CN108690837B - 一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶 - Google Patents
一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶，属于酶工程技术领域。提高多聚体蛋白热稳定性的方法为通过在N端相邻（8Å范围内）的多聚体蛋白的N端和内部亚基接触界面间引入共价键的方式，使多聚体蛋白的各个亚基链接起来，形成一个环合的整体。热稳定性提高的醇脱氢酶的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4，这些醇脱氢酶与野生型相比T50 15值分别提高了5.5℃、6.0℃和18℃。本发明避免了现有技术中面临的筛选工作量大和过程繁琐等问题，同时通过界面间二硫键引入的策略使定点突变更有针对性。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法，以及利用该方法获得的热稳定性提高的醇脱氢酶。
背景技术
酶又被看作是功能性蛋白，可以在非常温和的条件下催化化学反应，并且具有很高的选择性。因为绿色、经济和可持续的优点，因此酶在工业应用上备受青睐(U.T.Bornscheuer et al.Nature，2012，485：185-194)。此外，在药学领域中，一些蛋白如抗体等由于其非常高的选择性而被广泛用作疾病治疗(R.V.J.Chari etal.Angew.Chem.Int.Ed.，2014，53：3796-3827)。然而尽管具有很高选择性和催化活性等优点，蛋白在非生理条件下通常具有较低的稳定性，容易导致失活(R.Fernandez-Lafuente,Enzyme Microb.Tech.，2009，45：405-418)。酶的这种不稳定性的缺点是阻碍其在工业和医药应用的最重要因素之一，因此，对蛋白稳定性的改进长期以来一直是一个重点和难点(H.P.Modarresac et al.RSC Adv.，2016，6：115252-115270)。
从结构组成来分，蛋白分为单聚体和多聚体；其中多聚体蛋白由两个及两个以上的同源或异源亚基组成。绝大多数情况下，这些亚基是通过亚基接触界面间的关键氨基酸的疏水作用或静电作用(形成盐桥)稳定在一起的(H.Yu et al.Biotechnol.Adv.，2014，32：308-315；T.J.Magliery et al.Struct.Biol.，2015，33，161-168)。对于单聚体或多聚体蛋白的单个亚基的稳定性，主要受内部结构柔性和表面静电相互作用影响。这种缺点可以通过蛋白工程手段增加蛋白骨架结构的刚性或优化表面电荷分布来克服(A.V.Gribenkoet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2009，106：2601-2606；M.T.Reetz etal.Angew.Chem.Int.Ed.，2006，45：7745-7751)。因此，针对单聚体蛋白，目前的方法主要有向柔性位点或表面静电位点引入有益突变或通过N-末端和C-末端共价环化主链来改善其稳定性(C.Schoene et al.Angew.Chem.Int.Ed.，2014，53：6101-6104)。不同于单聚体蛋白，在多聚体蛋白中，蛋白失活的第一步也是最关键的步骤是各个亚基的解离；因此，如何阻止亚基解离是稳定这类复杂蛋白的最关键的因素。当前针对稳定多聚体蛋白亚基相互作用的方法，主要集中于向位于蛋白内部的亚基接触界面间引入有益突变，以增强界面间的相互作用(A.Bosshart et al.Angew.Chem.Int.Ed.，2013，52：9673-9676)。多聚体蛋白由于拥有更多的数量和功能多样性(如氧化还原和氨基转移)，对工业和医药应用具有更强的吸引力。因此，开发新的有效方法来提高多聚蛋白的稳定性具有非常重要的意义。
蛋白质的末端通常是骨架最灵活的部分，而且容易成为蛋白水解酶的靶点。在单聚体蛋白中，末端的连接被证明能够显著提高蛋白质的稳定性。有趣的是，在许多工业上发挥着重要用途的多聚蛋白家族，例如短链脱氢酶/还原酶(SDR)中，它们的每个亚基都是以高度有序的方式结合在一起的，形成多个对称面；除了内部的亚基界面外，每个亚基的末端都靠的很近形成了一个位于端位的亚基界面，因此理论上可以通过共价键的方式将其末端和内部的界面链接起来(N.Tanaka et al.Curr.Org.Chem.，2001，5：89-111)。单聚体蛋白由于不存在亚基的解离，因此通常比多聚体蛋白要稳定的多。
SDR蛋白家族，如ADHs(醇脱氢酶)、KRs(酮基还原酶)、GDHs(葡萄糖脱氢酶)和HHDHs(卤代醇脱卤酶)在工业和合成生物学工程中非常有用(Bommarius etal.Curr.Opin.Chem.Biol.，2011,15:194-200；M.T.Reetz J.Am.Chem.Soc.，2013,135:12480-12496)。在制药工业中，羟基被认为是最重要的官能团之一，因为它不仅可以容易地转化成许多其他的官能团，并且它是最容易通过生物催化来获得光学纯形式的(M.TruppoComprehensive Organic Synthesis(2nd Edition)，2014，15：317-327)。许多AHDs和KRs具有非常好的选择性并且可以接受不同的酮基底物以产生手性羟基化合物；通过利用ADHs和KRs，如今已经有一百多种重要的羟基中间体被商业化了；事实上，在已报告的工业生物转化中约30％采用了ADHs和KRs(M.T.Reetz J.Am.Chem.Soc.