CN112359032B - 突变型酯酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种突变型酯酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。该突变型酯酶包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或(b)、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。上述突变型酯酶的热稳定性较好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种突变型酯酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。
背景技术
酯酶是一类催化酯类化合物酯键断裂或形成的水解酶，是生命活动的重要催化剂，在动物、植物以及微生物中广泛存在。结构上，大多数酯酶属于α/β水解酶超家族，由α螺旋围绕在β折叠两侧，形成类似α/β/α形势结构。绝大部分的酯酶催化反应可以独立完成，不需要辅因子参与，且催化反应条件温和、产物单一、耗能小、产物易分离，在食品、化工、环保、能源以及医药领域都有着广泛地应用。然而，现有的酯酶的热稳定性较差，难以满足实际需求。
发明内容
基于此，有必提供一种热稳定性较好的突变型酯酶。
此外，还有必要提供一种突变型酯酶的应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。
一种突变型酯酶，所述突变型酯酶包括：
(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或
(b)、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。
研究发现，包括由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或，与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽的突变型酯酶具有较好的热稳定性。经试验验证，上述突变型酯酶在42℃下具有较长的半衰期，具有较好的热稳定性。
其中一个实施例中，所述突变型酯酶包括：由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生V28L突变、A31T突变、G354S突变、A366D突变中至少一种得到的多肽。
其中一个实施例中，所述突变型酯酶的氨基酸序列为如SEQ ID No.3～SEQ IDNo.17所示的序列中的一种。
其中一个实施例中，所述突变型酯酶的编码序列包括：
(a)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸；或，
(b)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
其中一个实施例中，所述突变型酯酶的编码序列包括：如SEQ ID No.28～SEQ IDNo.42所示的核苷酸序列中的一个。
一种重组载体，含有上述突变型酯酶的编码序列。
其中一个实施例中，包括如下步骤：采用突变扩增引物对对第一载体进行 PCR扩增，得到重组载体，其中，所述突变扩增引物对含有所述突变型酯酶的突变位点对应的核苷酸序列，所述第一载体含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。
其中一个实施例中，所述突变扩增引物对包括：如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的扩增引物对、如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示的扩增引物对、如SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示的扩增引物对、如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的扩增引物对中的至少一对。
一种重组工程菌，含有上述重组载体。
上述突变型酯酶、上述重组载体、上述重组工程菌在催化酯类化合物中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的EstZY蛋白模拟晶体结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明一实施方式提供一种突变型酯酶包括：
(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或
(b)、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。
研究发现，包括由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或，与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽的突变型酯酶具有较好的热稳定性。经试验验证，上述突变型酯酶在42℃下具有较长的半衰期，具有较好的热稳定性。
具体地，如SEQ ID No.2所示的序列为： MSAPHPRSFDAFHAALQSQVEHDFLAGVSTALLRGREVVDRFHTGWADREA RVPLREDHLFRVFSNTKLVTSCAVMLLEEEGRLGLDDPVERWLPQLAKRRVL RAGATRIDDTEPAERPITVRQLMTHTSGLSYGVFDPGSLFFAAYRHARVLDPS TDLAAMIDALEPLPLAFQPGTRWEYSVGTDVLARLVEVVSGQSFRDFLMTRI FGPLGMEDTDFWVPPDKRERLCALYASVDLARPDVPGLVRMDELPYPGAYLS LFARYSGGGGLVSSRGDMVKLLQSLIPGGPTLLKPQTLSRMWTNQLPAHLCV QFPGLPPRRHMGFGLGSAVALAPGPGEPAGVEGEVSWGGMAGTVWWIHPQR GTAGVLMTQRWLGTSHAYALEFKRRAYEALG。
其中，突变型酯酶包括：由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生V28L突变、 A31T突变、G354S突变、A366D突变中至少一种得到的多肽。
进一步地，突变型酯酶的氨基酸序列为如SEQ ID No.3～SEQ ID No.17所示的序列中的一种。
具体地，如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生V28L突变得到。
如SEQ ID No.4所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生A31T 突变得到。
如SEQ ID No.5所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生G354S 突变得到。
如SEQ ID No.6所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生A366D 突变得到。
如SEQ ID No.7所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生V28L和A31T两种突变得到。
如SEQ ID No.8所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 V28L和G354S两种突变得到。
如SEQ ID No.9所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 V28L和A366D两种突变得到。
如SEQ ID No.10所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 A31T和G354S两种突变得到。
如SEQ ID No.11所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 A31T和A366D两种突变得到。
如SEQ ID No.12所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 G354S和A366D两种突变得到。
如SEQ ID No.13所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 V28L、A31T、G354S三种突变得到。
如SEQ ID No.14所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 V28L、A31T、A366D三种突变得到。
如SEQ ID No.15所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 A31T、G354S、A366D三种突变得到。
如SEQ ID No.16所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 V28L、G354S、A366D三种突变得到。
如SEQ ID No.17所示的序列由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生 V28L、A31T、G354S、A366D四种突变得到。
其中，上述突变型酯酶的编码序列包括：
(a)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸；或，
