CN112899255B

CN112899255B - Dna聚合酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用

Info

Publication number: CN112899255B
Application number: CN202110247548.6A
Authority: CN
Inventors: 马富强; 杨晟; 白雪; 郭天杰; 王志耘; 杨广宇
Original assignee: Suzhou Hanyuan New Enzyme Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Hanyuan New Enzyme Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-06
Filing date: 2021-03-06
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-03-06
Also published as: CN112899255A

Abstract

本发明涉及一种DNA聚合酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。该DNA聚合酶包括：(a)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列构成的多肽；或(b)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或(c)、与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。上述DNA聚合酶的热稳定性较好。

Description

DNA聚合酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种DNA聚合酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。

背景技术

DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶(DNA—dependent DNA polymerase，DNApol)，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。然而，市场上大多数DNA聚合酶在80℃下5min左右就会丧失活性的热稳定性较差，难以满足实际需求。

发明内容

基于此，有必提供一种热稳定性较好的DNA聚合酶。

此外，还有必要提供一种DNA聚合酶的应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。

一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括：

(a)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；或

(b)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸组成的多肽；或

(c)、与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。

研究发现，包括由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；或，由如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或，与如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽的DNA聚合酶具有较好的热稳定性。经试验验证，上述DNA聚合酶在80℃下的半衰期在10min以上，尤其是含有如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽的DNA聚合酶在80℃下的半衰期达68min，具有较好的热稳定性。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第137位氨基酸、第203位氨基酸、第155位氨基酸、第337位氨基酸及第21位氨基酸中的一个发生突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变、R155Q突变、M337R突变、M21E突变中至少一种得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和D203Y突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和R155Q突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变和R155Q突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶的编码序列包括：

(a)、由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸

(b)、与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸；或，

(c)、由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。

其中一个实施例中，所述DNA聚合酶为可溶性酶或者固定化酶。

一种重组载体，含有上述DNA聚合酶的编码序列。

其中一个实施例中，包括如下步骤：采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，所述第一载体含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。

其中一个实施例中，所述第一扩增引物对含有所述DNA聚合酶的突变位点对应的核苷酸序列。

一种重组工程菌，含有上述重组载体。

上述DNA聚合酶、上述重组载体或者上述重组工程菌在LAMP、RT-LAMP、水解脂肪族酯或者水解芳香族酯中的应用。

附图说明

图1为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA聚合酶的同源建模结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本发明一实施方式提供一种DNA聚合酶包括：

(a)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；或

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是Notomi等在1998年报道的一种等温核酸扩增技术。该法依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物(2条外引物和2条内引物)和一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)。LAMP检测体系中基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在30min～60min扩增10^9倍～10^10倍，特异性较高。LAMP技术的主要原理是DNA在65℃左右可以处于动态平衡状态，DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环。反应具有快速、简易、高特异性,不依赖于昂贵检测设备的优点，使其能够用于资源贫乏地区的基因检测、食品和环境样品的快速检测及现场检测。

Bst DNA Polymerase是环介导等温扩增技术中的核心关键酶，是通过碱基互补配对原理催化底物dNTP(脱氧核苷酸)分子聚合形成子代DNA的一类酶。其耐热性的提高有利于提高反应温度可以带来更好的扩增特异性。此外，Bst DNA Polymerase试剂在生产销售环节往往需要经历长时间、长距离的运输存储等操作，其稳定性直接影响了产品的货期、保质期等因素，甚至影响着客户对整个环介导扩增技术的市场认可度等重要商业指标。综上，Bst DNA Polymerase的热稳定性是影响整个环介导等温扩增技术性能的重要酶学性质。然而，市场上大多数DNA聚合酶在80℃下5min左右就会丧失活性的热稳定性较差，难以满足实际需求。

