CN115322981A - 一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用 - Google Patents

一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供的腈水合酶突变体Str.t NHase‑βL48D在65℃的半衰期大约是43分钟，相比其他NHase酶热稳定性有显著提高。采用本发明的技术方案，对于以烟腈、丙烯腈、苯甲腈、2‑氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈等腈类化合物为底物的反应，其底物耐受性得到了明显的提高。

Description

一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用
本申请是针对原申请号为：CN202011307426.3，原申请日为2020年11月20日，发明名称为一种腈水合酶突变体及其应用的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
腈水合酶(NHase)可用于催化3-氰基吡啶生成药用价值更高的尼克酰胺，尼克酰胺又名烟酰胺，是一种维生素，已经被广泛的用于饲料、食品、制药等行业。烟酰胺市场需求量很大，预计每年需要2000多吨，但目前我国尼克酰胺的生产水平不高，规模不大，需要大量的进口，约1000吨/年。因此，将NHase用于尼克酰胺的生产有很大潜力。但是，该反应是一个放热的过程，所以生产过程中高温会影响酶活的发挥，主要是温度高，影响酶的结构，导致酶活下降，进而导致了大量的能耗，提高了生产成本。目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，生产效率不高，烟酰胺产量最高为162g/L，而丙烯酰胺产量最高为300g/L。目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。
腈水合酶的不稳定性还体现在对底物(腈类有机物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活；例如在丙烯酰胺的酶法制备过程中，由于腈水合酶对底物的耐受性不高，导致终产物丙烯酰胺只能维持较低的水平，给后续的丙烯酰胺浓缩工艺带来影响。随着市场的不断拓展，酰胺类化合物的需求也日益剧增，因此如何提高腈水合酶的底物耐受性已成为研究重点。获得一株有底物耐受性好、催化效率高的腈水合酶对于酰胺类工业化生产具有重要的应用价值。
发明内容
本发明旨在提供一种稳定性、酶活都提高的腈水合酶突变体并构建可以高性能催化多种腈类底物的酶工具箱。
本发明首先提供了一种腈水合酶突变体，所述突变体为(1)-(5)任一：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位亮氨酸突变得到的；
(2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位苯丙氨酸突变得到的；
(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位酪氨酸突变得到的；
(4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位亮氨酸突变得到的；
(5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位苯丙氨酸突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为(1)-(5)任一：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βL37P，βL37K，βL37D，βL37A，βL37F；
(2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βF41P，βF41K，βF41D，βF41A；
(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βY46P，βY46K，βY46D，βY46A，βY46F；
(4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βL48P，βL48K，βL48D，βL48A，βL48F；
(5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βF51P，βF51K，βF51D，βP51A。
在本发明的一种实施方式中，所述腈水合酶来源于嗜热链霉菌(Streptomycesthermoautotrophicus)。
在本发明的一种实施方式中，所述腈水合酶β亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了编码上述突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET-24a为出发质粒。
本发明还提供了携带上述基因，或上述重组质粒的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌E.coli BL21。
本发明还提供了一种提高腈水合酶耐受性的方法，所述方法为，按照下述(1)-(5)任一方法对腈水合酶进行突变：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
(2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任意一种；
(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
(4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
(5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述耐受性为底物耐受性，所述底物为腈类化合物。
在本发明的一种实施方式中，所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、苯甲腈、2-氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上。
本发明还提供一种提高腈水合酶活性的方法，所述方法为，按照下述(1)-(5)任一方法对腈水合酶进行突变：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
(2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任意一种；
(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
(4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