，2013,135:12480-12496；M.Truppo Comprehensive Organic Synthesis(2nd Edition)，2014，15：317-327；A.J.J.Straathof et al.Curr.Opin.Biotech.，2002，13：548-556)。这些中间体已经用于制造许多重磅药物，如氯吡格雷(2011年度销售额6.5亿美元)和立普妥(2011年销售额7.4亿美元)。在合成生物学研究中，KRs和ADHs是许多天然产物和生物燃料生物合成的枢纽机制(M.T.Reetz J.Am.Chem.Soc.，2013,135:12480-12496)。除SDRs家族外，大量工业上感兴趣的其他多聚体蛋白家族，如亮氨酸脱氢酶(Y.Zhao et al.J.Mol.Catal.B:Enzym.，2012，83：65-72)和模块化的PKS(聚酮合酶)(S.Dutta et al.Nature，2014，510：512-517)其亚基排列方式也是有序的，它们的末端和内部界面间的距离在通过共价连接可达到的范围内。
来自于Leifsonia sp.S749的醇脱氢酶(LsADH)是近期发现的一种新型还原酶。通常来说，醇脱氢酶催化反应需要利用辅因子NADPH，然而不同寻常的是LsADH的辅因子为NADH。NADH的价格只有NADPH的1/5，因此具有较大的优势。此外LsADH还能对包括诸多医药中间体前体在内的几十种底物显示出优异的催化活性和光学选择性，因此LsADH相比于工业上使用的其它的醇脱氢酶显示出很大的优势(K.Inoue,et al.Tetrahedron:Asymmetry，2005，16：2539-2549；K.Inoue,et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2006，70：418-426)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种高效的提高多聚体蛋白稳定性的方法。本发明的目的还在于提供利用该方法改造后获得的热稳定性提高的醇脱氢酶突变体。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法，通过在N端相邻(
范围内)的多聚体蛋白的N端和内部亚基接触界面间引入共价键的方式，使多聚体蛋白的各个亚基链接起来，形成一个环合的整体。该方法为通过内部亚基间环化(ISC)的策略来提高多聚体蛋白的稳定性，该策略以序列比对、同源建模以及二硫键预测软件为手段找出可能的相关的关键氨基酸，然后用酶工程的手段将这些重要位点突变为半胱氨酸，使位于不同亚基上的半胱氨酸之间能够自发的形成二硫键，于是将多聚体蛋白的各个亚基链接起来，让本来易于解离的亚基通过共价键的方式牢牢的聚合在一起。经过这样改造后的多聚体蛋白，可以变成类似于单聚体的形式，极大的增强其稳定性。
所述的多聚体蛋白指单个蛋白分子中包含有多个亚基，可以是含有二个亚基、三个亚基、四个亚基及其他的高级聚合体；这些亚基可以是同源的，也可以是异源的。
所述的提高多聚体蛋白稳定性的方法具体包括如下步骤：
(1)通过在PDB数据库中找出与稳定性待提高的N端相邻(在
范围内)的多聚体蛋白同源性较高的蛋白，再以其为模板进行同源建模；通过对其蛋白结构进行分析，找出位于多聚体蛋白N端能在亚基接触界面A上形成二硫键的突变位点。
(2)通过蛋白二硫键预测软件，找出位于多聚体蛋白内部能在亚基接触界面B上形成二硫键的突变位点。
(3)构建位于多聚体蛋白N端能在亚基接触界面A上形成二硫键的突变体并验证其热稳定性。
(4)构建位于多聚体蛋白内部能在亚基接触界面B上形成二硫键的突变体并验证其热稳定性。
(5)将位于多聚体蛋白N端和内部界面上能形成二硫键的突变体组合起来，获得亚基之间通过二硫键环合成一个类似于单体结构的热稳定性得到提高的多聚体蛋白突变株。
本发明选择了从菌株Leifsonia aquatica ATCC 14665中克隆的一条与LsADH同源的醇脱氢酶LnADH基因；醇脱氢酶LnADH(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)与LsADH的差别只有三个氨基酸分别为G78A、T111K和D202E。随后根据上述亚基间环化的策略，通过使用四聚体蛋白LnADH(含有亚基接触界面A、B)作为模型，向位于亚基接触界面A的N端和亚基接触界面B内部两个位点，引入二硫键链接，将LnADH变成一个类似于单聚体蛋白的突变体。通过这种改造，获得了一组热稳定性得到较大提升的醇脱氢酶突变体，使其更有利于其在工业化中的应用。
一种稳定性提高的醇脱氢酶突变体，为氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的LnADH-CT、LnADH-CI或LnADH-CTI，相应的编码基因核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。这些醇脱氢酶突变体由醇脱氢酶LnADH出发，通过定点突变获得。采用“原始氨基酸-位置-替换氨基酸”来表示醇脱氢酶突变体中突变的氨基酸，这些醇脱氢酶突变体突变情况见下表1：
表1
| 醇脱氢酶 | 氨基酸取代位置 |
| LnADH | |
| LnADH-C<sub>T</sub> | 2Cys(插入) |
| LnADH-C<sub>I</sub> | Ser155Cys/Asn170Cys |