具体地，如SEQ ID No.2所示的序列为：MAEGEKPLEEMEFAIVDVITEEMLADKAALVVEVMEENYHDAPIVGIALVNEHGRFFMRPETALADSQFLAWLADETKKKSMFDAKRAVVALKWKGIELRGVAFDLLLAAYLLNPAQDAGDIAAVAKMKQYEAVRSDEAVYGKGVKRSLPDEQTLAEHLVRKAAAIWALEQPFMDDLRNNEQDQLLTKLEQPLAAILAEMEFTGVNVDTKRLEQMGSELTEQLRAIEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPHHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTGKVHTMFNQALTQTGRLSSAEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIADDDNLIEAFQRDLDIHTKTAMDIFHVSEEEVTANMRRAAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGVKQYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLAARLKEEQLQARLLLQVGDELILEAPKEEIERLCELVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGPTWYDAK。

在一个具体示例中，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，来源于Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)菌株，命名为Bst L-TOP蛋白。

其中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第137位氨基酸、第203位氨基酸、第155位氨基酸、第337位氨基酸及第21位氨基酸中的一个发生突变得到的多肽。

进一步地，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变、R155Q突变、M337R突变、M21E突变中至少一种得到的多肽。

其中，Q137E突变即为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第137位的谷丙酰胺被谷氨酸替代；D203Y突变即为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第203位的天冬氨酸被酪氨酸替代；R155Q突变即为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第155位的精氨酸被谷氨酰胺替代；M337R突变即为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第337位的蛋氨酸被精氨酸替代；M21E突变即为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第21位的蛋氨酸被谷氨酸替代。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生M337R突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和D203Y突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生Q137E突变和D203Y突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和R155Q突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生Q137E突变和R155Q突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和M337R突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生Q137E突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变和R155Q突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生D203Y突变和R155Q突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变和M337R突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变和M337R突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生R155Q突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。可选地，DNA聚合酶为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生R155Q突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

其中一个实施例中，DNA聚合酶的编码序列包括：

(a)、由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸

具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：ATGGCGGAAGGCGAAAAACCGCTGGAAGAAATGGAATTTGCGATTGTGGATGTGATTACCGAAGAAATGCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGATGGAAGAAAACTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGCTGGTGAACGAACATGGCCGCTTTTTTATGCGCCCGGAAACCGCGCTGGCGGATAGCCAGTTTCTGGCGTGGCTGGCGGATGAAACCAAAAAAAAAAGCATGTTTGATGCGAAACGCGCGGTGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGCGCGGCGTGGCGTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGAACCCGGCGCAGGATGCGGGCGATATTGCGGCGGTGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCAGCGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGTGAAACGCAGCCTGCCGGATGAACAGACCCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGCGCTGGAACAGCCGTTTATGGATGATCTGCGCAACAACGAACAGGATCAGCTGCTGACCAAACTGGAACAGCCGCTGGCGGCGATTCTGGCGGAAATGGAATTTACCGGCGTGAACGTGGATACCAAACGCCTGGAACAGATGGGCAGCGAACTGACCGAACAGCTGCGCGCGATTGAACAGCGCATTTATGAACTGGCGGGCCAGGAATTTAACATTAACAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAAAAACTGCAGCTGCCGGTGCTGAAAAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCAGCGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGCCGCATCATGAAATTGTGGAAAACATTCTGCATTATCGCCAGCTGGGCAAACTGCAGAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGTGGTGCGCCCGGATACCGGCAAAGTGCATACCATGTTTAACCAGGCGCTGACCCAGACCGGCCGCCTGAGCAGCGCGGAACCGAACCTGCAGAACATTCCGATTCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCCAGGCGTTTGTGCCGAGCGAACCGGATTGGCTGATTTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCATATTGCGGATGATGATAACCTGATTGAAGCGTTTCAGCGCGATCTGGATATTCATACCAAAACCGCGATGGATATTTTTCATGTGAGCGAAGAAGAAGTGACCGCGAACATGCGCCGCGCGGCGAAAGCGGTGAACTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGATTATGGCCTGGCGCAGAACCTGAACATTACCCGCAAAGAAGCGGCGGAATTTATTGAACGCTATTTTGCGAGCTTTCCGGGCGTGAAACAGTATATGGAAAACATTGTGCAGGAAGCGAAACAGAAAGGCTATGTGACCACCCTGCTGCATCGCCGCCGCTATCTGCCGGATATTACCAGCCGCAACTTTAACGTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAACACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAAGCGATGATTGATCTGGCGGCGCGCCTGAAAGAAGAACAGCTGCAGGCGCGCCTGCTGCTGCAGGTGGGCGATGAACTGATTCTGGAAGCGCCGAAAGAAGAAATTGAACGCCTGTGCGAACTGGTGCCGGAAGTGATGGAACAGGCGGTGACCCTGCGCGTGCCGCTGAAAGTGGATTATCATTATGGCCCGACCTGGTATGATGCGAAA。

