CN114958815B - 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶及其固定化方法，该高底物转化率的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其底物转化率高，经固定化后，具有较高的操作稳定性。

Description

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其固定化方法
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其固定化方法。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种稀有糖，甜度是蔗糖的70％。D-阿洛酮糖在动物体内几乎不产生任何热量，在抑制肥胖、降血糖等方面具有潜在功能。根据D-阿洛酮糖的这些特性让其在食品、医药、保健品等领域具有极大的应用潜力。随着人们对健康饮食、健康生活质量关注度的持续增长，D-阿洛酮糖的需求量急速增加。
近年来，越来越多的可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化的DPE酶逐渐被人们发现，DPE酶催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化时，在反应过程中无需添加其他物质，由于其只有一步反应，反应后副产物少，有利于降低生产成本，使后续D-阿洛酮糖的分离更加方便，是目前最理想的大规模工业化生产D-阿洛酮糖的方法。
目前发现的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的底物转化率都不高，稳定性差，其中底物转化率最高的DPE酶也仅为33％。高效的生物催化剂对于工业生产至关重要，因此，开发具有高底物转化率的DPE酶，对工业生产D-阿洛酮糖具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其固定化方法，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的底物转化率高，经固定化后，具有较高的操作稳定性。
本发明采用以下技术方案：一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，突变体酶P37H的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的编码基因，基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
一种重组表达载体，重组表达载体包含上述的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的编码基因。
一种基因工程菌，基因工程菌包含上述的一种重组表达载体。
一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，由上述的固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体P37H负载于环氧树脂或氨基树脂载体上制备而得。固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体P37H与树脂载体的质量比为5～40。
上述的一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的制备方法，制备方法包括：将经戊二醛活化的氨基树脂中加入D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H溶液，孵育即得。
本发明的有益效果是：1.通过半理性设计，并进行分子改造，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，相较于野生型DPE酶的底物转化率28.64％而言，D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的底物转化率为44.56％，其底物转化率大幅提高。2.通过树脂载体将D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H固定化，固定化后的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H有较高的操作稳定性，经过连续的七个批次的反应，D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的底物相对转化率依旧在70％以上。
附图说明
图1为野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶纯化电泳图；
图2为野生和不同突变体诱导表达上清电泳图；
图3为D-果糖和D-阿洛酮糖的液相标准曲线；
图4为D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的纯化电泳图；
图5为温度对D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的影响图；
图6为D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的热稳定性图；
图7为pH对D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的影响图；
图8为固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的pH稳定性图；
图9为温度对固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的影响图；
图10为固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的热稳定性图；
图11为pH对固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的影响图；
图12为固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的pH稳定性图；
图13为反应时间对底物转化率的影响图；
图14为固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的操作稳定性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，突变体酶P37H的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。如下：
MKIGCHGLVWTGHFDAEGIRYSVQKTREAGFDLVEFHLMDPFSFDVQTAK 50
SALAEHGLAASASLGLSDATDVSSEDPAVVKAGEELLNRAVDVLAELGAT 100
DFCGVIYSAMKKYMEPATAAGLANSKAAVGRVADRASDLGINVSLEVVNR 150
YETNVLNTGRQALAYLEELNRPNLGIHLDTYHMNIEESDMFSPILDTAEA 200
LRYVHIGESHRGYLGTGSVDFDTFFKALGRIGYDGPVVFESFSSSVVAPD 250
LSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDKLTAIKTIELH 270；
一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的编码基因，基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。如下：
ATGAAAATCGGCTGTCACGGTCTGGTTTGGACCGGTCATTTTGACGCGGAAGGCAT TCGT 60