| LnADH-C<sub>TI</sub> | 2Cys(插入)/Ser155Cys/Asn170Cys |
与亲本醇脱氢酶LnADH相比，这些醇脱氢酶突变体的热稳定性得到了较大的提高，以T50 15(在某一温度下温育15min，酶活降为初始酶活50％的温度)值来表示热稳定性的提高。所述醇脱氢酶T50 15值如下表2：
表2
| 醇脱氢酶 | 氨基酸取代位置 | T<sub>50</sub><sup>15</sup>(℃) |
| LnADH | 43.5 | |
| LnADH-C<sub>T</sub> | 2Cys(插入) | 49.0 |
| LnADH-C<sub>I</sub> | Ser155Cys/Asn170Cys | 49.5 |
| LnADH-C<sub>TI</sub> | 2Cys(插入)/Ser155Cys/Asn170Cys | 61.5 |
本发明的有益效果是：本发明以四聚体醇脱氢酶LnADH为研究对象，在计算机辅助设计的基础上通过对该四聚体蛋白的亚基界面进行分析。在位于该四聚体蛋白A界面上的N-端以及位于该四聚体蛋白B界面上的蛋白内部引入共价二硫键，使该四聚体蛋白环化成一个类似于单体蛋白的结构。通过增加四聚体蛋白单体之间的相互作用来提高四聚体蛋白醇脱氢酶的稳定性。该方法避免了现有技术中面临的筛选工作量大和过程繁琐等问题，同时通过界面间二硫键引入的策略使定点突变更有针对性。通过本发明的方法得到的突变体LnADH-CT、LnADH-CI和LnADH-CTI，其T50 15值分别提高了5.5℃、6.0℃和18℃。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。同时，该方法还为其他多聚体蛋白的稳定性的提高提供了新的思路，如背景技术中提及的SDR蛋白家族、亮氨酸脱氢酶、聚酮合酶等可通过该方法进行改造提高稳定性。
附图说明
图1是筛选稳定性提高的醇脱氢酶突变株的方法示意图。
图2是同源建模出的LnADH三维模拟结构的亚基接触界面A和亚基接触界面B的示意图。
图3是通过内部环化的方式使醇脱氢酶形成的类似于单体蛋白的结构示意图。
图4是野生型的醇脱氢酶及四聚体醇脱氢酶N端位于界面A上能形成二硫键的突变株相对于野生型的相对酶活柱状统计图。
图5是野生型的醇脱氢酶及四聚体醇脱氢酶N端位于界面A上能形成二硫键的突变株在50℃温育15min之后相对于温育之前的残余酶活百分比柱状统计图。
图6是野生型的醇脱氢酶及四聚体醇脱氢酶内部位于界面B上能形成二硫键的突变株相对于野生型的相对酶活柱状统计图。
图7是野生型的醇脱氢酶及四聚体醇脱氢酶内部位于界面B上能形成二硫键的突变株在42℃温育30min之后相对于温育之前的残余酶活百分比柱状统计图。
图8是野生型的醇脱氢酶及三种突变体酶相对于野生型的相对酶活柱状统计图。
图9是野生型的醇脱氢酶及三种突变体酶在45℃、50℃和55℃温育15min之后的残余酶活百分比柱状统计图。
图10是野生型的醇脱氢酶及三种突变体酶T50 15值的测定曲线图。
图11是野生型的醇脱氢酶及三种突变体酶的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，M为蛋白分子量标准，泳道1为野生型的醇脱氢酶LnADH，泳道2为突变体LnADH-CT(2位插入Cys)，泳道3为突变体LnADH-CI(Ser155Cys/Asn170Cys)，泳道4为突变体LnADH-CTI(2位插入Cys/Ser155Cys/Asn170Cys)；其中A为还原性的SDS-PAGE凝胶电泳图，B为非还原性的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明提供一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法，该方法为在N端相邻(
范围内)的多聚体蛋白的N端和内部亚基接触界面间引入共价键的方式，使多聚体蛋白的各个亚基链接起来，形成一个环合的整体。该方法为通过内部亚基间环化(ISC)的策略来提高多聚体蛋白的稳定性，该策略以序列比对、同源建模以及二硫键预测软件为手段找出可能的相关的关键氨基酸，然后用酶工程的手段将这些重要位点突变为半胱氨酸，使位于不同亚基上的半胱氨酸之间能够自发的形成二硫键，于是将多聚体蛋白的各个亚基链接起来，让本来易于解离的亚基通过共价键的方式牢牢的聚合在一起。利用该方法，本发明以LnADH为例，在LnADH的N端仅次于甲硫氨酸的地方插入半胱氨酸，使其在亚基接触界面A上形成二硫键；同时，将LnADH第155位的丝氨酸以及170位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，使其在亚基接触界面B上形成二硫键；将两者组合起来，得到了稳定性得到较大提高的LnADH突变株。这种在多聚体蛋白亚基接触界面间引入共价键的方式使多聚体蛋白亚基之间的联系更加紧密，形成类似于单体蛋白，从而使多聚体蛋白的亚基不易解离，达到提高多聚体蛋白热稳定性的目的。