(b)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为： ATGAGCGCGCCCCATCCGAGGTCCTTCGATGCCTTCCATGCCGCCCTGCAG TCGCAGGTCGAGCACGACTTTCTCGCCGGTGTGTCCACGGCCTTGCTGCG GGGCCGCGAGGTGGTTGACCGCTTCCACACCGGCTGGGCCGACCGCGAG GCCCGCGTGCCGCTGCGCGAAGACCATCTGTTCCGGGTGTTTTCCAACAC CAAGCTCGTGACCTCCTGCGCGGTGATGCTGCTGGAGGAAGAAGGCCGCC TGGGCCTGGACGACCCGGTGGAACGCTGGTTGCCGCAACTGGCGAAGCG CCGCGTGCTGCGTGCAGGCGCCACGCGCATCGACGACACCGAGCCTGCCG AGCGCCCCATCACCGTGCGCCAGCTCATGACCCACACCTCGGGCCTGAGC TACGGCGTCTTCGATCCCGGCTCGCTCTTCTTCGCGGCGTACCGGCATGCC CGTGTGCTGGACCCCAGCACGGACCTGGCGGCGATGATCGATGCGCTCGA GCCCCTGCCCCTGGCCTTCCAGCCCGGCACCCGCTGGGAATACTCGGTGG GCACCGACGTGCTGGCCCGGCTGGTGGAGGTGGTTTCGGGCCAGTCGTTC CGCGACTTCCTGATGACACGCATCTTCGGCCCCCTTGGCATGGAAGACACC GACTTCTGGGTGCCACCCGACAAGCGCGAGCGCCTCTGCGCGCTGTACGC GAGCGTGGATCTGGCGCGGCCGGACGTGCCCGGCCTGGTGCGCATGGACG AGCTTCCCTATCCGGGTGCGTACCTGAGCCTCTTCGCGCGCTACTCGGGCG GTGGGGGCCTGGTGTCGTCGCGCGGGGACATGGTCAAGCTCCTGCAATCG CTGATCCCCGGCGGGCCCACGCTGCTGAAGCCGCAGACCCTTTCGCGCAT GTGGACCAACCAGCTGCCGGCGCACCTGTGCGTGCAGTTCCCCGGCCTGC CGCCGCGCCGCCACATGGGTTTCGGCCTGGGCTCGGCCGTGGCGCTGGCGCCCGGACCGGGCGAGCCGGCAGGCGTCGAAGGGGAGGTGAGCTGGGGAG GCATGGCCGGCACGGTGTGGTGGATCCACCCGCAACGAGGCACGGCCGGC GTGCTGATGACCCAGCGCTGGCTGGGCACCAGCCACGCCTACGCGCTGGAGTTCAAGCGCCGGGCCTACGAGGCCCTGGGCTGA。
进一步地，突变型酯酶的编码序列包括：如SEQ ID No.28～SEQ ID No.42 所示的核苷酸序列中的一个。
具体地，如SEQ ID No.28所示的核苷酸序列编码突变位点为V28L的突变型酯酶。
如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列编码突变位点为A31T的突变型酯酶。
如SEQ ID No.30所示的核苷酸序列编码突变位点为G354S的突变型酯酶。
如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列编码突变位点为A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.32所示的核苷酸序列编码突变位点为V28L/A31T的突变型酯酶。
如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列编码突变位点为V28L/G354S的突变型酯酶。
如SEQ ID No.34所示的核苷酸序列编码突变位点为V28L/A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列编码突变位点为A31T/G354S的突变型酯酶。
如SEQ ID No.36所示的核苷酸序列编码突变位点为A31T/A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.37所示的核苷酸序列编码突变位点为G354S/A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.38所示的核苷酸序列编码突变位点为V28L/A31T/G354S的突变型酯酶。
如SEQ ID No.39所示的核苷酸序列编码突变位点为V28L/A31T/A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.40所示的核苷酸序列编码突变位点为A31T/G354S/A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.41所示的核苷酸序列编码突变位点为A31T/G354S/A366D的突变型酯酶。
如SEQ ID No.42所示的核苷酸序列编码突变位点为 V28L/A31T/G354S/A366D的突变型酯酶。
上述突变型酯酶具有较高的热稳定性，具有优良的催化活性，能够用于催化酯类化合物。
进一步地，上述突变型酯酶包括单点突变体和组合突变体，与野生型酯酶 EstZY相比，其单点突变体和组合突变体在42℃下半衰期均更长，尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型的8 倍。
本发明一实施方式提供一种重组载体含有上述突变型酯酶的编码序列。
其中，重组载体为克隆载体或表达载体。
具体地，重组载体为含有上述突变型酯酶的编码序列的pET28a质粒。
本发明一实施方式提供上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：采用突变扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，突变扩增引物对含有所述突变型酯酶的突变位点对应的核苷酸序列，第一载体含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。
其中，突变扩增引物对包括：如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的扩增引物对、如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示的扩增引物对、如SEQ ID No.24 和SEQ ID No.25所示的扩增引物对、如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的扩增引物对中的至少一对。
具体地，如SEQ ID No.20所示的序列为：5'- CGTGGAGAGACCGGCGAGAAAGTCGTG-3'。
如SEQ ID No.21所示的序列为：5'- GCCGGTCTCTCCACGGCCTTGCTGCGG-3'。
如SEQ ID No.22所示的序列为：5'- CAGCAAGGtCGTGGACACACCGGCGAG-3'。
如SEQ ID No.23所示的序列为：5'- TCCACGaCCTTGCTGCGGGGCCGCGAG-3'。
如SEQ ID No.24所示的序列为：5'- CACCGTCGAGGCCATGCCTCCCCAGCT-3'。
如SEQ ID No.25所示的序列为：5'- ATGGCCTCGACGGTGTGGTGGATCCAC-3'。
如SEQ ID No.26所示的序列为：5'- CACGCCGTCCGTGCCTCGTTGCGGGTG-3'。
如SEQ ID No.27所示的序列为：5'- GGCACGGACGGCGTGCTGATGACCCAG-3'。
需要说明的是，突变型酯酶的单点突变体的构建中，以上述突变扩增引物对中的一对进行PCR扩增。突变型酯酶的多点突变体的构建中，对一个突变位点进行单点突变后，再进行第二突变位点进行突变，依次叠加获得。具体地，按照以下方式进行：一个突变位点的扩增引物对扩增后，再用另一个突变位点的扩增引物对对含有在先突变的扩增产物进行扩增。
在其中一个实施例中，采用突变扩增引物对对第一载体进行PCR扩增的步骤之前，还包括构建第一载体的步骤。
其中，构建第一载体的步骤包括：采用序列如SEQ ID No.18～SEQ ID No.19 所示的扩增引物对扩增目的基因，目的基因为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列；将目的基因连接到空载体中，转化，提取阳性质粒，得到第一载体。
具体地，如SEQ ID No.18所示的序列为： 5’-ACTGCTCATATGAGCGCGCCCCATCCGAGGTCC-3’。如SEQ ID No.19所示的序列为：5’-TCAGCTCTCGAGTCAGCCCAGGGCCTCGTAGGC-3’。
在其中一个实施例中，在采用突变扩增引物对对第一载体进行PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：筛选突变型酯酶的突变位点。
具体地，筛选突变型酯酶的突变位点包括如下步骤：通过在Pfam数据库、 NCBI数据库中搜索SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，去除重复冗余的氨基酸序列，选取与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列一致性大于50％的氨基酸序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，并将剩余氨基酸序列整理成fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence；通过Swissmodel在线工具对SEQ ID No.2进行蛋白质三维结构预测，筛选出稳定性相关的突变位点：V28L、A31T、 G354S、A366D。
蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质以满足人类对生产和生活的需求。理性设计是蛋白质工程改造中最常用的方法，利用计算机辅助分子模型结合定点突变，以实现蛋白质功能优化，如提高催化活性、热稳定性、耐酸碱性等。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001年提出Consensus Concept理论。和常规蛋白质理性设计方法基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。本发明以Consensus Concept理论为指导思想，对酯酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的突变型酯酶。