由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列。因此本申请中的DNA聚合酶的氨基酸序列，包括由如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的DNA聚合酶的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的DNA聚合酶，因此，编码上述DNA聚合酶的核苷酸序列并不仅限于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。如果编码得到的蛋白与DNA聚合酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白与DNA聚合酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

其中一个实施例中，DNA聚合酶为可溶性酶或者固定化酶。

上述DNA聚合酶具有较高的热稳定性，具有优良的催化活性，能够在合成RNA中应用。可选地，上述DNA聚合酶能够在LAMP、RT-LAMP、水解脂肪族酯或者水解芳香族酯中的应用。

进一步地，上述DNA聚合酶中具有单点突变体或者组合突变体，在80℃下的半衰期在10min以上，尤其是含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽的DNA聚合酶在80℃下的半衰期达68min，具有较好的热稳定性。

本发明一实施方式提供一种重组载体含有上述DNA聚合酶的编码序列。

其中，重组载体为克隆载体或表达载体。

具体地，重组载体为含有上述DNA聚合酶的编码序列的pQE80L载体。需要说明的是，重组载体不限于为含有上述DNA聚合酶的编码序列的pQE80L载体，也可以将DNA聚合酶基因整合到其他载体上，例如可以为pET21b、pET22b、pET32a、pQE30等载体。

本发明一实施方式提供上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，第一载体含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。可选地，第一扩增引物对含有所述DNA聚合酶的突变位点对应的核苷酸序列。

需要说明的是，DNA聚合酶的单点突变体的构建中，以上述第一扩增引物对中的一对进行PCR扩增。DNA聚合酶的多点突变体的构建中，对一个突变位点进行单点突变后，再进行第二突变位点进行突变，依次叠加获得。具体地，按照以下方式进行：一个突变位点的扩增引物对扩增后，再用另一个突变位点的扩增引物对对含有在先突变的扩增产物进行扩增。

在其中一个实施例中，采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增的步骤之前，还包括构建第一载体的步骤。

其中，构建第一载体的步骤包括：采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的目的基因扩增引物对扩增目的基因，目的基因为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列；将目的基因连接到空载体中，转化，提取阳性质粒，得到第一载体。具体地，如SEQID No.3所示的序列为：5’-TTTAAGAAGGAGATTTAAATATGGCGGAAGGCG-3’(即上游引物，带下划线碱基为限制性内切酶MseI识别位点)，如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-TCGAGACCACCCTCGAGTTATTATTTCGCAT-3’(即下游引物，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)。

在其中一个实施例中，在采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：筛选DNA聚合酶的突变位点。

具体地，筛选DNA聚合酶的突变位点包括如下步骤：通过在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索Bst DNA聚合酶氨基酸序列(如如SEQ ID No.2所示)，去除重复出现的相同序列后选取与目标蛋白序列一致性(identity)大于30％的蛋白质序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，将上述fasta.文件上传到Consensus Makerv2.0.0服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensussequence，筛选出稳定性相关的突变位点。