下面以四聚体蛋白－醇脱氢酶LnADH(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)为例按照本发明方法对其进行改造，以筛选得到热稳定性提高的醇脱氢酶突变体蛋白，该筛选方法示意图如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)通过在PDB数据库中找出与该醇脱氢酶LnADH同源性较高的蛋白，再以其为模板进行同源建模；通过对其蛋白结构进行分析，发现LnADH由4个亚基组成，分别命名为α、β、γ和δ(如图2所示)，其中α亚基和β亚基之间以及γ亚基和δ亚基之间共同组成亚基接触界面A(其中位于亚基接触界面A上的氨基酸残基包括Met1-Gln3、Gln169、Ala172、Leu173、Ala176、Ala177、Lys179、Gly188、Phe189、His211-Leu213、Arg215-Gly217、Glu221、Ser224、Leu225、Phe228、Ala233-Gln251)；其中α亚基和γ亚基之间以及β亚基和δ亚基之间共同组成亚基接触界面B(其中位于亚基接触界面B上的氨基酸残基包括Pro69、Ala99-Leu106、Trp109、Arg110、Ile113、Leu117、Asn118、Phe121、Tyr122、Met124、Gln125、Leu128、Ser148-Ala156、Val158、Thr159、His162-Leu167、Gln169-Ala171、Leu173-Tyr175)；找出位于四聚体蛋白LnADH的N-端(
范围内)能在界面A上形成二硫键的突变位点。
(2)通过蛋白二硫键预测软件，找出能在四聚体蛋白醇脱氢酶LnADH亚基接触界面B上形成二硫键的突变位点。
(3)构建位于醇脱氢酶LnADH亚基接触界面A上形成二硫键的突变体并验证其热稳定性。
(4)构建位于醇脱氢酶LnADH亚基接触界面B上形成二硫键的突变体并验证其热稳定性。
(5)将亚基接触界面A和亚基接触界面B上形成二硫键的突变体组合起来，获得亚基之间通过二硫键环合成一个类似于单体结构的(如图3所示)热稳定性得到提高的醇脱氢酶突变株。
实施例1
本实施例用于说明上述步骤(1)通过在PDB数据库中找出与醇脱氢酶LnADH(SEQIDNO.1)同源性较高的蛋白，再以其为模板进行同源建模；通过对其蛋白结构进行分析，找出位于四聚体蛋白LnADH的N-端能在界面A上形成二硫键的突变位点。具体方法为：通过检索蛋白数据库RCSB数据库，经blast对比，找到与该醇脱氢酶具有高度同源的蛋白4URE(PDB编号，49％同源性)，使用软件Discovery Studio 4.0以4URE为模板，对该醇脱氢酶进行同源建模。通过对其结构进行分析，发现其位于A界面上的两个亚基的N端距离很近，只有
的距离。于是设计出几种在N端插入Cys的方式：a.在起始密码子编码的甲硫氨酸的后面加入CysGlyGlySerGly氨基酸序列(LnADH-CTLinker)；b.在起始密码子编码的甲硫氨酸的后面加入Cys(LnADH-CT)；c.在LnADH-CT的基础上，在Cys的后面去掉一个Ala(LnADH-CT-dA)；d.在LnADH-CT的基础上，在Cys的后面去掉AlaGln(LnADH-CT-dAQ)；e.在LnADH-CT的基础上，在Cys的后面去掉AlaGlnTyr(LnADH-CT-dAQY)。
实施例2
本实施例用于说明上述步骤(2)通过蛋白二硫键预测软件，找出能在四聚体蛋白醇脱氢酶LnADH界面B上形成二硫键的突变位点。具体方法为：通过DSDBASE数据库的“定点突变”在线程序(http://caps.ncbs.res.in/dsabase//mainFrame.html)来计算预测出可能的二硫键引入位点。通过筛选排除，最后得到了打分比较高的6组位于四聚体蛋白界面B上能形成二硫键的突变位点，分别为Val101Cys/Ala171Cys(V101C/A171C)、Thr159Cys/Ala163Cys(T159C/A163C)、Thr159Cys/Leu167Cys(T159C/L167C)、His162Cys(H162C)、Ser155Cys/Asn170Cys(S155C/N170C)、Thr100Cys/Glu174Cys(T100C/E174C)。
实施例3
本实施例用于说明上述步骤(3)构建醇脱氢酶LnADH亚基接触界面A上形成二硫键的突变体并验证其热稳定性。具体方法为：通过醇脱氢酶LnADH的基因序列GenBank登录号为(ERK72999.1)设计引物，通过PCR扩增得到醇脱氢酶基因。所采用的试验方法包括PCR技术、DNA提取、酶切、酶连等分子克隆操作技术。以Leifsonia aquatica ATCC 14665基因组DNA为模板，扩增出醇脱氢酶LnADH的基因序列，把这段目的基因连接到质粒pET28aNdeI-HindIII位点中，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，确定其酶活性质。具体过程如下：
1)醇脱氢酶菌株的培养
将菌株Leifsonia aquatica ATCC 14665接种于LB培养基(胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中。然后置于37℃恒温摇床培养12h，离心菌体用于提取总DNA。
2)醇脱氢酶基因及其突变基因的克隆与表达
从NCBI上报导的序列，设计如下PCR引物：
LnADH-for：5’-GGAATTCCATATGGCTCAGTACGACGTCGCCG-3’(NdeI)，
LnADH-rev：5’-CCCAAGCTTCACTGAGCGGTGTAGCCGCCG-3’(HindIII)。
上下游引物的5’端分别设计了NdeI和HindIII的酶切位点，用于连接到表达载体pET28a上。以该醇脱氢酶的基因组DNA进行PCR，所用的DNA聚合酶为PrimeSTAR Max DNAPolymerase(Takara)，PCR条件如下：98℃变性10S，58℃退火15S，72℃延伸30S，30个循环；72℃延伸10min。