TATAGCGTTCAGAAAACCCGCGAAGCAGGTTTCGATCTGGTTGAATTCCACCTGATG GAC 120
CCGTTTAGCTTCGACGTTCAGACCGCAAAATCTGCACTGGCAGAACACGGTCTGGC AGCA 180
TCTGCAAGTCTGGGTCTGTCTGACGCAACCGATGTTAGCAGCGAAGATCCGGCAGT TGTT 240
AAAGCAGGCGAAGAACTGCTGAATCGCGCAGTTGATGTTCTGGCAGAACTGGGCG CAACC 300
GATTTTTGCGGCGTTATCTACAGCGCGATGAAAAAATATATGGAACCGGCGACCGCG GCA 360
GGTCTGGCAAATAGTAAAGCGGCAGTTGGTCGCGTTGCAGATCGCGCATCAGATCT GGGT 420
ATTAACGTCAGCCTGGAAGTCGTTAACCGCTACGAAACCAACGTCCTGAATACCGG TCGT 480
CAAGCACTGGCGTATCTGGAAGAACTGAACCGTCCGAATCTGGGCATTCATCTGGA CACC 540
TACCACATGAACATCGAAGAGAGCGACATGTTTTCCCCGATTCTGGATACCGCAGA AGCA 600
CTGCGTTACGTTCACATTGGCGAAAGCCATCGCGGTTATCTGGGTACCGGTTCTGTT GAT 660
TTCGATACCTTCTTTAAAGCGCTGGGTCGCATTGGTTACGACGGTCCGGTCGTCTTT GAA 720
AGCTTTAGCAGTAGCGTTGTTGCACCGGATCTGTCTCGTATGCTGGGTATTTGGCGC AAT 780
CTGTGGGCAGATAACGAAGAACTGGGCGCACACGCAAACGCGTTTATCCGCGATAA ACTG 840
ACCGCGATCAAAACCATCGAACTGCATTAA 870；
一种重组表达载体，重组表达载体上述的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的编码基因。
一种基因工程菌，基因工程菌包含上述的一种重组表达载体。
一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，由上述的固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体P37H负载于环氧树脂或氨基树脂载体上制备而得。
一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体P37H与树脂载体的质量比为5～40。
一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的制备方法，该制备方法包括：将经戊二醛活化的氨基树脂中加入D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H溶液，浸泡即得。
实施例1
野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达与纯化：
基因合成来自于球形节杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因(GenBank:EDP19602.1)，通过BamHI and XhoI双酶切位点将D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE连接到载体pET-28a(+)上构建重组质粒pET-28a(+)-DPE。本发明中大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)、大肠杆菌表达质粒PET-28a(+)为自制保存，也可购买得到；亲和层析柱HisTrap Fast Flow预装柱和Sephadex G-25凝胶填料购自GE公司；其余试剂均为分析纯。然后将pET-28a(+)-DPE表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，构建表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)的重组大肠杆菌。
将含有以上质粒的重组大肠杆菌划线于含有Kana抗生素的固体LB平板上。用接种环挑取LB固体培养基的单克隆，接种到液体LB养基中，加入终浓度为50ug/ml kana抗生素，在37℃，200rpm过夜培养。将培养的菌液，按1％的接种量接种到液体LB培养基中，在37℃，200rpm培养至OD值为0.6～1时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，将温度调至30℃培养12-16h，通过低温离心机(4℃，4000rpm，30min)离心，倒掉上清收集沉淀表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的重组大肠杆菌，称量后-20℃保存备用。
将冻存的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的重组大肠杆菌放置于冰上孵育，按照1g菌体/10mL细胞破碎液的比例加入细胞破碎液，使菌体充分溶解后在超声破碎机中进行超声破碎，设置参数为功率400W，超5s，间隙8s，40min。破碎后4℃16000rpm离心40min，收集上清，用0.45μm的水系滤膜过滤上清溶液，除去杂质后得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE粗酶液。最后通过Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和色谱纯化目的蛋白D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE。
纯化的具体步骤如下：用超纯水和PBS缓冲液清洗柱床，各300ml；将收集到的细胞破碎液过柱；再用PBS缓冲液清洗柱子，重复多次；加入500mM适量洗脱液，封柱孵育10～20min，使蛋白充分洗脱；收集洗脱液，脱盐后加入10％的甘油，-20℃保存。
采用BCA法测定D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE，得重组大肠杆菌表达DPE的表达量为22.3mg/L培养基，重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的条带清晰，纯化后的重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE纯度在95％以上。对重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳结果如图1所示，M为Marker；1为诱导前样品；2为诱导后样品；3为沉淀；4为上清；5为穿透液1；6为穿透液2；8:脱盐前样品；8为脱盐后样品；由图可知，D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的分子量大小与理论值一致(32kDa)。
实施例2
D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE性质的测定：
为测定纯化后的D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的最适温度，以50g/L的D-果糖为底物在30℃～90℃的温度范围内，分别选定30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下进行反应，确定出D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE的最适温度为70℃，在最适条件下的酶活为4.68U/mg/min。