上述重组载体的构建方法，与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，本发明以Consensus Concept理论为指导思想，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息，对酯酶EstZY家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得能够表达高稳定性的新型突变型酯酶的重组载体。
上述重组载体能够用于生产突变型酯酶，以应用于催化酯类化合物。
本发明一实施方式提供一种重组工程菌含有上述实施方式的重组载体。
上述重组工程菌能够生产突变型酯酶，能够应用于催化酯类化合物。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
本实施例提供一种突变型酯酶的构建方法，包括以下步骤：
1.野生型酯酶EstZY基因的克隆
将野生型酯酶EstZY基因以大肠杆菌为宿主细胞进行密码子优化，得到优化的EstZY基因(即为目的基因)，其核酸序列为SEQ ID No.1，表达的氨基酸序列为SEQ IDNo.2。以SEQ ID No.1作为目的基因，采用上游扩增引物SEQ ID No.18和下游扩增引物SEQID No.19扩增目的基因。其中，如SEQ ID No.18所示的序列为：5’-ACTGCTCATATGAGCGCGCCCCATCCGAGGTCC-3’(其中下划线为限制性内切酶NdeI识别位点)；如SEQ ID No.19所示的序列为： 5’-TCAGCTCTCGAGTCAGCCCAGGGCCTCGTAGGC-3’(其中下划线为限制性内切酶XhoI识别位点)。扩增条件为：在95℃下扩增2min，然后在56℃下扩增20sec、在72℃下扩增90sec，共30个循环，最后在72℃下扩增10min。
待反应结束，采用质量百分含量为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到1.0kb的条带，其长度符合预期结果。按照试剂盒标准操作，回收、纯化该目的片段，使用限制性核酸内切酶XhoI和NdeI对该目的片段以及pET28a 质粒进行双酶切，然后采用T4DNA连接酶进行连接，将得到的连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，提取阳性克隆质粒，进行测序，结果显示克隆的酯酶EstZY基因序列正确，且已正确接入pET28a质粒，得到重组质粒pET28a-EstZY。其中，野生型酯酶EstZY来源于Ramlibacter rhizophilu，命名为EstZY蛋白；EstZY基因由苏州金唯智生物科技有限公司提供；PCR扩增酶为东洋纺提供的KOD高保真聚合酶。
2.EstZY蛋白的表达和纯化
将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100μg/mL Kan的4mL LB培养基试管中，在37℃、220rpm条件下培养12h；取菌液4mL转接至含50μg/mL Kan 的1L LB培养基摇瓶中，在37℃、220rpm条件下培养2.5h，使OD600达到0.9 左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，在25℃、200rpm条件下诱导培养14h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理，得到纯度大于95％的EstZY蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
3.EstZY同源蛋白的多序列比对及Consensus分析
3.1.进入Pfam数据库主页(http://pfam.xfam.org/)，在SEQUENCE SEARCH 工具中输入EstZY的氨基酸序列进行搜索，服务器将直接反馈该蛋白整个家族的氨基酸序列的比对结果，将各个突变位点的各类氨基酸丰度以柱状图形式显示，该网站也可以自动生成该蛋白家族的consensus sequence。
3.2.在NCBI protein数据库及Pfam数据库中输入SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，利用Blast工具，找出所有与EstZY蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID No.2 所示)一致性大于30％的蛋白质序列，删除其中的重复出现的相同序列，将剩余氨基酸序列整理成fasta格式，输入Clustalx1.83软件进行多序列比对，比对结果以aln、dnd和fasta格式输出，其中，dnd文件为构建进化树文件，aln和fasta文件为不同形式的序列文件。将上述fasta文件上传到Consensus Maker v2.0.0(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence。
3.3.将EstZY蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID No.2所示)与该家族consensussequence以及各位点氨基酸丰度图进行对照比较。
4.EstZY蛋白三维结构的模拟及突变热点的选择
4.1.通过Swissmodel在线工具对获得了EstZY蛋白(氨基酸序列SEQ ID No.2)的三维结构预测。
4.2.用PyMOL观测EstZY蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)晶体结构，根据结构信息复查上述待选突变位点及突变形式，筛选出最有可能提高 EstZY蛋白热稳定性的突变体位点，筛选条件如下：
(1)判断某一位点为待选位点的标准为：
①该家族大多数蛋白在该位点处氨基酸丰度总体高度较高；
②该位点氨基酸保守；
③该位点出现频率较高的氨基酸与EstZY蛋白在该位点处的氨基酸有较大的理化性质差异，如电荷差异、极性强弱、空间位阻大小等。
(2)除去活性中心附近，即距离催化残基(
范围内的氨基酸残基，除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。
经过上述两步筛选，此时共剩余10个差异位点，大多数位于EstZY蛋白分子的表面，如图1所示，箭头所指即为突变位点。
(3)根据EstZY蛋白晶体结构，逐个详细分析上述10种突变形式，筛选出可能提高EstZY蛋白热稳定性的突变体。
主要判断准则为：①突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用、电荷聚集等；②突变不应破坏现有的利于热稳定的作用力形式和稳定的蛋白结构；③突变应引入新的利于热稳定的作用力形式，如氢键、盐桥、疏水相互作用等。
共设计单点突变体4个，其突变位点分别为：V28L、A31T、G354S、A366D；将该4种酯酶EstZY单点突变体进行活力测定，筛选出4种热稳定性提高的突变型酯酶，其突变位点为：V28L、A31T、G354S、A366D，所对应的单点突变体的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6。
5.突变体的构建、表达及纯化
5.1.EstZY蛋白单点突变体的构建
以步骤1中的重组质粒pET28a-EstZY为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为扩增引物，用KOD高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒；
所采用的扩增引物对为：
(1)扩增突变位点V28L的扩增引物对中，上游扩增引物如SEQ ID No.20 所示，下游扩增引物如SEQ ID No.21所示。具体地，如SEQ ID No.20所示的序列为：5'-CGTGGAGAGACCGGCGAGAAAGTCGTG-3'。如SEQ ID No.21所示的序列为：5'-GCCGGTCTCTCCACGGCCTTGCTGCGG-3'。
(2)扩增突变位点A31T的扩增引物对中，上游扩增引物如SEQ ID No.22 所示，下游扩增引物如SEQ ID N0.23所示。具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：5'-CAGCAAGGtCGTGGACACACCGGCGAG-3'。如SEQ ID No.23所示的序列为：5'-TCCACGaCCTTGCTGCGGGGCCGCGAG-3'。
(3)扩增突变位点G354S的扩增引物对中，上游扩增引物如SEQ ID No.24 所示，下游扩增引物如SEQ ID No.25所示。具体地，如SEQ ID No.24所示的序列为：5'-CACCGTCGAGGCCATGCCTCCCCAGCT-3'。如SEQ ID No.25所示的序列为：5'-ATGGCCTCGACGGTGTGGTGGATCCAC-3'。
(4)扩增突变位点A366D的扩增引物对中，上游扩增引物如SEQ ID No.26 所示，下游扩增引物如SEQ ID No.27所示。具体地，
如SEQ ID No.26所示的序列为：5'- CACGCCGTCCGTGCCTCGTTGCGGGTG-3'。如SEQID No.27所示的序列为： 5'-GGCACGGACGGCGTGCTGATGACCCAG-3'。
扩增条件为：在95℃下扩增2min，然后在56℃下扩增20sec、在72℃下扩增90sec，共30个循环，最后在72℃下扩增10min；胶回收PCR扩增产物，采用DpnI酶在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板；将消化产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证，得到含酯酶EstZY单点突变体的重组菌。其中，上述KOD高保真酶由TakaRa公司提供；上述DpnI 酶由Fermentas公司提供。
5.2.EstZY蛋白组合突变体的构建
使用与单点突变体相似的构建方法，将稳定性提高的单点突变体累加组合，在SEQID No.2所示的氨基酸序列选择多个突变位点进行组合，如从上述4个突变位点中选择2～4个突变位点进行组合，分别得到不同的酯酶EstZY组合突变体：
(1)选择2个突变位点进行组合，可构建6种突变型酯酶，其组合突变位点分别为：V28L/A31T，V28L/G354S，V28L/A366D，A31T/G354S，A31T/A366D，G354S/A366D，该6种突变型酯酶的氨基酸序列分别为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12。