(5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任意一种。
本发明还提供了制备上述腈水合酶突变体的方法，所述方法为，将上述重组细胞接种于LB培养基中，35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于25℃诱导12-18h，表达腈水合酶突变体酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的LB表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，Co2+至0.1mg/L，25℃诱导12-18h，表达腈水合酶突变体酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌BL21为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以pET系列质粒为载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET24a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用Strep Trap HP柱分离得到腈水合酶突变体。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述重组细胞在制备含有烟酰胺、丙烯酰胺、苯丙酰胺、吡嗪酰胺、戊酰胺、异丁酰胺产品中的应用。
有益效果
(1)本发明提供的腈水合酶突变体Str.t NHase-βL48D在65℃的半衰期是43分钟，相比其他NHase酶热稳定性有显著提高。
(2)本发明提供了一种提高底物耐受性的腈水合酶突变体，采用本发明的技术方案，对于以腈类化合物为底物的反应，其底物耐受性得到了明显的提高；以下以仅以最好的突变效果为例：以烟腈为底物时，腈水合酶突变体βL48D的比酶活为野生酶的7倍；
以丙烯腈为底物时，腈水合酶突变体βL48F的比酶活为野生酶的2.5倍；
以苯甲腈为底物时，腈水合酶突变体βL48K的比酶活为野生酶的3倍；
以2-氰基吡嗪为底物时，腈水合酶突变体βL48D的比酶活为野生酶的3.7倍；
以异丁腈为底物时，腈水合酶突变体βL48P的比酶活为野生酶的1.8倍；
以正戊腈为底物时，腈水合酶突变体βY46K的比酶活为野生酶的4.9倍；
以肉桂腈为底物时，腈水合酶突变体βY46A的比酶活为野生酶的7.8倍。
因此，本发明提供的腈水合酶突变体不仅具有很好的酶学性质，还可以提供高效催化多种腈类底物的选择，有利于以后的工业生产。
附图说明
图1：腈水合酶突变体Str.t NHase-βL48D在65℃下热稳定测定。
图2：腈水合酶以烟腈为底物的比酶活测定。
图3：腈水合酶以丙烯腈为底物的比酶活测定。
图4：腈水合酶以苯甲腈为底物的比酶活测定。
图5：腈水合酶以2-氰基吡嗪腈为底物的比酶活测定。
图6：腈水合酶以异丁腈为底物的比酶活测定。
图7：腈水合酶以正戊腈为底物的比酶活测定。
图8：腈水合酶以肉桂腈为底物的比酶活测定。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L。
2YT液体培养基：蛋白胨16g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl 5g/L。
下述实施例中所涉及的溶液如下：
结合缓冲液：20mmol/L Na2HPO4、280mmol/L NaCl、6mmol/L KCl。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
腈水合酶活性的检测：
用HPLC检测，流动相为水：乙腈＝1:2；色谱柱为C18柱，波长：产物最佳检测波长下检测产物生成量。
腈水合酶反应体系：
底物为490μL适当浓度的底物溶液，加入适当浓度的纯酶溶液10μL在25℃的温度下反应10min后用500μL乙腈终止反应，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。
酶活的定义(U)：每分钟转化腈类底物生成1μmol/L对应酰胺所需的酶量定义为1U。
比酶活(U/mg)：每毫克NHase的酶活。
相对酶活的定义：突变酶在pH＝7.4，温度为25℃反应10分钟测得的酶活定义为100％。
热稳定性的检测方法：将野生酶和突变体在pH＝7.4的KPB缓冲液中，65℃分别处理30,60,120,180,240min后测定残留酶活，得到热稳定性结果。
实施例1：腈水合酶突变体的构建
具体步骤如下：
1、(1)突变体βL48D构建：
化学合成腈水合酶NHase基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，并将该基因克隆于pET24a质粒的NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点处，由苏州金唯智完成，获得pET24a-NHase重组质粒。以pET24a-NHase为模版，用表1所示引物在表2所示条件下PCR，得到PCR产物，将得到的PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞后送至苏州金唯智测序，测序结果正确的质粒，即为携带编码突变体基因的重组质粒pET24a-βL48D；分别将重组质粒pET24a-βL48D和pET24a-NHase转化E.coli BL21菌株进行表达，挑取转化子进行验证，验证正确即为：重组菌株E.coli BL21/pET24a-βL48D和E.coli BL21/pET24a-NHase。
表1突变引物
Figure BDA0003599115720000051
表2全质粒PCR扩增反应体系
Figure BDA0003599115720000061
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸2min；(重复30个循环)；72℃延伸10min。
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定，然后将PCR产物纯化、消化后转入大肠杆菌BL21感受态细胞。
(2)将重组大肠杆菌E.coli BL21/pET24a-βL48D和E.coli BL21/pET24a-Nhase分别接种于5mL含50μg/mL卡那霉素浓度为的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养，得到种子液。
分别将上述种子液按1％(v/v)的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素浓度的100mL2YT液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mMIPTG诱导剂，终浓度为0.1mg/L的Co2+离子溶液，25℃诱导12-18h得到发酵液，将发酵液在12000r的转速下离心收集菌体。