将PCR产物进行电泳检测，得到的片段约800bp，与预期结果相符，然后将得到的片段用NdeI和HindIII双酶切处理回收之后连接到用NdeI和HindIII双酶切处理好的载体pET28a上，将酶连产物转化到大肠杆菌DH5α的感受态中，送测序，筛选验证得到重组表达质粒LnADH。
把表达重组质粒LnADH转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞中。挑取转化子于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养2～3h，待OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM。将其置于25℃摇床上继续培养10～12h进行诱导表达。
发酵液离心收集菌体，用发酵液1/10体积的HEPES缓冲液重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，至菌液澄清后，在12000rpm的条件下4℃离心40min，收集上清，所收集的上清即为醇脱氢酶的粗酶液。
通过分子生物学技术构建醇脱氢酶N端的位于界面A上的突变体。采用和上面相同的方法进行扩增。
构建这些突变体所用的引物如下表3：
表3
以LnADH为模板，D-for和T7-rev为引物，将PCR扩增产物构建到载体pET28a上得到突变表达质粒LnADH-CTLinker；
以LnADH为模板，E-for和T7-rev为引物，将PCR扩增产物构建到载体pET28a上得到突变表达质粒LnADH-CT；
以LnADH为模板，Ca-for和T7-rev为引物，将PCR扩增产物构建到载体pET28a上得到突变表达质粒LnADH-CT-dA；
以LnADH为模板，Caq-for和T7-rev为引物，将PCR扩增产物构建到载体pET28a上得到突变表达质粒LnADH-CT-dAQ；
以LnADH为模板，Caqy-for和T7-rev为引物，将PCR扩增产物构建到载体pET28a上得到突变表达质粒LnADH-CT-dAQY；
这些突变蛋白的发酵以及表达过程同LnADH。
测定蛋白浓度：采用Bradford的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线，测量原始菌株和各突变菌株的蛋白含量。
测定蛋白酶活：将表达LnADH、LnADH-CTLinker、LnADH-CT、LnADH-CT-dA、LnADH-CT-dAQ、LnADH-CT-dAQY的菌株转接到含有卡那霉素的LB培养基中，加IPTG诱导表达。离心收集细胞，破菌，上清液过Ni柱进行分离纯化。测定野生型LnADH和各突变体蛋白的酶活性。计算出各突变株相对于野生型LnADH的相对酶活。
测酶活总体系1mL(2mM 4-氯乙酰乙酸乙酯，0.1mM NADH，100mM pH7.0的KH2PO4/K2HPO4的缓冲液，适量的酶)，通过测定NADH在340nm处吸光度的变化来测定酶活。各个突变株相对于野生型LnADH的酶活没有太大变化，所测出各突变株相对于野生型LnADH的相对酶活百分比如图4和下表4：
表4
测定各突变株的稳定性：将野生型LnADH和上述各突变株放在50℃温育15min后，冷却至室温再在30℃测定各个酶的残余酶活，计算出各个酶温育前后的残余酶活百分比(温育后的酶活/温育前的酶活)。所测各个酶残余酶活百分比如图5和下表5：
表5
| 醇脱氢酶 | 各个酶的残余酶活百分比 |
| LnADH | 0.11％ |
| LnADH-C<sub>TLinker</sub> | 0.98％ |
| LnADH-C<sub>T</sub> | 20.00％ |
| LnADH-C<sub>T-dA</sub> | 1.09％ |
| LnADH-C<sub>T-dAQ</sub> | 10％ |
| LnADH-C<sub>T-dAQY</sub> | 0.97％ |
实验结果说明50℃温育15min之后，野生型LnADH已基本丧失活性，而LnADH-CT却还有20％的活性。因此筛选得到了在不影响酶活的情况下稳定性有较大提升的突变株LnADH-CT。
实施例4
本实施例用于说明上述步骤(4)构建醇脱氢酶LnADH界面B上形成二硫键的突变体并验证其热稳定性。具体方法为：以醇脱氢酶LnADH为模板，通过PCR扩增突变的醇脱氢酶基因。所采用的试验方法包括PCR技术、Overlap PCR技术、DNA提取、酶切、酶连等分子克隆操作技术。将得到的含有突变的目的基因连接到质粒pET28a上，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，确定其酶活性质。具体过程如下：
Val101Cys/Ala171Cys突变株的构建
设计如下表6所示引物：
表6
首先，以质粒LnADH为模板，以T7-for/V101C-rev引物对和V101C-for/T7-rev引物对分别PCR出V101C的上下两个片段，将这两个片段回收之后，以这两个片段为模板，用T7-for/T7-rev引物对PCR出全长片段。再以PCR出的全长片段为模板(即V101C)，以T7-for/A171C-rev引物对和A171C-for/T7-rev引物对分别PCR出V101C/A171C的上下两个片段，将这两个片段回收之后，再以这两个片段为模板，用T7-for/T7-rev引物对PCR出全长片段。然后将得到的片段用NdeI和HindIII双酶切处理回收之后连接到用NdeI和HindIII双酶切处理好的载体pET28a上，将酶连产物转化到大肠杆菌DH5α的感受态中，送测序，筛选验证得到突变重组表达质粒V101C/A171C。通过同样的方法得到突变重组表达质粒S155C/N170C和T100C/E174C。