(2)选择3个突变位点进行组合，可构建4种突变型酯酶，其组合突变位点分别为：V28L/A31T/G354S，V28L/A31T/A366D，A31T/G354S/A366D，V28L/G354S/A366D，该4种突变型酯酶的氨基酸序列分别为SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16。
(3)选择4个突变位点进行组合，可构建1种突变型酯酶，其组合突变位点分别为：V28L/A31T/G354S/A366D，该1种突变型酯酶的氨基酸序列为SEQ ID No.17。
其中，编码突变位点为V28L的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.28所示。编码突变位点为A31T的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.29所示。编码突变位点为G354S的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.30所示。编码突变位点为A366D的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.31所示。编码突变位点为 V28L/A31T的突变型酯酶的编码序列如SEQ IDNo.32所示。编码突变位点为 V28L/G354S的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.33所示。编码突变位点为 V28L/A366D的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.34所示。编码突变位点为 A31T/G354S的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.35所示。编码突变位点为 A31T/A366D的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.36所示。编码突变位点为 G354S/A366D的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.37所示。编码突变位点为 V28L/A31T/G354S的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.38所示。编码突变位点为V28L/A31T/A366D的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.39所示。编码突变位点为A31T/G354S/A366D的突变型酯酶的编码序列如SEQ ID No.40所示。编码突变位点为A31T/G354S/A366D的突变型酯酶的核酸序列为SEQID No.41所示。编码突变位点为V28L/A31T/G354S/A366D的突变型酯酶的核酸序列为SEQID No.42。
测试例1
突变型酯酶的酶学性质表征
将野生型酯酶EstZY以及实施例1提供的15种突变型酯酶进行热稳定性测试，按照常规酯酶EstZY活力测定方法，具体为：
在一定温度下孵育酶液，在不同处理时间取样，测定酯酶EstZY或突变型酯酶残余活力百分比，以残余活力百分比的ln值对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数kinact，由t1/2＝ln2/kinact得到该种野生型酯酶EstZY或突变型酯酶在该温度下的半衰期。检测结果详见表1。
表1.野生型酯酶EstZY、突变型酯酶的酶学性质表征
| EstZY | 42℃半衰期(min) |
| 野生型 | 6 |
| V28L | 13 |
| A31T | 20 |
| G354S | 28 |
| A366D | 15 |
| V28L/A31T | 31 |
| V28L/G354S | 29 |
| V28L/A366D | 35 |
| A31T/G354S | 27 |
| A31T/A366D | 49 |
| G354S/A366D | 40 |
| V28L/A31T/G354S | 45 |
| V28L/A31T/A366D | 36 |
| A31T/G354S/A366D | 42 |
| A31T/G354S/A366D | 40 |
| V28L/A31T/G354S/A366D | 45 |
从表1可以看出，上述15种突变型酯酶包括单点突变体和组合突变体，与野生型酯酶EstZY相比，其单点突变体和组合突变体在42℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，其半衰期大约是野生型的8倍，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果。综上，本发明的突变型酯酶具有较高的热稳定性，较高的催化活性，能够用于催化酯类化合物，具有较大的应用潜力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
<120> 突变型酯酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcgcgc cccatccgag gtccttcgat gccttccatg ccgccctgca gtcgcaggtc 60
gagcacgact ttctcgccgg tgtgtccacg gccttgctgc ggggccgcga ggtggttgac 120
cgcttccaca ccggctgggc cgaccgcgag gcccgcgtgc cgctgcgcga agaccatctg 180
ttccgggtgt tttccaacac caagctcgtg acctcctgcg cggtgatgct gctggaggaa 240
gaaggccgcc tgggcctgga cgacccggtg gaacgctggt tgccgcaact ggcgaagcgc 300
cgcgtgctgc gtgcaggcgc cacgcgcatc gacgacaccg agcctgccga gcgccccatc 360
accgtgcgcc agctcatgac ccacacctcg ggcctgagct acggcgtctt cgatcccggc 420
tcgctcttct tcgcggcgta ccggcatgcc cgtgtgctgg accccagcac ggacctggcg 480
gcgatgatcg atgcgctcga gcccctgccc ctggccttcc agcccggcac ccgctgggaa 540
tactcggtgg gcaccgacgt gctggcccgg ctggtggagg tggtttcggg ccagtcgttc 600
cgcgacttcc tgatgacacg catcttcggc ccccttggca tggaagacac cgacttctgg 660
gtgccacccg acaagcgcga gcgcctctgc gcgctgtacg cgagcgtgga tctggcgcgg 720
ccggacgtgc ccggcctggt gcgcatggac gagcttccct atccgggtgc gtacctgagc 780
ctcttcgcgc gctactcggg cggtgggggc ctggtgtcgt cgcgcgggga catggtcaag 840
ctcctgcaat cgctgatccc cggcgggccc acgctgctga agccgcagac cctttcgcgc 900
atgtggacca accagctgcc ggcgcacctg tgcgtgcagt tccccggcct gccgccgcgc 960
cgccacatgg gtttcggcct gggctcggcc gtggcgctgg cgcccggacc gggcgagccg 1020
gcaggcgtcg aaggggaggt gagctgggga ggcatggccg gcacggtgtg gtggatccac 1080
ccgcaacgag gcacggccgg cgtgctgatg acccagcgct ggctgggcac cagccacgcc 1140
tacgcgctgg agttcaagcg ccgggcctac gaggccctgg gctga 1185
<210> 2
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Ala Pro His Pro Arg Ser Phe Asp Ala Phe His Ala Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ser Gln Val Glu His Asp Phe Leu Ala Gly Val Ser Thr Ala Leu
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Val Asp Arg Phe His Thr Gly Trp Ala Asp
35 40 45
Arg Glu Ala Arg Val Pro Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Val Phe
50 55 60
Ser Asn Thr Lys Leu Val Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Gly Arg Leu Gly Leu Asp Asp Pro Val Glu Arg Trp Leu Pro Gln
85 90 95
Leu Ala Lys Arg Arg Val Leu Arg Ala Gly Ala Thr Arg Ile Asp Asp
100 105 110
Thr Glu Pro Ala Glu Arg Pro Ile Thr Val Arg Gln Leu Met Thr His
115 120 125
Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Phe Phe
130 135 140