(3)分别将步骤(2)得到的菌体用结合缓冲溶液浓缩5倍，超声破碎，得到细胞破碎液，将细胞破碎液12000r离心40min，取上清，分别得到含有腈水合酶突变体βL48D粗酶液和含有腈水合酶野生酶WT的粗酶液，分别将上述粗酶液用0.22μm滤膜过滤后，用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的strep Trap HP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，用8倍柱体积的20mM Na2HPO4，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM脱硫生物素缓冲液洗脱蛋白，收集样品，即为含有腈水合酶突变体βL48D的纯酶液和有腈水合酶野生酶WT的纯酶液，并用SDS-PAGE分析鉴定。
2、利用表3中的引物，按照上述步骤1的方法，分别得到含有腈水合酶突变体βL37P的纯酶液，βL37K的纯酶液，βL37D的纯酶液，βL37A的纯酶液，βL37F的纯酶液，βF41P的纯酶液，βF41K的纯酶液，βF41D的纯酶液，βF41A的纯酶液，βY46P的纯酶液，βY46K的纯酶液，βY46D的纯酶液，βY46A的纯酶液，βY46F的纯酶液，βL48P的纯酶液，βL48K的纯酶液，βL48A的纯酶液，βL48F的纯酶液，βF51P的纯酶液，βF51K的纯酶液，βF51D的纯酶液，βP41A的纯酶液。
表3突变引物
Figure BDA0003599115720000071
实施例2：腈水合酶突变体半衰期
腈水合酶突变后仍然具有良好的热稳定性。本实施例以突变体βL48D为例，测其半衰期：
在500μl缓冲反应体系中分别加入0.5mg/ml实施例1纯化后的突变体酶10μL，于65℃金属浴中分别处理0min、30min、60min、120min、180min、240min，测定残留酶活。
如图1所示，发现突变体在65℃下，突变体酶βL48D的半衰期分别为：43min。
结果表明：酶活提高后仍具有良好的热稳定性。
实施例3：腈水合酶对底物烟腈酶活测定
向490μL 200mM的烟腈溶液中分别加入0.5mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图2和表4所示：
表4：不同的腈水合酶突变体对底物烟腈的比酶活
样品名称 比酶活(U/mg)
WT 73.49
L37P 101.95
L37K 84.62
L37D 135.42
L37A 88.73
L37F 265.68
F41P 150.19
F41K 178.60
F41D 161.44
F41A 119.42
Y46P 117.70
Y46K 187.11
Y46D 89.54
Y46A 85.01
Y46F 67.71
L48P 368.29
L48K 346.30
L48D 481.22
L48A 441.12
L48F 209.28
F51P 177.59
F51K 106.44
F51D 95.23
F51A 78.66
实施例4：腈水合酶对底物丙烯腈的酶活测定
向490μL 200mM的烟腈溶液中分别加入0.5mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图3和表5所示：
表5：不同的腈水合酶突变体对底物丙烯腈的比酶活
样品名称 比酶活(U/mg)
WT 550.84
L37P 655.14
L37K 310.33
L37D 1066.17
L37A 639.98
L37F 766.27
F41P 1004.49
F41K 1050.65
F41D 794.84
F41A 740.70
Y46P 599.21
Y46K 1053.44
Y46D 119.72
Y46A 594.74
Y46F 311.72
L48P 641.77
L48K 742.03
L48D 994.78
L48A 1019.06
L48F 1322.05
F51P 507.42
F51K 385.06
F51D 555.66
F51A 604.92
实施例5：腈水合酶对底物苯甲腈的酶活测定
向490μL 50mM的烟腈溶液中分别加入0.1mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图4和表6所示：
表6：不同的腈水合酶突变体对底物苯甲腈的比酶活
Figure BDA0003599115720000091
Figure BDA0003599115720000101
实施例6：腈水合酶对底物2-氰基吡嗪的酶活测定
向490μL 100mM的烟腈溶液中分别加入0.1mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图5和表7所示：
表7：不同的腈水合酶突变体对底物2-氰基吡嗪的比酶活
Figure BDA0003599115720000102
Figure BDA0003599115720000111
实施例7：腈水合酶对底物异丁腈的酶活测定
向490μL 200mM的烟腈溶液中分别加入0.1mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图6和表8所示：
表8：不同的腈水合酶突变体对底物异丁腈的比酶活
Figure BDA0003599115720000112
Figure BDA0003599115720000121
实施例8：腈水合酶对底物正戊腈的酶活测定
向490μL 100mM的烟腈溶液中分别加入0.5mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图7和表9所示：
表9：不同的腈水合酶突变体对底物正戊腈的比酶活
样品名称 比酶活(U/mg)
WT 21.91
L37P 9.69
L37K 9.99
L37D 9.69
L37A 12.29
L37F 23.98
F41P 25.32
F41K 37.88
F41D 22.30
F41A 25.91
Y46P 30.80
Y46K 104.67
Y46D 29.15
Y46A 22.44
Y46F 19.67
L48P 10.78
L48K 10.41
L48D 16.60
L48A 31.39
L48F 34.24
F51P 12.01
F51K 42.91
F51D 1.38
F51A 5.13
实施例9：腈水合酶对底物肉桂腈的酶活测定
向490μL 5mM的烟腈溶液中分别加入0.1mg/ml的实施例2得到的野生酶和突变体的纯酶溶液10μL，得到反应体系，将反应体系在25℃的温度下反应10min后，用500μL乙腈终止反应，得到反应液，将反应液取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品，检测腈水合酶比酶活。反应结果如图8和表10所示。
表10：不同的腈水合酶突变体对底物肉桂腈的比酶活
样品名称 比酶活(U/mg)
WT 16.50
L37P 55.37
L37K 2.18
L37D 22.82
L37A 56.46