市场上多种Bst聚合酶都是来源于大肠杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌，其在80℃，5-10min就会丧失活性。但其他商品化的耐热DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等都无法满足环介导扩增技术的要求(具有链置换活性等特殊性质)。而能够满足LAMP要求的DNA聚合酶大都来源于常温微生物(噬菌体等)，其稳定性较差，难以保证LAMP过程中良好的热稳定性，并影响其运输及投产使用，从而极大地限制了Bst DNA聚合酶等温扩增的应用。上述天然的DNA聚合酶的序列、结构和功能都受到自然进化等多方面的限制，难以直接应用于工业合成生产中，对天然酶的基因进行蛋白质工程手段改造，可以使天然酶打破自然进化对其的限制，从而得到有着工业用途优势的优良的改造后的人工酶基因。为此必须选择稳定性良好的酶来满足工业生产的要求。通过蛋白质工程手段，提升BSTDNA聚合酶的热稳定性，是解决这一问题的关键。

蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质以满足人类对生产和生活的需求。理性设计是蛋白质工程改造中最常用的方法，利用计算机辅助分子模型结合定点突变，以实现蛋白质功能优化，如提高催化活性、热稳定性、耐酸碱性等。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001年提出Consensus Concept理论。和常规蛋白质理性设计方法基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。本发明以Consensus Concept理论为指导思想，对DNA聚合酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的DNA聚合酶。

上述重组载体的构建方法，与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，本发明以Consensus Concept理论为指导思想，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息，对DNA聚合酶序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得能够表达高稳定性的DNA聚合酶的重组载体。

上述重组载体能够用于生产DNA聚合酶，以应用于LAMP、RT-LAMP、水解脂肪族酯或者水解芳香族酯中。

本发明一实施方式提供一种重组工程菌含有上述实施方式的重组载体。

上述重组工程菌能够生产DNA聚合酶，能够应用于LAMP、RT-LAMP、水解脂肪族酯或者水解芳香族酯中；并且构建的高效表达的重组工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点。

进一步地，重组工程菌为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌。可选地，重组工程菌为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)。需要说明的是，重组工程菌不限于为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌，也可以使用革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和真菌等微生物宿主进行目的蛋白的表达。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

以下实施例中，如特别说明，基因来源：野生型Bst DNA聚合酶基因以大肠杆菌为宿主进行密码子优化，由金唯智生物技术公司合成；引物合成：由金唯智生物技术公司合成制备；pET28a质粒载体购自Novagen公司；Pfu聚合酶购自全式金公司；DpnI酶购自Thermo公司；T4 DNA连接酶购自Thermo公司；PrimeSTAR Max Premix高保真酶购自TakaRa公司；DreamTaq DNA聚合酶以及所有限制性内切酶均购自Thermo公司；DNA胶回收试剂盒及小质粒提试剂盒购自天根公司。

实施例1

采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的目的基因扩增引物对扩增目的基因，PCR扩增使用全式金的

FastPfu Fly PCR SuperMix(-dye)，扩增条件为：预变性94℃3min，变性94℃30sec,退火58℃20sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃10min。其中，如SEQ ID No.3所示的序列为：5’-TTTAAGAAGGAGATTTAAATATGGCGGAAGGCG-3’(即上游引物，带下划线碱基为限制性内切酶MseI识别位点)，如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-TCGAGACCACCCTCGAGTTATTATTTCGCAT-3’(即下游引物，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)。目的基因的序列如SEQ ID No.1所示，即为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。

反应结束后，1.5％(w/w)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到1.8kb的条带，长度符合预期结果。按照试剂盒标准操作，回收、纯化该目的片段，使用限制性核酸内切酶MseI和XhoI对回收片段、pET28a质粒进行双酶切，T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上，提取阳性克隆质粒，进行测序，结果显示克隆的Bst DNA聚合酶Bst L-TOP基因序列正确，正确接入pET28a质粒，命名重组质粒为pET28a-Bst L-TOP。