Ala Ala Tyr Arg His Ala Arg Val Leu Asp Pro Ser Thr Asp Leu Ala
145 150 155 160
Ala Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Leu Pro Leu Ala Phe Gln Pro Gly
165 170 175
Thr Arg Trp Glu Tyr Ser Val Gly Thr Asp Val Leu Ala Arg Leu Val
180 185 190
Glu Val Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Asp Phe Leu Met Thr Arg Ile
195 200 205
Phe Gly Pro Leu Gly Met Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp
210 215 220
Lys Arg Glu Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg
225 230 235 240
Pro Asp Val Pro Gly Leu Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val
260 265 270
Ser Ser Arg Gly Asp Met Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly
275 280 285
Gly Pro Thr Leu Leu Lys Pro Gln Thr Leu Ser Arg Met Trp Thr Asn
290 295 300
Gln Leu Pro Ala His Leu Cys Val Gln Phe Pro Gly Leu Pro Pro Arg
305 310 315 320
Arg His Met Gly Phe Gly Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly
325 330 335
Pro Gly Glu Pro Ala Gly Val Glu Gly Glu Val Ser Trp Gly Gly Met
340 345 350
Ala Gly Thr Val Trp Trp Ile His Pro Gln Arg Gly Thr Ala Gly Val
355 360 365
Leu Met Thr Gln Arg Trp Leu Gly Thr Ser His Ala Tyr Ala Leu Glu
370 375 380
Phe Lys Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Leu Gly
385 390
<210> 3
<211> 788
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Ala Pro His Pro Arg Ser Phe Asp Ala Phe His Ala Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ser Gln Val Glu His Asp Phe Leu Ala Gly Val Ser Thr Ala Leu
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Val Asp Arg Phe His Thr Gly Trp Ala Asp
35 40 45
Arg Glu Ala Arg Val Pro Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Val Phe
50 55 60
Ser Asn Thr Lys Leu Val Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Gly Arg Leu Gly Leu Asp Asp Pro Val Glu Arg Trp Leu Pro Gln
85 90 95
Leu Ala Lys Arg Arg Val Leu Arg Ala Gly Ala Thr Arg Ile Asp Asp
100 105 110
Thr Glu Pro Ala Glu Arg Pro Ile Thr Val Arg Gln Leu Met Thr His
115 120 125
Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Phe Phe
130 135 140
Ala Ala Tyr Arg His Ala Arg Val Leu Asp Pro Ser Thr Asp Leu Ala
145 150 155 160
Ala Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Leu Pro Leu Ala Phe Gln Pro Gly
165 170 175
Thr Arg Trp Glu Tyr Ser Val Gly Thr Asp Val Leu Ala Arg Leu Val
180 185 190
Glu Val Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Asp Phe Leu Met Thr Arg Ile
195 200 205
Phe Gly Pro Leu Gly Met Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp
210 215 220
Lys Arg Glu Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg
225 230 235 240
Pro Asp Val Pro Gly Leu Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val
260 265 270
Ser Ser Arg Gly Asp Met Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly
275 280 285
Gly Pro Thr Leu Leu Lys Pro Gln Thr Leu Ser Arg Met Trp Thr Asn
290 295 300
Gln Leu Pro Ala His Leu Cys Val Gln Phe Pro Gly Leu Pro Pro Arg
305 310 315 320
Arg His Met Gly Phe Gly Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly
325 330 335
Pro Gly Glu Pro Ala Gly Val Glu Gly Glu Val Ser Trp Gly Gly Met
340 345 350
Ala Gly Thr Val Trp Trp Ile His Pro Gln Arg Gly Thr Ala Gly Val
355 360 365
Leu Met Thr Gln Arg Trp Leu Gly Thr Ser His Ala Tyr Ala Leu Glu
370 375 380
Phe Lys Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Leu Gly Met Ser Ala Pro His Pro
385 390 395 400
Arg Ser Phe Asp Ala Phe His Ala Ala Leu Gln Ser Gln Val Glu His
405 410 415
Asp Phe Leu Ala Gly Leu Ser Thr Ala Leu Leu Arg Gly Arg Glu Val
420 425 430
Val Asp Arg Phe His Thr Gly Trp Ala Asp Arg Glu Ala Arg Val Pro
435 440 445
Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Val Phe Ser Asn Thr Lys Leu Val
450 455 460
Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Glu Glu Glu Gly Arg Leu Gly Leu
465 470 475 480
Asp Asp Pro Val Glu Arg Trp Leu Pro Gln Leu Ala Lys Arg Arg Val
485 490 495
Leu Arg Ala Gly Ala Thr Arg Ile Asp Asp Thr Glu Pro Ala Glu Arg
500 505 510
Pro Ile Thr Val Arg Gln Leu Met Thr His Thr Ser Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Phe Phe Ala Ala Tyr Arg His Ala
530 535 540
Arg Val Leu Asp Pro Ser Thr Asp Leu Ala Ala Met Ile Asp Ala Leu
545 550 555 560
Glu Pro Leu Pro Leu Ala Phe Gln Pro Gly Thr Arg Trp Glu Tyr Ser
565 570 575
Val Gly Thr Asp Val Leu Ala Arg Leu Val Glu Val Val Ser Gly Gln
580 585 590
Ser Phe Arg Asp Phe Leu Met Thr Arg Ile Phe Gly Pro Leu Gly Met
595 600 605
Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp Lys Arg Glu Arg Leu Cys
610 615 620
Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg Pro Asp Val Pro Gly Leu
625 630 635 640
Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly Ala Tyr Leu Ser Leu Phe
645 650 655
Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val Ser Ser Arg Gly Asp Met
660 665 670
Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly Gly Pro Thr Leu Leu Lys
675 680 685
Pro Gln Thr Leu Ser Arg Met Trp Thr Asn Gln Leu Pro Ala His Leu
690 695 700
Cys Val Gln Phe Pro Gly Leu Pro Pro Arg Arg His Met Gly Phe Gly
705 710 715 720
Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly Pro Gly Glu Pro Ala Gly
725 730 735
Val Glu Gly Glu Val Ser Trp Gly Gly Met Ala Gly Thr Val Trp Trp
740 745 750
Ile His Pro Gln Arg Gly Thr Ala Gly Val Leu Met Thr Gln Arg Trp
755 760 765
Leu Gly Thr Ser His Ala Tyr Ala Leu Glu Phe Lys Arg Arg Ala Tyr
770 775 780
Glu Ala Leu Gly
785
<210> 4
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ser Ala Pro His Pro Arg Ser Phe Asp Ala Phe His Ala Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ser Gln Val Glu His Asp Phe Leu Ala Gly Val Ser Thr Thr Leu
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Val Asp Arg Phe His Thr Gly Trp Ala Asp
35 40 45
Arg Glu Ala Arg Val Pro Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Val Phe
50 55 60
Ser Asn Thr Lys Leu Val Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Gly Arg Leu Gly Leu Asp Asp Pro Val Glu Arg Trp Leu Pro Gln
85 90 95
Leu Ala Lys Arg Arg Val Leu Arg Ala Gly Ala Thr Arg Ile Asp Asp
100 105 110
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115 120 125
Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Phe Phe
130 135 140
Ala Ala Tyr Arg His Ala Arg Val Leu Asp Pro Ser Thr Asp Leu Ala
145 150 155 160
Ala Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Leu Pro Leu Ala Phe Gln Pro Gly
165 170 175
Thr Arg Trp Glu Tyr Ser Val Gly Thr Asp Val Leu Ala Arg Leu Val
180 185 190
Glu Val Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Asp Phe Leu Met Thr Arg Ile
195 200 205
Phe Gly Pro Leu Gly Met Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp
210 215 220
Lys Arg Glu Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390
<210> 5
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
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20 25 30
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130 135 140
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165 170 175
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Pro Asp Val Pro Gly Leu Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly
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Ala Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val
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Ser Ser Arg Gly Asp Met Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly
275 280 285
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Arg His Met Gly Phe Gly Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly
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Leu Met Thr Gln Arg Trp Leu Gly Thr Ser His Ala Tyr Ala Leu Glu
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<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Ala Pro His Pro Arg Ser Phe Asp Ala Phe His Ala Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ser Gln Val Glu His Asp Phe Leu Ala Gly Val Ser Thr Ala Leu
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Val Asp Arg Phe His Thr Gly Trp Ala Asp
35 40 45
Arg Glu Ala Arg Val Pro Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Val Phe
50 55 60
Ser Asn Thr Lys Leu Val Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Gly Arg Leu Gly Leu Asp Asp Pro Val Glu Arg Trp Leu Pro Gln
85 90 95
Leu Ala Lys Arg Arg Val Leu Arg Ala Gly Ala Thr Arg Ile Asp Asp
100 105 110
Thr Glu Pro Ala Glu Arg Pro Ile Thr Val Arg Gln Leu Met Thr His
115 120 125
Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Phe Phe
130 135 140
Ala Ala Tyr Arg His Ala Arg Val Leu Asp Pro Ser Thr Asp Leu Ala
145 150 155 160
Ala Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Leu Pro Leu Ala Phe Gln Pro Gly
165 170 175
Thr Arg Trp Glu Tyr Ser Val Gly Thr Asp Val Leu Ala Arg Leu Val
180 185 190
Glu Val Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Asp Phe Leu Met Thr Arg Ile
195 200 205
Phe Gly Pro Leu Gly Met Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp
210 215 220
Lys Arg Glu Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg
225 230 235 240
Pro Asp Val Pro Gly Leu Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val
260 265 270
Ser Ser Arg Gly Asp Met Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly
275 280 285
Gly Pro Thr Leu Leu Lys Pro Gln Thr Leu Ser Arg Met Trp Thr Asn