以质粒LnADH为模板，以T7-for/T159C-A163C-rev引物对和T159C-A163C-for/T7-rev引物对分别PCR出T159C-A163C(这两个突变位点由于隔得比较近，所以设计在一条引物上面)的上下两个片段，将这两个片段回收之后，以这两个片段为模板，用T7-for/T7-rev引物对PCR出全长片段。然后将得到的片段用NdeI和HindIII双酶切处理回收之后连接到用NdeI和HindIII双酶切处理好的载体pET28a上，将酶连产物转化到大肠杆菌DH5α的感受态中，送测序，筛选验证得到突变重组表达质粒T159C/A163C。通过同样的方法得到突变重组表达质粒T159C/L163C和H162C。
构建这些突变体所用的引物如下表7：
表7
蛋白表达纯化方法、蛋白浓度测定方法和蛋白酶活测定方法同实施例3。
测定蛋白酶活：测定野生型的LnADH和各突变株(V101C/A171C，T159C/A163C，T159C/L167C，H162C，S155C/N170C，T100C/E174C)的酶活性，计算出各突变株相对于野生型LnADH的相对酶活。所测出各突变株相对于野生型LnADH的相对酶活百分比如图6和下表8：
表8
| 醇脱氢酶 | 相对于野生型LnADH的酶活 |
| LnADH | 100％ |
| V101C/A171C | 9.55％ |
| T159C/A163C | 1.36％ |
| T159C/L167C | 0.17％ |
| H162C | 1.82％ |
| S155C/N170C | 97.8％ |
| T100C/E174C | 0.61％ |
从表6中可以看出，相对于野生型的LnADH，S155C/N170C这个突变株的酶活基本上没有变化；剩下的5组引入二硫键的突变株，其酶活都有较大程度的降低。
测定各突变株的稳定性：将野生型的LnADH和各突变株(V101C/A171C，T159C/A163C，T159C/L167C，H162C，S155C/N170C，T100C/E174C)表达纯化后放在42℃温育30min后，冷却至室温再在30℃测定其残余酶活力。计算出各个酶温育前后的残余酶活百分比(温育后的酶活/温育前的酶活)。所测各个酶残余酶活百分比如图7和下表9：
表9
| 醇脱氢酶 | 各个酶的残余酶活百分比 |
| LnADH | 5.00％ |
| V101C/A171C | 104.76％ |
| T159C/A163C | 33.33％ |
| T159C/L167C | 50.00％ |
| H162C | 68.75％ |
| S155C/N170C | 100.00％ |
| T100C/E174C | 77.78％ |
从测量结果可以看出，相对于野生型的LnADH，每个突变株的稳定性都有所提升。其中V101C/A171C和S155C/N170C这两个突变稳定性有较大程度的提升。
通过相对酶活和残余酶活的测定筛选出了位于LnADH界面B上能形成二硫键的突变株S155C/N170C(LnADH-CI)，该突变株在不影响酶活性的情况下使其稳定性有了较大程度的提升。
实施例5
本实施例用于说明上述步骤(5)将界面A和界面B上形成二硫键的突变体组合起来，获得亚基之间通过二硫键环合成一个类似于单体结构的热稳定性得到提高的醇脱氢酶突变株。具体方法为：
在LnADH-CT的基础上引入Ser155Cys和Asn170Cys两个突变，得到突变体LnADH-CTI。蛋白表达、蛋白浓度测定以及酶活测定的方法同实施例3。
测定蛋白酶活：测定野生型的LnADH和突变株LnADH-CT、LnADH-CI、LnADH-CTI的酶活性，计算出各突变株相对于野生型LnADH的相对酶活。所测出各突变株相对于野生型LnADH的相对酶活百分比如图8和下表10：
表10
| 醇脱氢酶 | 相对于野生型LnADH的酶活 |
| LnADH | 100％ |
| LnADH-C<sub>T</sub> | 90.00％ |
| LnADH-C<sub>I</sub> | 97.80％ |
| LnADH-C<sub>TI</sub> | 71.38％ |
从表10可以看出，相对于野生型的LnADH，LnADH-CT、LnADH-CI、和LnADH-CTI这几个突变株的酶活稍微有点降低，但降低的程度不大。
野生型LnADH和突变株LnADH-CT、LnADH-CI、LnADH-CTI稳定性测定及比较：
测定野生型LnADH和突变株LnADH-CT、LnADH-CI、LnADH-CTI在45℃、50℃、55℃温育15min之后的残余酶活，计算出各个酶温育前后的残余酶活百分比(温育后的酶活/温育前的酶活)。所测各个酶残余酶活百分比如图9和下表11：
表11
通过上表的实验结果可以看出，同野生型LnADH相比，LnADH-CT、LnADH-CI和LnADH-CTI这三个突变株的稳定性都有了较大程度的提升。其中突变株LnADH-CT和LnADH-CI对稳定性的提升程度相当，主要是因为增加了四聚体醇脱氢酶LnADH亚基之间的相互作用。而当把LnADH-CT和LnADH-CI组合起来之后得到突变株LnADH-CTI，其稳定性有了更大程度的提升。主要原因是这两组突变组合起来之后，通过内部亚基之间的环化作用，四聚体的醇脱氢酶形成了一个类似于单体蛋白的结构，增加了蛋白的刚性和内部亚基之间的相互作用，从而很大程度上提高了酶的稳定性。