实施例2

Bst L-TOP的表达、纯化及活力测定

(1)将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100ug/mL Kan的5mL LB培养基试管中，37℃220rpm培养12h。将该5mL菌液转接至含50ug/mL Kan的1L TB培养基摇瓶中，37℃220rpm培养约2h，使OD600达到1.2左右，加入0.8mM IPTG诱导剂，25℃220rpm诱导培养18h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，破碎液水浴80℃处理40min，再经过一步Ni-IDA亲和层析处理后就能得到95％以上纯度的目的蛋白。

(2)以浓度为20mM的对硝基苯丁酸酯作为反应底物，缓冲体系为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，实时测定酶活。在30-60℃范围内，每隔5℃测酶活，在接近最适温度处加大温度密度测酶活，分析酯酶的最适反应温度。将纯化后的酶液分别保温在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃条件下15min保温后测定酶活，分析酶的热稳定性。

(3)将纯化后的Bst DNA聚合酶蛋白浓度调整到0.5mg/mL，在80℃水浴中孵育不同时间(0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min)；将热处理后的优化的Bst DNA聚合酶蛋白进行残余活力测定。

其中，反应体系为：无核酸无核酸酶水15μL，10x PCR Buffer 2μL，25mM硫酸镁溶液2μL，核酸模板100μM 0.1μL(其序列如SEQ ID No.5所示：tagcgaaatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgccggccgcgggagca)，dNTP混合液(12.5mM)0.4μL，SYBRGreenI染料0.5μL，热处理后的优化的Bst DNA聚合酶蛋白1μL，实时荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件为；37℃，16s，荧光采集通道SYBR，120个循环。数据处理：根据不同量双链DNA的荧光强度制作标准曲线，根据标准曲线，测定酶在单位时间内消耗的dNTP的量，计算得到残留酶活性；将不同孵育时间的残留活性进行拟合，计算得到酶的半衰期(min)。氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的DNA聚合酶的半衰期详见表1。

实施例3

Bst L-TOP同源蛋白的多序列比对及Consensus分析，具体操作如下：

1.进入Pfam数据库主页(http://pfam.xfam.org/)，在SEQUENCE SEARCH工具中输入Bst DNA聚合酶的氨基酸序列进行搜索。服务器直接反馈该蛋白整个家族的氨基酸序列比对结果，并将各个位点的各类氨基酸丰度以柱状图形式显示。该网站也可以自动生成该蛋白家族的consensus sequence。

2.在NCBI protein数据库或Pfam数据库中输入Bst DNA聚合酶的氨基酸序列，利用Blast工具，找出所有与目标蛋白序列一致性(identity)大于40％的蛋白质序列。删除其中的重复出现的相同序列，将剩余序列整理成fasta.格式，输入Clustalx1.83软件进行多序列比对。比对结果以aln.、dnd.和fasta.格式输出。其中dnd.文件为构建进化树文件，aln.和fasta.文件为不同形式的序列文件。将上述fasta.文件上传到Weblogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将以柱状图的形式展示多序列比对结果中蛋白质序列各个位点氨基酸丰度。将上述fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence。

3.将目的蛋白Bst L-TOP的氨基酸序列与该家族consensus sequence以及各位点氨基酸丰度图进行对照比较。

实施例4

Bst L-TOP结构解析及突变热点的选择

1.利用Swiss-model以同源性为82.2％的1H38为模板进行同源建模，Bst L-TOP聚合酶进行同源建模，下载Bst L-TOP的同源建模结构.