290 295 300
Gln Leu Pro Ala His Leu Cys Val Gln Phe Pro Gly Leu Pro Pro Arg
305 310 315 320
Arg His Met Gly Phe Gly Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly
325 330 335
Pro Gly Glu Pro Ala Gly Val Glu Gly Glu Val Ser Trp Gly Gly Met
340 345 350
Ala Gly Thr Val Trp Trp Ile His Pro Gln Arg Gly Thr Asp Gly Val
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Phe Gly Pro Leu Gly Met Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp
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Lys Arg Glu Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg
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Pro Asp Val Pro Gly Leu Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly
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Ala Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val
260 265 270
Ser Ser Arg Gly Asp Met Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly
275 280 285
Gly Pro Thr Leu Leu Lys Pro Gln Thr Leu Ser Arg Met Trp Thr Asn
290 295 300
Gln Leu Pro Ala His Leu Cys Val Gln Phe Pro Gly Leu Pro Pro Arg
305 310 315 320
Arg His Met Gly Phe Gly Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly
325 330 335
Pro Gly Glu Pro Ala Gly Val Glu Gly Glu Val Ser Trp Gly Gly Met
340 345 350
Ala Ser Thr Val Trp Trp Ile His Pro Gln Arg Gly Thr Asp Gly Val
355 360 365
Leu Met Thr Gln Arg Trp Leu Gly Thr Ser His Ala Tyr Ala Leu Glu
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Phe Lys Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Leu Gly
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<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Ser Ala Pro His Pro Arg Ser Phe Asp Ala Phe His Ala Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ser Gln Val Glu His Asp Phe Leu Ala Gly Leu Ser Thr Thr Leu
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Val Asp Arg Phe His Thr Gly Trp Ala Asp
35 40 45
Arg Glu Ala Arg Val Pro Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Val Phe
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Ser Asn Thr Lys Leu Val Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Gly Arg Leu Gly Leu Asp Asp Pro Val Glu Arg Trp Leu Pro Gln
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Leu Ala Lys Arg Arg Val Leu Arg Ala Gly Ala Thr Arg Ile Asp Asp
100 105 110
Thr Glu Pro Ala Glu Arg Pro Ile Thr Val Arg Gln Leu Met Thr His
115 120 125
Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Phe Phe
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Ala Ala Tyr Arg His Ala Arg Val Leu Asp Pro Ser Thr Asp Leu Ala
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Ala Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Leu Pro Leu Ala Phe Gln Pro Gly
165 170 175
Thr Arg Trp Glu Tyr Ser Val Gly Thr Asp Val Leu Ala Arg Leu Val
180 185 190
Glu Val Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Asp Phe Leu Met Thr Arg Ile
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Phe Gly Pro Leu Gly Met Glu Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Asp
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Lys Arg Glu Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Val Asp Leu Ala Arg
225 230 235 240
Pro Asp Val Pro Gly Leu Val Arg Met Asp Glu Leu Pro Tyr Pro Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Arg Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val
260 265 270
Ser Ser Arg Gly Asp Met Val Lys Leu Leu Gln Ser Leu Ile Pro Gly
275 280 285
Gly Pro Thr Leu Leu Lys Pro Gln Thr Leu Ser Arg Met Trp Thr Asn
290 295 300
Gln Leu Pro Ala His Leu Cys Val Gln Phe Pro Gly Leu Pro Pro Arg
305 310 315 320
Arg His Met Gly Phe Gly Leu Gly Ser Ala Val Ala Leu Ala Pro Gly
325 330 335
Pro Gly Glu Pro Ala Gly Val Glu Gly Glu Val Ser Trp Gly Gly Met
340 345 350
Ala Ser Thr Val Trp Trp Ile His Pro Gln Arg Gly Thr Asp Gly Val
355 360 365
Leu Met Thr Gln Arg Trp Leu Gly Thr Ser His Ala Tyr Ala Leu Glu
370 375 380
Phe Lys Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Leu Gly
385 390
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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atggcctcga cggtgtggtg gatccac 27
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<211> 27
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<210> 27
<211> 27
<212> DNA
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<400> 27
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<212> DNA
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<400> 28
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gaaggccgcc tgggcctgga cgacccggtg gaacgctggt tgccgcaact ggcgaagcgc 300
