入10μL质粒溶液，冰上放置30min；42℃热激50s，然后冰上静置3min；加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床中培养1h；吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性(50μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(5)阳性克隆筛选
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养，用于质粒提取。使用OMEGA Plasmid Mini Kit I按照说明书提取质粒，并将提取后的质粒送金唯智(中国，苏州)公司测序，鉴定羧化酶突变体基因表达载体是否构建成功。
4、羧化酶突变体6×His融合蛋白的异源表达
(1)蛋白表达感受态细胞转化
从-80℃超低温冰箱中分别取出E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)和OverexpressC43(DE3)感受态细胞，冰上放置。待细胞融化后，分别向每种感受态细胞中加入1μL含有羧化酶突变体基因的pET28-(a)质粒，冰上放置30min；42℃热激50s，然后冰上放置3min；加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养1h；吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性(50μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(2)羧化酶突变体表达菌株保存
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养，用作羧化酶突变体的表达菌株。向菌液中加入终体积浓度为15％的无菌丙三醇，-80℃超低温冰箱中长期保存。
(3)蛋白表达
a.种子摇瓶培养：将100μL羧化酶突变体的表达菌株接种入50mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm培养8h，得到羧化酶突变体的表达种子瓶菌液。b.发酵摇瓶培养：将10mL羧化酶突变体的表达种子瓶菌液接种入350mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm；待OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.3mM的无菌IPTG，28℃，200rpm诱导培养20h，得到酶液。c.将酶液进行SDS-PAGE检测，鉴定其分子量大小，结果见图1。SDS-PAGE检测结果显示三种宿主中羧化酶突变体均表达成功，羧化酶突变体分子量约为57.4kDa，其中羧化酶突变体在BL21(DE3)宿主中的表达量最高。d.4000rpm离心12min收集已大量表达羧化酶突变体的BL21(DE3)菌体。
实施例2
1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的合成
底物溶液采用pH7.0的纯水配制，为了防止高浓度糠醛和甲醛对酶的影响，采用流加底物进行反应，反应底物终浓度为40g/L的糠醛和40g/L的甲醛，反应温度30℃，实施例1中的羧化酶突变体(采用大肠杆菌BL21(DE3)制备的羧化酶突变体)用量为10g/L，反应12h后离心(8000rpm离心2min)获得产品。HPLC检测产品纯度，HPLC结果见图2，1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的保留时间为6.77min，产品纯度95.5％。
对常规化学合成的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮进行HPLC检测，HPLC结果见图3，1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的保留时间为6.785min。通过将图2与图3进行对比，证明实施例2最终得到的产品是1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮。
实施例3
1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的合成
底物溶液采用pH7.0的纯水配制，采用流加底物进行反应，反应底物终浓度为20g/L的糠醛和20g/L的甲醛，反应温度37℃，实施例1中的羧化酶突变体(采用大肠杆菌BL21(DE3)制备的羧化酶突变体)用量为10g/L，反应8h后离心(8000rpm离心2min)获得产品。HPLC检测产品纯度，产品纯度95.9％。
实施例4
1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的合成
底物溶液采用pH7.0的纯水配制，采用流加底物进行反应，反应底物终浓度为60g/L的糠醛和60g/L的甲醛，反应温度32℃，实施例1中的羧化酶突变体(采用大肠杆菌BL21(DE3)制备的羧化酶突变体)用量为10g/L，反应20h后离心(8000rpm离心2min)获得产品。HPLC检测产品纯度，产品纯度97.1％。
对比例1
WP_016501746.1的羧化酶催化反应验证
以糠醛和甲醛反应体系进行验证，验证体系为1mL，WP_016501746.1的羧化酶的浓度为10g/L，底物浓度为10g/L的糠醛和10g/L的甲醛，反应缓冲液为pH 7.0的水，30℃反应8h后，离心(8000rpm离心2min)获得样品，采用高效液相检测样品生成情况。检测方法：HPLC仪器型号：岛津LC 2030C。参数设置：色谱柱：Inertsil ODS-3V(4.6×250mm)；波长274nm，柱温30℃；流动相：A相为磷酸缓冲盐，磷酸二氢钾2.73g溶于1000ml水，用稀磷酸调至2.8；B相为乙腈；流速1mL/min。根据峰面积确定样品中1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的纯度。经过检测，WP_016501746.1羧化酶能够催化糠醛羧化生成1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮，HPLC结果见图4，1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的保留时间为6.77min，产品液相纯度66.1％。
实施例2-4合成的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮纯度高达95.5％以上，较对比例1合成的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮纯度66.1％提高1.44倍以上，在呋喃铵盐的工业生产中有巨大的应用潜力和价值。
序列表
<110> 山东金城医药研究院有限公司
<120> 羧化酶突变体及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 528
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
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Ile Asp Thr Val Phe Gly Asn Pro Gly Ser Asn Glu Leu Pro Phe Leu
20 25 30
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Cys Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Gln Ala Ser Arg Lys Pro
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Met Ala Ser Met Ala Pro Gln Gly Pro Val Tyr Leu Ser Val Pro Tyr
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Leu Val Lys Ala Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Ala Ile Val Leu Gly
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260 265 270
Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr His Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr
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Ile Phe Val Ile Met Asn Asn Gly Thr Tyr Gly Ala Leu Arg Trp Phe
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<211> 1587
