CN110396513B

CN110396513B - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

Info

Publication number: CN110396513B
Application number: CN201910655539.3A
Authority: CN
Inventors: 秦慧民; 路福平; 毛淑红; 李玉; 朱张亮
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110396513A

Abstract

本发明提供的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体，其氨基酸序列是在如SEQ ID NO:1所示的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶氨基酸序列基础上，第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸的氨基酸序列；或者，第105位的缬氨酸替换为丙氨酸、第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸的氨基酸序列。本发明所述突变体的催化活性得到显著提高，达到野生型的179％或223％，而且温度稳定性也得到了显著改善，突变体在60℃下的半衰期是野生型的1.7倍或3.7倍。对于高温条件下生产D‑阿洛酮糖具有重要意义。

Description

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DAE)的突变体及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase，简称DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，可以果糖为底物生产附加产值高的D-阿洛酮糖。

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量的甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品。可帮助制造商减少配方中的蔗糖，用于开发低热量食品饮料。同时，D-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖还具有独特的生理功能，在临床医学领域具有潜在较大的应用价值。例如治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高血脂和动脉粥样硬化等疾病，D-阿洛酮糖还可以通过添加辅料进行喷雾干燥，进而有助于肺部药物给送。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质，2019年，FDA又宣布将低热量甜味剂D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“总糖”标签之外，因此不需要在这两项类目中计算其添加量，无疑将帮助其在未来进一步扩张市场。D-阿洛酮糖在自然界存在量及其稀少，而且化学法合成困难，所以 D-阿洛酮糖的生物合成法成为了研究的热点

生物法制备D-阿洛酮糖最为有效的方法是寻找能使D-果糖转变为D-阿洛酮糖的酶。然而，目前的DAE 酶对果糖催化活性低，且温度稳定性差等问题不适合工业化生产D-阿洛酮糖。随着D-阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高效的生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。因此开发具有高催化活性和温度稳定性好的DAE酶对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。

通过易错PCR获得突变体由于操作简便，有效成为目前应用最为广泛的进化手段之一，其原理是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一是利用基因工程和蛋白质工程提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体。本发明的目的之二是提供表达上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的重组载体或宿主菌。本发明的目的之三是提供上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的应用，对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。

本发明中采用如下定义：

1、氨基酸残基使用公认IUPAC命名法，用三字母缩写或单字母符号形式。DNA核酸序列采用公认 IUPAC命名法。

2、突变体的标识：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体中突变的氨基酸。如V105A，表示第105位的氨基酸由亲本D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的谷氨酸Val替换成丙氨酸Ala，位置的编号对应于SEQ ID NO：1中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列编号。如 N124R/S63G，表示第124位和第63位的氨基酸都发生了突变。

本发明的技术方案概述如下：

通过定向改造构建的催化活力和温度稳定性提高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，以亲本野生型球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(GenBank：BAW27657.1)出发，利用易错PCR进行定向进化，野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置突变，得到所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体如下：

第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸得到的突变体N124R/S63G；或者，第105位的缬氨酸替换为丙氨酸、第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸得到的突变体V105A/N124R/S63G。

所述野生型Arthrobacter globiformis的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

表达所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的重组载体或宿主菌。

在本发明的一个实施例中，用于表达所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及其突变体的表达载体为 pET-28a；用于所述重组表达载体转化的微生物宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的表达载体还可以是pPIC9k、pMA5或者其他pET系列载体；所述宿主菌还可以是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。

所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体在制备D-阿洛酮糖中的应用。

所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体可以应用于催化D-或L-酮糖的C3位的差向异构化形成对应的D-或L-酮糖。

所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体可以应用于催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。

所述的重组载体或宿主菌在表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体中的应用。

所述的重组载体或宿主菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

本发明获得所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的实验步骤概述如下：

1、以携带有球形节杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(AgDAE，核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示)的质粒AgDAE-pET-28a为模板，设计引物，利用易错PCR技术对AgDAE基因进行随机突变；

2、将易错PCR产物与表达载体pET-28a用Nde I和Xho I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21 (DE3)构建突变体库，对培养得到的阳性克隆进行抗生素筛选和诱导表达，通过转化果糖筛选出活性较高的突变株；

3、将上述活性提高的突变株进行测序鉴定AgDAE基因，测序结果与野生型比对，获得两个活性提高的DAE突变体N124R/S63G、V105A/N124R/S63G；