L37F 1.50
F41P 50.40
F41K 8.89
F41D 14.4
F41A 6.90
Y46P 31.62
Y46K 78.63
Y46D 19.90
Y46A 128.55
Y46F 9.57
L48P 43.97
L48K 0.52
L48D 15.19
L48A 27.02
L48F 7.07
F51P 40.24
F51K 20.43
F51D 54.23
F51A 82.87
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用
<130> BAA220497A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asn Gly Val His Asp Leu Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Thr Ile
1 5 10 15
Gly Pro Glu Glu Asn Glu Pro Val Phe His Ser Glu Trp Glu Lys Val
20 25 30
Val Phe Ala Leu Leu Pro Ala Thr Phe Ala Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu
35 40 45
Asp Gln Phe Arg His Gly Ile Glu Gln Met His Pro Val Glu Tyr Leu
50 55 60
Ser Ser Arg Tyr Tyr Glu His Trp Leu His Thr Ile Thr His His Ala
65 70 75 80
Ile Arg Val Gly Ala Ile Asp Pro Asp Glu Leu Asp Glu Arg Thr Arg
85 90 95
Tyr Tyr Arg Asp Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Asp Arg Arg Asn Pro
100 105 110
Glu Leu Leu Lys Leu Met Glu Thr Ile Val Ala Gln Gly Ser Ser Ala
115 120 125
Arg Arg Pro Leu Asp Ser Lys Pro Arg Phe Ser Ile Gly Asp Arg Val
130 135 140
Arg Val Ala Asp Asp His Pro Phe Gly His Thr Arg Arg Ala Arg Tyr
145 150 155 160
Ile Arg Gly Lys Val Gly Val Ile Asp Arg Val His Gly Thr Phe Ile
165 170 175
Tyr Pro Asp Thr Ala Ala Arg Gly Glu Gly Asp Asp Pro Gln Trp Val
180 185 190
Tyr Ser Val Arg Phe Asp Ala Lys Glu Leu Trp Gly Glu Gln Tyr Ala
195 200 205
Asp Ala Asn Gly Ser Val Tyr Phe Asp Val Trp Glu Pro Tyr Ile Asp
210 215 220
Arg Val
225
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaacggtg ttcacgacct gggtggtacc gacggtctgg gtaccatcgg tccggaagaa 60
aacgaaccgg ttttccactc tgaatgggaa aaagttgttt tcgctctgct gccggctacc 120
ttcgctgctg gttactacaa cctggaccag ttccgtcacg gtatcgaaca gatgcacccg 180
gttgaatacc tgtcttctcg ttactacgaa cactggctgc acaccatcac ccaccacgct 240
atccgtgttg gtgctatcga cccggacgaa ctggacgaac gtacccgtta ctaccgtgac 300
aacccggacg ctccgctgcc ggaccgtcgt aacccggaac tgctgaaact gatggaaacc 360
atcgttgctc agggttcttc tgctcgtcgt ccgctggact ctaaaccgcg tttctctatc 420
ggtgaccgtg ttcgtgttgc tgacgaccac ccgttcggtc acacccgtcg tgctcgttac 480
atccgtggta aagttggtgt tatcgaccgt gttcacggta ccttcatcta cccggacacc 540
gctgctcgtg gtgaaggtga cgacccgcag tgggtttact ctgttcgttt cgacgctaaa 600
gaactgtggg gtgaacagta cgctgacgct aacggttctg tttacttcga cgtttgggaa 660
ccgtacatcg accgtgtt 678
<210> 3
<211> 1825
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaacggtg ttcacgacct gggtggtacc gacggtctgg gtaccatcgg tccggaagaa 60
aacgaaccgg ttttccactc tgaatgggaa aaagttgttt tcgctctgct gccggctacc 120
ttcgctgctg gttactacaa cctggaccag ttccgtcacg gtatcgaaca gatgcacccg 180
gttgaatacc tgtcttctcg ttactacgaa cactggctgc acaccatcac ccaccacgct 240
atccgtgttg gtgctatcga cccggacgaa ctggacgaac gtacccgtta ctaccgtgac 300
aacccggacg ctccgctgcc ggaccgtcgt aacccggaac tgctgaaact gatggaaacc 360
atcgttgctc agggttcttc tgctcgtcgt ccgctggact ctaaaccgcg tttctctatc 420
ggtgaccgtg ttcgtgttgc tgacgaccac ccgttcggtc acacccgtcg tgctcgttac 480
atccgtggta aagttggtgt tatcgaccgt gttcacggta ccttcatcta cccggacacc 540
gctgctcgtg gtgaaggtga cgacccgcag tgggtttact ctgttcgttt cgacgctaaa 600