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<213> Artificial
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ttcggcaatc ctggctcgaa cgagctcccg tttttgaagg actttccaga ggactttcga 120
tacatcctgg ctttgcagga agcgtgtgtg gtgggcattg cagacggcta tgcgcaagcc 180
agtcggaagc cggctttcat taacctgcat tctgctgctg gtaccggcaa tgctatgggt 240
gcactcagta acgcctggaa ctcacattcc ccgctgatcg tcactgccgg ccagcagacc 300
agggcgatga ttggcgttga agctctgctg accaacgtcg atgccgccaa cctgccacga 360
ccacttgtca aatggagcta cgagcccgca agcgcagcag aagtccctca tgcgatgagc 420
agggctatcc atatggcaag catggcgcca caaggccctg tctatctttc ggtgccatat 480
gacgattggg ataaggatgc tgatcctcag tcccaccacc tttttgatcg ccatgtcagt 540
tcatcagtac gcctgaacga ccaggatctc gatattctgg tgaaagctct caacagcgca 600
tccaacccgg cgatcgtcct gggcccggac gtcgacgcag caaatgcgaa cgcagactgc 660
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ccattcccta cccgtcatcc ttgcttccgt ggattgatgc cagctggcat cgcagcgatt 780
tctcagctgc tcgaaggtca cgatgtggtt ttggtaatcg gcgctccagt gttccgttac 840
caccaatacg acccaggtca atatctcaaa cctggcacgc gattgatttc ggtgacctgc 900
gacccgctcg aagctgcacg cgcgccaatg ggcgatgcga tcgtggcaga cattggtgcg 960
atggctagcg ctcttgccaa cttggttgaa gagagcagcc gccagctccc aactgcagct 1020
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acactgaacg acatggcccc ggagaatgcg atttacctga acgagtcgac ttcaacgacc 1140
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caagtcatcg ccgtcattgg cgacggatcg gcgaactaca gcattagtgc gttgtggact 1320
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ttgcgatggt ttgccggcgt tctcgaagca gaaaacgttc ctgggctgga tgtgccaggg 1440
atcgacttcc gcgcactcgc caagggctat ggtgtccaag cgctgaaagc cgacaacctt 1500
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Ala Phe Ile Asn Leu His Ser Ala Ala Gly Thr Gly Asn Ala Met Gly
65 70 75 80
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Arg His Val Ser Ser Ser Val Arg Leu Asn Asp Gln Asp Leu Asp Ile
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Pro Phe Pro Thr Arg His Pro Cys Phe Arg Gly Leu Met Pro Ala Gly
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Ile Ala Ala Ile Ser Gln Leu Leu Glu Gly His Asp Val Val Leu Val
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Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr His Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr
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Asn Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Ser Thr Ser Thr Thr Ala Gln Met Trp
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Gln Arg Leu Asn Met Arg Asn Pro Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ala Ala
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gcactcagta acgcctggaa ctcacattcc ccgctgatcg tcactgccgg ccagcagacc 300
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Claims (10)

1.一种羧化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.根据权利要求1所述的羧化酶突变体，其特征在于所述的SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第492位氨基酸由Val突变为Pro得到。
3.根据权利要求2所述的羧化酶突变体，其特征在于所述的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的羧化酶突变体，其特征在于所述的SEQ ID NO:3的编码基因为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一种权利要求1-4任一所述的羧化酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因，得到SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到SEQ ID NO:3的编码基因；
(3)将SEQ ID NO:3的编码基因进行基因克隆，得到含有羧化酶突变体编码基因的质粒；
(4)将含有羧化酶突变体编码基因的质粒导入感受态细胞中，得到羧化酶突变体的表达菌株；
(5)羧化酶突变体的表达菌株进行诱导发酵，得到羧化酶突变体。
6.根据权利要求5所述的羧化酶突变体的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的定点突变的引物序列如下：
上游引物V-492-P-F：5′-CCAAGGGCTATGGTCCGCAAGCGCTGAAAG-3′，
下游引物V-492-P-R：5′-CGGCTTTCAGCGCTTGCGGACCATAGCCCT-3′。
7.根据权利要求5所述的羧化酶突变体的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的基因克隆的引物序列如下：
上游引物NcoI-F：5′-CATGATGGCTTCGGTACACGGCACCAC-3′，
下游引物XhoI-R：5′-CCGCTCGAGCTTCACCGGGCTTACGGTGCT-3′。
8.一种权利要求1-4任一所述的羧化酶突变体的应用，其特征在于以羧化酶突变体为催化剂，糠醛和甲醛为底物，进行催化反应，得到1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮。
9.根据权利要求8所述的羧化酶突变体的应用，其特征在于所述的糠醛的浓度为20-60g/L，甲醛的浓度为20-60g/L，羧化酶突变体的用量为8-12g/L。
10.根据权利要求8所述的羧化酶突变体的应用，其特征在于所述的催化反应的温度为20-37℃，催化反应的pH＝6.0-8.0，催化反应的时间为8-20h。
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