4、纯化并测定所述突变体的催化活性和温度稳定性；

5、利用所述突变体催化果糖生产D-阿洛酮糖。

本发明有益效果：

本发明通过易错PCR获得了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体N124R/S63G或V105A/N124R/S63G，催化活性得到显著提高，突变体N124R/S63G的相对酶活是野生型的179％，突变体V105A/N124R/S63G 的相对酶活是野生型的223％；而且温度稳定性也得到了显著改善，突变体N124R/S63G在60℃下的半衰期是野生型的1.7倍，突变体V105A/N124R/S63G在60℃下的半衰期是野生型的3.7倍。这两点对高温条件下生产D-阿洛酮糖而言是优良的性能。同时，本发明D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体对果糖的转化率也具有明显提升，显著提高了D-阿洛酮糖的产量和生产效率，进而极大降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。

附图说明

图1：D-阿洛酮糖和D-果糖的HPLC鉴定图。

图2：DAE突变体相对活性图。

图3：DAE突变体催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的转化率图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的构建

(1)以携带有球形节杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因AgDAE(核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示)的AgDAE-pET-28a质粒(苏州金唯智生物科技有限公司合成)为模板，使用Agilent Technologies 公司的GeneMorph II随机突变试剂盒(货号：200550)进行随机突变。

(2)通过以下引物扩增AgDAE基因

引物(5’-3’)AgDAE-F：

GGAATTCCATATGAAAATTGGCTGTCATGGTCTG，

引物(5’-3’)AgDAE-R：

CCGCTCGAGT TAATGCAGCT CGATGGTCTT GATTG，

利用易错PCR技术扩增出AgDAE约870bp的基因片段。

易错PCR反应体系(50μL)：

在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：

PCR反应条件：

PCR反应结束后，取2μL扩增产物进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，观察结果并纯化回收约870bp处的PCR产物。

(3)DNA纯化回收

采用OMEGA公司的小量DNA纯化回收试剂盒(货号：D2000-02)回收PCR产物，具体操作步骤如下：

1)向PCR产物中加入3-5倍体积的buffer CP，充分混匀，室温静置2min。

2)将上述混合溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，13,000r/min离心1min，弃滤液。

3)向吸附柱中加入700μL DNA Wash buffer，13,000r/min离心1min，弃滤液。

4)向吸附柱中加入500μL DNA Wash buffer，13,000r/min离心1min，弃滤液。

5)13,000r/min离心2min，除去吸附柱漂洗液。将吸附柱放入一个干净的EP管中置于室温放置10分钟，彻底晾干。

6)向吸附膜中间位置悬空滴加30～50μL的ddH₂O，室温放置2min。12,000r/min离心2min，收集 DNA溶液，-20℃保存。

7)用琼脂糖凝胶电泳检测回收成功。

(4)酶切反应

将纯化后的PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切，然后分别和经过同样双酶切后的pET-28a质粒连接。

PCR产物的酶切反应体系(50μL)：

在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：

载体质粒的酶切反应体系(50μL)：

在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：

37℃反应2h，琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物。

(5)参照OMEGA公司的胶回收纯化试剂盒(货号：D2500-02)说明书将酶切产物纯化回收。

(6)连接、转化

通过琼脂糖电泳确定基因与载体的浓度，调整两者的倍数使载体与目的基因的摩尔比为1:1-2:1，连接反应体系如下：

目的基因 3μL

载体 1μL

Solution I 4μL；

16℃反应6h或者过夜。

将连接产物加入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热击90s，立即冰浴 5min；加入500μL LB复苏液，37℃，220r/min复苏培养40-60min；4,000r/min离心5min，沉淀用200 μL LB培养基悬浮，混合涂布于含有Kan的抗性平板上，待菌液充分吸收后，37℃倒置培养12～16h至出现单菌落；挑取单菌落，用于活性筛选。

实施例2：突变体的活化和诱导表达

从上述培养过夜的平板上挑取单克隆至96深孔板，每空装有200μL含有50μg/mL卡那抗生素的LB 培养基，37℃过夜培养，然后吸取10μL过夜培养的菌液至装有800μL含有50μg/mL卡那抗生素的LB 培养基的96深孔板，37℃培养约2h左右，待OD₆₀₀在0.6-0.8之间时加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃培养16-20h。5000r/min离心30min收集菌体，重悬于LysisBuffer(20mM Tirs-HCl 20mM咪唑500mM NaCl pH＝7.4)里面，混匀后加入200μL溶菌酶、300μL PMSF和0.1％(v/v)TritonX-100，37℃孵育约 2h左右。5000r/min离心30min，吸取100微升上清至新的96孔板里，加入1％(w/v)的果糖，60℃反应10min，将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，采用HPLC测定转化果糖的活性。