gaactgtggg gtgaacagta cgctgacgct aacggttctg tttacttcga cgtttgggaa 660
ccgtacatcg accgtgtttg gagccacccg cagttcgaaa agtaaaagga gatatagata 720
tgtctacctc tcagtctccg ccgccgatct ctgaatcttt cccgaaatct gaagaagaaa 780
tcgctgctcg tgttaaagct ctggaatctc tgctgatcga aaaaggtgtt ctgaccaccg 840
aagttgttga ccgtatcgct gaaatctacg aacacgaagt tggtccgcac ctgggtgcta 900
aagttgttgc tcgtgcttgg gttgacccgg aattcaaaaa acgtctgctg gctgacgctt 960
ctgctgcttg ccgtgaactg cacatcggtg gtctgcaggg tgaagacatg gttgttgttg 1020
aaaacaccga ctctgttcac aacgttgttg tttgcaccct gtgctcttgc tacccgtggc 1080
cggttctggg tctgccgccg aactggtaca aatacccggc ttaccgtgct cgtatcgttc 1140
gtgaaccgcg taccgttctg cgtgaagaat tcggtctgga cctgccggaa tctgttgaaa 1200
tccgtgtttg ggactcttct gctgaactgc gttactgggt tctgccgcag cgtccggctg 1260
gtaccgaaca cctgtctgaa gaacagctgg ctgctctggt tacccgtgac tctatgatcg 1320
gtgttggtct gccgcgttct ccgcaggaag gttaaaagga gatatagata tgaaagctat 1380
gacctctacc gctcgtgacg ttcgtcagcg tttcctgcag gacgtttctc aggaccgtgc 1440
taaagttgaa cagctgctgg accagctgcc ggaaggtgct gctatcccga aaaaatgcgg 1500
tgaagcttct ttcgacaaag cttgggaaat ccgtgctttc gctctggctg ttgctgctca 1560
ccaggttggt cagtacgaat ggtctgaatt ccagcgtgaa ctgatcggtg ctatctctcg 1620
ttgggaatct accgctgctg accagccgtg gcgttactac gaccgttggc tggaagctct 1680
ggaatctctg ctggctgctt ctggtctggt taccaaatct gaactggacg accgtacccg 1740
taaagttctg gctaccccgc gtgacacctc tcaccagcac gctcgtcgtg acccggttgc 1800
tgttgactct ggtaaccacg cttaa 1825

Claims (10)

1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述腈水合酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任一种得到的。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述的重组质粒的重组细胞。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以大肠杆菌为表达宿主。
6.一种提高腈水合酶对腈类化合物耐受性的方法，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述方法为，按照下述方法对腈水合酶进行突变：
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸；所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、2-氰基吡嗪腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为赖氨酸；所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、2-氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为天冬氨酸；所述腈类化合物为烟腈、2-氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为丙氨酸；所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上。
7.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组质粒，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备含有烟酰胺、戊酰胺或肉桂腈的产品中的应用。
8.一种腈水合酶突变体，或编码该突变体的基因，或含有该突变体的重组质粒，或携带编码该突变体的基因的重组细胞，或携带含有该突变体的重组质粒的重组细胞在制备含有丙烯酰胺的产品中的应用，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述腈水合酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸中的任一种得到的。
9.一种腈水合酶突变体，或编码该突变体的基因，或含有该突变体的重组质粒，或携带编码该突变体的基因的重组细胞，或携带含有该突变体的重组质粒的重组细胞在制备含有吡嗪酰胺的产品中的应用，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述腈水合酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸中的任一种得到的。
10.一种腈水合酶突变体，或编码该突变体的基因，或含有该突变体的重组质粒，或携带编码该突变体的基因的重组细胞，或携带含有该突变体的重组质粒的重组细胞在制备含有异丁酰胺的产品中的应用，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述腈水合酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为赖氨酸、天冬氨酸中的任一种得到的。
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