2.用PyMOL观测同源建模结构，根据结构信息复查上述待选突变位点及突变形式，筛选出最有可能提高Bst L-TOP热稳定性的突变体，筛选条件如下：

(1)判断某一位点为待选位点的标准为：①该家族大多数蛋白在该位点处氨基酸丰度总体高度较高；②该位点氨基酸保守；③该位点出现频率较高的氨基酸与Bst L-TOP该位点处的氨基酸有较大的理化性质差异，如电荷差异、极性强弱、空间位阻大小等。

(2)除去活性中心附近，即距离催化残基

范围内的氨基酸残基，除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。

经过两步筛选，此时共剩余如下突变位点，大多数位于蛋白分子的表面。其中，突变位点为：G561H、A454S、D86S、I421V、V165A、G13S、M337R、M102V、L90K、D401E、Q256E、R79P、A351T、Q150G、M55L、M31I、M78I、C577K、T589E、V38E、Q211M、A436Q、E190K、N226K、Q137E、Q204E、A215L、K208E、N199E、R155Q、H599S、M148R、P80T、D203Y、D138S、G24E、A34E、M194E、A123D、M21E、G140H、Q88A、N305K、R409N、H20E、D61Y。

(3)根据Bst L-TOP同源建模结构，逐个详细分析上述突变形式，筛选出可能提高Bst L-TOP热稳定性的突变体。主要判断准则为：①突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用、电荷聚集等；②突变不应破坏现有的利于热稳定的作用力形式和稳定的蛋白结构；③突变应引入新的利于热稳定的作用力形式，如氢键、盐桥、疏水相互作用等。经过筛选，热稳定性有较好提高的突变点为：Q137E、D203Y、R155Q、M337R、M21E。

实施例5

突变体的构建、表达、纯化及性质表征

(1)Bst L-TOP定点突变体的构建：

以重组质粒pET28a-Bst L-TOP为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用PCR扩增使用全式金的

FastPfu Fly PCR SuperMix(-dye)，扩增条件为：预变性94℃3min，变性94℃30sec，退火58℃20sec，延伸72℃4min，共35个循环，最后72℃10min。进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Thermo公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板。消化产物转化至Rosetta(DE3)，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到Bst DNA聚合酶突变体的重组菌。

(2)突变体的性质表征：按照实施例2的方法得到Bst DNA聚合酶定点突变突变体的纯酶液，并表征这5个单点突变体的半衰期。结果表明，这5个单点突变体中，4个突变体的热稳定性得到明显改善，分别为Q137E、D203Y、R155Q、M337R。

(3)将稳定性提高的突变体进行累加组合：使用与单点突变体相似的构建方法，在如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列选择多个突变位点进行组合，如从上述4个突变位点中选择2～3个突变位点进行组合，分别得到不同的DNA聚合酶，并将各DNA聚合酶逐一表达、纯化、表征(参考实施例2的方法)，测定结果详见表1。其中，DNA聚合酶为：成功构建如下组合突变体：Q137E、D203Y、R155Q、M337R、Q137E/D203Y、Q137E/R155Q、Q137E/M337R、D203Y/R155Q、D203Y/M337R、R155Q/M337R、Q137E/D203Y/M337R、R155Q/D203Y/M337R。

(a)选择2个突变位点进行组合，可构建4种DNA聚合酶，其组合突变位点分别为：Q137E/D203Y、Q137E/R155Q、Q137E/M337R、D203Y/R155Q、D203Y/M337R、R155Q/M337R，其中，Q137E/D203Y表示如SEQ ID No.2所示的氨基酸同时发Q137E和D203Y两种突变，其余突变类型也具有相似含义，不再赘述。

(b)选择3个突变位点进行组合，可构建3种DNA聚合酶，其组合突变位点分别为：Q137E/D203Y/M337R、R155Q/D203Y/M337R。其中，Q137E/D203Y/M337R表示如SEQ ID No.2所示的氨基酸同时发生Q137E、D203Y和M337R三种突变，其余突变类型也具有相似含义，不再赘述。

表1 DNA聚合酶的酶学性质表征

ENND-top	80℃半衰期(min)
		氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA聚合酶	10
Q137E	15
		D203Y	17
R155Q	20
		M337R	18
Q137E/D203Y	24
		Q137E/R155Q	28
Q137E/M337R	31
		D203Y/R155Q	24
D203Y/M337R	31
		R155Q/M337R	30
Q137E/D203Y/M337R	68
		R155Q/D203Y/M337R	58