实施例3：HPLC鉴定D-阿洛酮糖产物的生成

HPLC检测条件为：

色谱仪：Agilent1260；

检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)

进样：Agilent自动进样器；进样量20μL；

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column-W(5μm,4.6×250mm,AgelaTechnologies,China)；柱温40℃；

流动相：85％乙腈；流速1mL/min。

结果如图1所示，底物D-果糖和产物D-阿洛酮糖在柱子中得到很好的保留和分离。

实施例4：DAE突变体的序列鉴定和蛋白纯化

经过HPLC分析，获得两个酶活显著高于野生型的突变体，随后委托苏州金唯智生物科技有限公司对其进行测序，经过与野生型序列比对显示，氨基酸序列第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸得到的突变体N124R/S63G；或者氨基酸序列第105位的缬氨酸替换为丙氨酸、第124 位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸得到的突变体V105A/N124R/S63G。突变体的基因突变位点如下：

突变体的纯化：用Lysis Buffer(20mM Tirs-HCl 20mM咪唑500mM NaCl pH＝7.4)悬浮细胞，混匀后加入200μL溶菌酶、0.1％(v/v)TritonX-100和300μL PMSF，混匀后倒入烧杯中冰浴20min。细胞悬液超声破碎20min(超声2.5s，间隔3.0s)。将破碎液4℃，12,000r/min离心30min，将上清液与用Lysis Buffer平衡好的Ni-NTA superflow结合1h，使混合的样品流经纯化柱，用Wash Buffer(20mM Tirs-HCl 20 mM咪唑500mM NaCl pH＝7.4)洗去杂质蛋白，再用Elution Buffer(20mM Tirs-HCl 500mM咪唑500 mM NaCl pH＝7.4)溶出目的蛋白，然后20mM Tirs-HCl(pH＝7.4)含有150mM NaCl将Elution Buffer 透析去除，通过超滤浓缩得到DAE的突变体。DAE突变体的浓度由BCA蛋白浓度测定试剂盒测定(北京索莱宝，货号：PC0020)。测定DAE突变体的活性参照以下催化反应体系：200μL反应体系中含有20mMTirs-HCl(pH＝7.4)，150mM NaCl，1％(w/v)的果糖以及适量的DAE纯酶液，于60℃下反应10min。将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，将反应液稀释合适浓度到液相小瓶中，采用实施例3的检测方法对产物进行定量分析。

实施例5：突变体的相对酶活和温度稳定性的测定

本发明酶活定义如下：标准反应条件下(例如在20mM pH7.4Tirs-HCl、150mM NaCl于60℃下反应)，单位时间(1min)内转化D-果糖生成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量，突变体的相对酶活是以野生型酶活为100％。参照实施例3的酶反应体系测定纯化后突变体和野生型的相对酶活，结果如图2所示， N124R/S63G的相对酶活是野生型的179％，V105A/N124R/S63G的相对酶活是野生型的223％，上述突变体极大提高了对果糖的催化活性，对工业应用具有极大的意义。

将上述纯化得到的DAE突变体及其野生型在60℃温度下孵育不同时间，参照实施例3的方法测定残余酶活，分别得到突变体及其野生型在60℃下的半衰期。

通过测定发现突变体N124R/S63G和V105A/N124R/S63G在60℃半衰期有很大程度提高，分别是野生型的1.7倍或3.7倍以上。该突变体具有很高的应用价值和前景。

实施例6：利用突变体进行D-阿洛酮糖的生产

在1L的三角瓶中加入500mL 60％D-果糖，1mM Mg²⁺离子，10μM的DAE酶液，在60℃水浴锅反应，在不同时间取样，通过煮沸10min终止该反应，通过HPLC检测样品中D-阿洛酮糖的浓度。DAE突变体及其野生型在不同反应时间下转化D果糖生产D-阿洛酮糖的产率如图3所示，反应2h后，其中野生型的转化率28.6％，突变体N124R/S63G或V105A/N124R/S63G的转化率分别为38.5％或42.3％，分别是野生型的1.3倍或1.5倍，突变体最终的D-阿洛酮糖产量分别可达到231g/L或253g/L。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动或修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

<141> 2019-07-19

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)