野生型LnADH和突变株LnADH-CT、LnADH-CI、LnADH-CTI的T50 15值测定：
将某个酶放在特定的温度下温育15min，温育之后的酶活变为初始酶活的50％，该温度即为该酶的T50 15值。将野生型LnADH和突变株LnADH-CT、LnADH-CI、LnADH-CTI分别放在不同温度下温育15min，然后绘制出各个酶在不同温度下温育15min之后的残余酶活曲线，通过残余酶活曲线计算出LnADH和各突变株的T50 15值。通过测量得出的各酶T50 15值如图10和下表12：
表12
| 醇脱氢酶 | T<sub>50</sub><sup>15</sup>(℃) | 各突变株T<sub>50</sub><sup>15</sup>值的提高值(℃) |
| LnADH | 43.5 | |
| LnADH-C<sub>T</sub> | 49.0 | 5.5 |
| LnADH-C<sub>I</sub> | 49.5 | 6.0 |
| LnADH-C<sub>TI</sub> | 61.5 | 18 |
通过T50 15值的测定，发现在四聚体醇脱氢酶LnADH的界面A上引入共价二硫键或者界面B上引入共价二硫键都使其稳定性有较大的提升。它们的T50 15值分别提高了5.5℃和6.0℃。而当把LnADH-CT和LnADH-CI组合起来之后，它的T50 15值有了更大程度的提升，并远远高于LnADH-CT和LnADH-CI这两个突变株简单加和起来的值。表明通过将四聚体醇脱氢酶内部亚基环合起来使其形成一个类似于单体蛋白的结构在提高酶的稳定性方面起了协同作用。可能原因是四聚体醇脱氢酶各个亚基之间的相互作用以及蛋白刚性的进一步增强。
实施例6
本实施例用于说明通过非还原性的SDS-PAGE来验证通过在四聚体醇脱氢酶的界面间引入二硫键确实能使蛋白两个亚基链接起来。
将各蛋白表达之后，放于4℃过夜，使亚基间自发的形成二硫键。通过普通的12％的SDS-PAGE(图11A)，可以发现LnADH、LnADH-CT、LnADH-CI和LnADH-CTI都展现出相同的条带大小，即单亚基的大小(27KDa)。
非还原性的SDS-PAGE：除了在处理样品的时候不加β-巯基乙醇以及不加热之外，其他都与SDS-PAGE相同。通过非还原性的SDS-PAGE(图11B)，发现对于野生型的LnADH，其跑胶条带大小同SDS-PAGE，表现为单亚基的大小(27KDa)；LnADH-CT的条带大小为54KDa，表明N端具有高度的柔性，它们之间
的距离足以使它们之间形成二硫键；对于LnADH-CI，通过imageJ软件分析，发现只有40％的比例形成了二聚体，中等比例的二聚体的形成可能是因为蛋白内部界面间的空间位阻决定的；对于LnADH-CTI，它本来应该表现出不同于LnADH-CT和LnADH-CI的情况，通过跑胶条带分析，发现它确实不同于野生型的LnADH和LnADH-CI，而其却表现出了类似于LnADH-CT的情况，这可能是分子量和蛋白构象综合起来产生的结果。
上述实施例含本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> Leifsonia aquatica
<400> 1
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1 5 10 15
Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val
35 40 45
Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly
50 55 60
Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Ala Ala Asn
65 70 75 80
Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly
85 90 95
Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Lys Val
100 105 110
Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu
115 120 125
Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser
130 135 140
Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr Ala
145 150 155 160
Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala
165 170 175
Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr
180 185 190
Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Glu Ala Leu Ala Phe Leu Glu
195 200 205
Gly Lys His Ala Leu Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu Val Ala Ser
210 215 220
Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser
225 230 235 240
Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LnADH-CT的氨基酸序列
<400> 2
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Gly Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser
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Gly Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala
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Val Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala
50 55 60
Gly Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Ala Ala
65 70 75 80
Asn Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly
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Val Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln
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Leu Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala
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Ser Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr
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Ala Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr
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Thr Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Glu Ala Leu Ala Phe Leu
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Ser Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
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Thr Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Glu Ala Leu Ala Phe Leu
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gcgctcgccg gcgacgtgac cgaccccgcg ttcggcgagg cgagcgtcgc cgcggcgaac 240
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gtcggcgact actcgctcga cagctggcgc aaggtcatcg aggtcaacct caacgccgtg 360
ttctacggga tgcagccgca gctgaaggcc atggccgcga acggcggcgg tgcgatcgtc 420
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<210> 6
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LnADH-CT编码基因的核苷酸序列
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Claims (6)
1.一种稳定性提高的醇脱氢酶突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
3.一种稳定性提高的醇脱氢酶突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.编码权利要求3所述的醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
5.一种稳定性提高的醇脱氢酶突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.编码权利要求5所述的醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN201710237756.1A CN108690837B (zh) | 2017-04-12 | 2017-04-12 | 一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶 |
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