从表1可以看出，上述DNA聚合酶在80℃下的半衰期在10min以上，尤其是由如SEQID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的DNA聚合酶在80℃下的半衰期达68min，是氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA聚合酶的6.8倍，具有较好的热稳定性。

进一步地，本研究中以Consensus Concept为指导思想，建立了数据库检索、多序列筛选及比对；获得了热稳定性提高的Bst DNA聚合酶突变体，在80℃下半衰期较长；构建的高效表达的基因工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点；蛋白热稳定性的提高，使用热休克法进行纯化，降低后续分离纯化难度，获得高纯度蛋白，上述DNA聚合酶能够用于LAMP的应用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州瀚源新酶生物科技有限公司

<120> DNA聚合酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggaag gcgaaaaacc gctggaagaa atggaatttg cgattgtgga tgtgattacc 60

gaagaaatgc tggcggataa agcggcgctg gtggtggaag tgatggaaga aaactatcat 120

gatgcgccga ttgtgggcat tgcgctggtg aacgaacatg gccgcttttt tatgcgcccg 180

gaaaccgcgc tggcggatag ccagtttctg gcgtggctgg cggatgaaac caaaaaaaaa 240

agcatgtttg atgcgaaacg cgcggtggtg gcgctgaaat ggaaaggcat tgaactgcgc 300

ggcgtggcgt ttgatctgct gctggcggcg tatctgctga acccggcgca ggatgcgggc 360

gatattgcgg cggtggcgaa aatgaaacag tatgaagcgg tgcgcagcga tgaagcggtg 420

tatggcaaag gcgtgaaacg cagcctgccg gatgaacaga ccctggcgga acatctggtg 480

cgcaaagcgg cggcgatttg ggcgctggaa cagccgttta tggatgatct gcgcaacaac 540

gaacaggatc agctgctgac caaactggaa cagccgctgg cggcgattct ggcggaaatg 600

gaatttaccg gcgtgaacgt ggataccaaa cgcctggaac agatgggcag cgaactgacc 660

gaacagctgc gcgcgattga acagcgcatt tatgaactgg cgggccagga atttaacatt 720

aacagcccga aacagctggg cgtgattctg tttgaaaaac tgcagctgcc ggtgctgaaa 780

aaaaccaaaa ccggctatag caccagcgcg gatgtgctgg aaaaactggc gccgcatcat 840

gaaattgtgg aaaacattct gcattatcgc cagctgggca aactgcagag cacctatatt 900

gaaggcctgc tgaaagtggt gcgcccggat accggcaaag tgcataccat gtttaaccag 960

gcgctgaccc agaccggccg cctgagcagc gcggaaccga acctgcagaa cattccgatt 1020

cgcctggaag aaggccgcaa aattcgccag gcgtttgtgc cgagcgaacc ggattggctg 1080

atttttgcgg cggattatag ccagattgaa ctgcgcgtgc tggcgcatat tgcggatgat 1140

gataacctga ttgaagcgtt tcagcgcgat ctggatattc ataccaaaac cgcgatggat 1200

atttttcatg tgagcgaaga agaagtgacc gcgaacatgc gccgcgcggc gaaagcggtg 1260

aactttggca ttgtgtatgg cattagcgat tatggcctgg cgcagaacct gaacattacc 1320

cgcaaagaag cggcggaatt tattgaacgc tattttgcga gctttccggg cgtgaaacag 1380

tatatggaaa acattgtgca ggaagcgaaa cagaaaggct atgtgaccac cctgctgcat 1440

cgccgccgct atctgccgga tattaccagc cgcaacttta acgtgcgcag ctttgcggaa 1500

cgcaccgcga tgaacacccc gattcagggc agcgcggcgg atattattaa aaaagcgatg 1560

attgatctgg cggcgcgcct gaaagaagaa cagctgcagg cgcgcctgct gctgcaggtg 1620

ggcgatgaac tgattctgga agcgccgaaa gaagaaattg aacgcctgtg cgaactggtg 1680

ccggaagtga tggaacaggc ggtgaccctg cgcgtgccgc tgaaagtgga ttatcattat 1740

ggcccgacct ggtatgatgc gaaa 1764

<210> 2

<211> 588

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Glu Gly Glu Lys Pro Leu Glu Glu Met Glu Phe Ala Ile Val