<400> 1

Met Lys Ile Gly Cys His Gly Leu Val Trp Thr Gly His Phe Asp Ala

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Tyr Ser Val Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Phe Asp

20 25 30

Leu Val Glu Phe Pro Leu Met Asp Pro Phe Ser Phe Asp Val Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Ser Ala Leu Ala Glu His Gly Leu Ala Ala Ser Ala Ser Leu

50 55 60

Gly Leu Ser Asp Ala Thr Asp Val Ser Ser Glu Asp Pro Ala Val Val

65 70 75 80

Lys Ala Gly Glu Glu Leu Leu Asn Arg Ala Val Asp Val Leu Ala Glu

85 90 95

Leu Gly Ala Thr Asp Phe Cys Gly Val Ile Tyr Ser Ala Met Lys Lys

100 105 110

Tyr Met Glu Pro Ala Thr Ala Ala Gly Leu Ala Asn Ser Lys Ala Ala

115 120 125

Val Gly Arg Val Ala Asp Arg Ala Ser Asp Leu Gly Ile Asn Val Ser

130 135 140

Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Leu Asn Thr Gly Arg

145 150 155 160

Gln Ala Leu Ala Tyr Leu Glu Glu Leu Asn Arg Pro Asn Leu Gly Ile

165 170 175

His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ser Asp Met Phe Ser

180 185 190

Pro Ile Leu Asp Thr Ala Glu Ala Leu Arg Tyr Val His Ile Gly Glu

195 200 205

Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Val Asp Phe Asp Thr Phe

210 215 220

Phe Lys Ala Leu Gly Arg Ile Gly Tyr Asp Gly Pro Val Val Phe Glu

225 230 235 240

Ser Phe Ser Ser Ser Val Val Ala Pro Asp Leu Ser Arg Met Leu Gly

245 250 255

Ile Trp Arg Asn Leu Trp Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gly Ala His Ala

260 265 270

Asn Ala Phe Ile Arg Asp Lys Leu Thr Ala Ile Lys Thr Ile Glu Leu

275 280 285

His

<210> 2

<211> 876

<212> DNA

<213> 球形节杆菌(arthrobacter globiformis)

<400> 2

atgaaaattg gctgtcatgg tctggtgtgg accggtcact ttgatgccga gggtatccgc 60

tatagcgttc agaagacccg cgaggccggc tttgatttag tggaatttcc gctgatggac 120

cctttcagct tcgatgttca gaccgccaaa agcgctttag ccgaacatgg tttagcagca 180

agcgccagtc tgggtctgag cgatgccacc gatgtgagca gcgaagatcc cgctgtggtg 240

aaagccggtg aggaactgct gaatcgtgca gtggatgtgc tggccgaact gggtgcaacc 300

gatttctgcg gcgtgattta cagcgccatg aaaaagtata tggaaccggc caccgcagct 360

ggtttagcaa atagcaaagc agcagttggc cgcgttgcag accgtgccag cgatctgggc 420

atcaacgtgt ctttagaagt tgtgaatcgc tacgagacca acgtgctgaa tactggtcgt 480

caagccttag cctatttaga agaattaaac cgtccgaatt taggcatcca tctggatacc 540

tatcacatga acattgaaga gagcgatatg tttagcccga ttttagatac cgcagaggct 600

ttacgctatg ttcatatcgg cgaaagccat cgtggctatc tgggcaccgg cagcgttgat 660

ttcgatacct tttttaaggc tttaggccgt attggctatg acggtccggt ggtgtttgag 720

agctttagca gtagcgtggt ggccccggat ctgagtcgta tgctgggtat ttggcgcaat 780

ctgtgggccg ataacgaaga actgggcgcc catgccaacg cctttatccg tgacaaactg 840

accgcaatca agaccatcga gctgcattaa gaattc 876

Claims

1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID NO:1所示的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列基础上，第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸的氨基酸序列；或者，第105位的缬氨酸替换为丙氨酸、第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的用途，其特征在于，用于催化D-或L-酮糖的C3位发生差向异构化生成对应的D-或L-酮糖。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，用于催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的酶活力是野生型的179%或223%；或者所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体在60℃下的半衰期是野生型的1.7倍或3.7倍。

5.一种包含权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的编码基因的重组载体或宿主菌。

6.权利要求5所述的重组载体或宿主菌在表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体中的应用。

7.权利要求5所述的重组载体或宿主菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

8.一种制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，其特征在于，培养权利要求5所述的宿主菌，并从培养物中收集D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。