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gcgatgatcg atgcgctcga gcccctgccc ctggccttcc agcccggcac ccgctgggaa 540
tactcggtgg gcaccgacgt gctggcccgg ctggtggagg tggtttcggg ccagtcgttc 600
cgcgacttcc tgatgacacg catcttcggc ccccttggca tggaagacac cgacttctgg 660
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ctcttcgcgc gctactcggg cggtgggggc ctggtgtcgt cgcgcgggga catggtcaag 840
ctcctgcaat cgctgatccc cggcgggccc acgctgctga agccgcagac cctttcgcgc 900
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cgccacatgg gtttcggcct gggctcggcc gtggcgctgg cgcccggacc gggcgagccg 1020
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<400> 29
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cgcttccaca ccggctgggc cgaccgcgag gcccgcgtgc cgctgcgcga agaccatctg 180
ttccgggtgt tttccaacac caagctcgtg acctcctgcg cggtgatgct gctggaggaa 240
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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<211> 1185
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<400> 31
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgatgatcg atgcgctcga gcccctgccc ctggccttcc agcccggcac ccgctgggaa 540
tactcggtgg gcaccgacgt gctggcccgg ctggtggagg tggtttcggg ccagtcgttc 600
cgcgacttcc tgatgacacg catcttcggc ccccttggca tggaagacac cgacttctgg 660
gtgccacccg acaagcgcga gcgcctctgc gcgctgtacg cgagcgtgga tctggcgcgg 720
ccggacgtgc ccggcctggt gcgcatggac gagcttccct atccgggtgc gtacctgagc 780
ctcttcgcgc gctactcggg cggtgggggc ctggtgtcgt cgcgcgggga catggtcaag 840
ctcctgcaat cgctgatccc cggcgggccc acgctgctga agccgcagac cctttcgcgc 900
atgtggacca accagctgcc ggcgcacctg tgcgtgcagt tccccggcct gccgccgcgc 960
cgccacatgg gtttcggcct gggctcggcc gtggcgctgg cgcccggacc gggcgagccg 1020
gcaggcgtcg aaggggaggt gagctgggga ggcatggcct cgacggtgtg gtggatccac 1080
ccgcaacgag gcacggccgg cgtgctgatg acccagcgct ggctgggcac cagccacgcc 1140
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gaaggccgcc tgggcctgga cgacccggtg gaacgctggt tgccgcaact ggcgaagcgc 300
cgcgtgctgc gtgcaggcgc cacgcgcatc gacgacaccg agcctgccga gcgccccatc 360
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tactcggtgg gcaccgacgt gctggcccgg ctggtggagg tggtttcggg ccagtcgttc 600
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ccggacgtgc ccggcctggt gcgcatggac gagcttccct atccgggtgc gtacctgagc 780
ctcttcgcgc gctactcggg cggtgggggc ctggtgtcgt cgcgcgggga catggtcaag 840
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atgtggacca accagctgcc ggcgcacctg tgcgtgcagt tccccggcct gccgccgcgc 960
cgccacatgg gtttcggcct gggctcggcc gtggcgctgg cgcccggacc gggcgagccg 1020
gcaggcgtcg aaggggaggt gagctgggga ggcatggccg gcacggtgtg gtggatccac 1080
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<210> 37
<211> 1185
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccgggtgt tttccaacac caagctcgtg acctcctgcg cggtgatgct gctggaggaa 240
gaaggccgcc tgggcctgga cgacccggtg gaacgctggt tgccgcaact ggcgaagcgc 300
cgcgtgctgc gtgcaggcgc cacgcgcatc gacgacaccg agcctgccga gcgccccatc 360
accgtgcgcc agctcatgac ccacacctcg ggcctgagct acggcgtctt cgatcccggc 420
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Claims (8)
1.一种突变型酯酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.2上发生下列位点的突变：
V28L；
V28L、A31T；
V28L、G354S；
V28L、A366D；
V28L、A31T、G354S；
V28L、A31T、A366D；
V28L、G354S、A366D；
V28L、A31T、G354S、A366D。
2.根据权利要求1所述的突变型酯酶，其特征在于，所述突变型酯酶对应的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17。
3.根据权利要求1所述的突变型酯酶，其特征在于，所述突变型酯酶的编码序列包括：如SEQ ID No.28、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID No.42中的任一种，其中：
编码突变位点为V28L的核苷酸序列为SEQ ID No.28；
编码突变位点为V28L和A31T的核苷酸序列为SEQ ID No.32；
编码突变位点为V28L和G354S的核苷酸序列为SEQ ID No.33；
编码突变位点为V28L和A366D的核苷酸序列为SEQ ID NO.34；
编码突变位点为V28L、A31T和G354S的核苷酸序列为SEQ ID NO.38；
编码突变位点为V28L、A31T和A366D核苷酸序列为SEQ ID NO.39；
编码突变位点为V28L、G354S和A366D的核苷酸序列为SEQ ID NO.40；
编码突变位点为V28L、A31T、G354S和A366D的核苷酸序列为SEQ ID NO.42。
4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1~3任一项所述的突变型酯酶的编码序列。
5.权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用突变扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，所述突变扩增引物对含有所述突变型酯酶的突变位点对应的核苷酸序列，所述第一载体含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。
6.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，所述突变扩增引物对包括SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的扩增引物对和下述引物对的至少一对：如SEQ IDNo.22和SEQ ID No.23所示的扩增引物对，SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示的扩增引物对，SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的扩增引物对。
7.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求4所述的重组载体。
8.根据权利要求1~3任一项所述的突变型酯酶、权利要求4所述的重组载体、权利要求7所述的重组工程菌在催化酯类化合物中的应用。
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