1 5 10 15

Asp Val Ile Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val

20 25 30

Glu Val Met Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala

35 40 45

Leu Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Met Arg Pro Glu Thr Ala Leu

50 55 60

Ala Asp Ser Gln Phe Leu Ala Trp Leu Ala Asp Glu Thr Lys Lys Lys

65 70 75 80

Ser Met Phe Asp Ala Lys Arg Ala Val Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly

85 90 95

Ile Glu Leu Arg Gly Val Ala Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu

100 105 110

Leu Asn Pro Ala Gln Asp Ala Gly Asp Ile Ala Ala Val Ala Lys Met

115 120 125

Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Ser Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly

130 135 140

Val Lys Arg Ser Leu Pro Asp Glu Gln Thr Leu Ala Glu His Leu Val

145 150 155 160

Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Gln Pro Phe Met Asp Asp

165 170 175

Leu Arg Asn Asn Glu Gln Asp Gln Leu Leu Thr Lys Leu Glu Gln Pro

180 185 190

Leu Ala Ala Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Thr Gly Val Asn Val Asp

195 200 205

Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Ser Glu Leu Thr Glu Gln Leu Arg

210 215 220

Ala Ile Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile

225 230 235 240

Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu

245 250 255

Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val

260 265 270

Leu Glu Lys Leu Ala Pro His His Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu His

275 280 285

Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu

290 295 300

Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Gly Lys Val His Thr Met Phe Asn Gln

305 310 315 320

Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln

325 330 335

Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe

340 345 350

Val Pro Ser Glu Pro Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln

355 360 365

Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Asp Asp Asp Asn Leu Ile

370 375 380

Glu Ala Phe Gln Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp

385 390 395 400

Ile Phe His Val Ser Glu Glu Glu Val Thr Ala Asn Met Arg Arg Ala

405 410 415

Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly

420 425 430

Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile

435 440 445

Glu Arg Tyr Phe Ala Ser Phe Pro Gly Val Lys Gln Tyr Met Glu Asn

450 455 460

Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His

465 470 475 480

Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg

485 490 495

Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala

500 505 510

Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Ala Ala Arg Leu Lys

515 520 525

Glu Glu Gln Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val Gly Asp Glu Leu

530 535 540

Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu Cys Glu Leu Val

545 550 555 560

Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val

565 570 575

Asp Tyr His Tyr Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Ala Lys

580 585

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttaagaagg agatttaaat atggcggaag gcg 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgagaccac cctcgagtta ttatttcgca t 31

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tagcgaaatg tgaacctaat ccctgctccc gcggccgatc tgccggccgc gggagca 57

Claims

1.一种DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生M337R突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和D203Y突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和R155Q突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变和M337R突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变和R155Q突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生D203Y突变和M337R突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变和M337R突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生Q137E突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽；

或者，所述DNA聚合酶包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生R155Q突变、D203Y突变和M337R突变得到的多肽。

2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶的编码序列包括：由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸序列进行替代得到的多核苷酸，所述DNA聚合酶的突变位点对应相应的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶为可溶性酶或者固定化酶。

4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1~3任一项所述的DNA聚合酶的编码序列。

5.权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，所述第一载体含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列；

可选地，所述第一扩增引物对含有所述DNA聚合酶的突变位点对应的核苷酸序列。

6.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求4所述的重组载体。

7.权利要求1~3任一项所述的DNA聚合酶、权利要求4所述的重组载体或者权利要求6所述的重组工程菌在LAMP、RT-LAMP中的应用。