为测定DPE酶的热稳定性，将酶在30℃～90℃的温度下中孵育1h后，以50g/L的D-果糖为底物对DPE酶的活性进行测定，分别选定30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下进行反应，将未温育处理的对照组酶活定义为相对酶活的100％。可以发现随着温度的升高DPE酶的热稳定性逐渐下降，在30℃～90℃温度范围内残余酶活在96.2％～26.1％之间，将酶在60℃环境中孵育1h，残余酶活在60％以上，将酶在高于70℃环境孵育1h，残余酶活为50％。
为测定DPE酶的最适pH，在pH为5.5～9的环境中以50g/L的D-果糖为底物，对DPE酶的活性进行测定，分别选定pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9，酶活最高的一组定义其相对酶活为100％。可以发现DPE酶的最适pH为7.0，在pH高于6的反应环境中相对酶活都高于60％，契合D-阿洛酮糖工业化反应的要求。
为测定DPE酶的pH稳定性，将酶在pH为5.5～9的环境中孵育4h后，以50g/L的D-果糖为底物对DPE酶的活性进行测定，将未温育处理的对照组酶活定义为相对酶活的100％。分别选定pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9，可以发现DPE酶的pH稳定性良好，将酶在pH为7.0的环境中孵育4h，残余酶活为98.47％。在pH 6.5～8.0的环境孵育4h，残余酶活在75％以上，高度契合D-阿洛酮糖工业化反应的要求。
实施例3
D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的构建及表达：
通过半理性设计，使用Autodock分子对接得到酶与底物结合的分子模型，选择活性中心以内的氨基酸进行结构分析，并与其他生物的DPE酶结构进行比对，选择非保守的9个氨基酸残基35Glu、37Pro、64Leu、65Gly、103Cys、104Gly、105Val、177His、209Ser进行定点突变。
首先，通过PCR的方法，设计对应的引物以pET-28a(+)-DPE为模板对目标位点进行突变。PCR的反应体系为20ul，PrimeSTAR Max 10ul，上游引物、下游引物各1ul，模板1ul，ddH2O 7ul；PCR程序：预变性98℃2min；变性98℃10s，退火55℃30s，延伸72℃90s，25个循环；终止延伸72℃5min，得到25个不同突变重组质粒。
取10μl不同突变后的重组质粒进行核酸电泳检测，确定PCR是否成功，确定成功后使用Dpn I酶切去除模板质粒，反应体系为10μl，突变后的重组质粒9μl，Dpn I酶1μl，在37℃反应4h，反应结束后，将10μl酶切后的突变重组质粒转化至E.coli DH5α感受态细胞。37℃，200rpm，45min后涂在含有kana的LB固体培养基中，37℃恒温过夜，然后挑取阳性单克隆进行DNA测序以及质粒提取。
然后将不同突变体的质粒导入转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，构建表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的重组大肠杆菌。
将含有以上质粒的重组大肠杆菌划线于含有Kana抗生素的固体LB平板上。用接种环挑取LB固体培养基的单克隆，接种到液体LB养基中，加入终浓度为50ug/ml kana抗生素，在37℃，200rpm过夜培养。将培养的菌液，按1％的接种量接种到液体LB培养基中，在37℃，200rpm培养至OD值为0.6～1时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，将温度调至30℃培养12-16h，通过低温离心机(4℃，4000rpm，30min)离心，倒掉上清收集沉淀D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的重组大肠杆菌，称量后-20℃保存备用。
将冻存的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的重组大肠杆菌放置于冰上孵育，按照1g菌体/10mL细胞破碎液的比例加入细胞破碎液，使菌体充分溶解后在超声破碎机中进行超声破碎，设置参数为功率400W，超5s，间隙8s，40min。破碎后4℃16000rpm离心40min，收集上清，用0.45μm的水系滤膜过滤上清溶液，除去杂质后得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的粗酶液。
SDS-PAGE电泳结果如图2所示。由图2可知，通过与蛋白Marker对比：其中野生、G65Q、G65I、P37H、P37C突变体酶的可溶性蛋白表达量较高，G35K、V105A、L64C突变体有少量可溶性蛋白表达，其余突变体可溶性表达量极低。
实施例4
D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的筛选：
标准曲线的制定：配制2mg/L的D-果糖母液和2mg/L D-阿洛酮糖母液。用超纯水分别将母液稀释配制为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0梯度的标准溶液，用0.22μm的水系滤膜过滤反应液，HPLC进行检测，绘制D-果糖和D-阿洛酮糖标准曲线，如图3所示。
HPLC检测条件为：赛默飞型HPLC，Shodex SUGAR SP0810糖柱，赛默飞蒸发光检测器，柱温80℃，流动相为超纯水，流速1mL/min。
以2g/L的D-果糖为底物，加入40μL不同突变体细胞破碎的上清，即D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的粗酶液(酶过量)，每种突变体D-阿洛酮糖3-差向异构酶在70℃和pH7.0下反应20min，煮沸10min终止反应。将反应液用0.22μm水系滤膜过滤，超声5min，使用HPLC进行检测。
底物转化率计算方法为：在酶过量的条件下反应20min，生成D-阿洛酮糖的量与初始D-果糖总量的比值(单位％)。
实验结果如表1所示，D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶的底物转化率为44.56％，是野生型DPE酶的底物转化率的1.5倍。因此选择转化率最高的突变体P37H，作为最佳突变体，对其进行酶学性质研究。
表1为不同DPE突变体酶底物转化率的比较
注：—指未检测到D-阿洛酮糖的生成。
实施例5
D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的纯化及性质测定：
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的纯化：
将实施例4中得到得粗酶液通过Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和色谱纯化目的蛋白。
纯化的具体步骤如下：用超纯水和PBS缓冲液清洗柱床，各300ml；将收集到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H粗酶液过柱；再用PBS缓冲液清洗柱子，重复多次；加入500mM适量洗脱液，封柱孵育10～20min，使蛋白充分洗脱；收集洗脱液，脱盐后加入10％的甘油，-20℃保存。
通过BCA法，测得重组大肠杆菌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的表达量为11mg/L培养基，重组蛋白的条带清晰，纯化后的蛋白纯度在95％以上。SDS-PAGE电泳结果如图4所示，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的分子量大小与理论值一致(32kDa)。
(2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H性质的测定：
为检测D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的最适温度，在40℃～90℃的范围内，以50g/L的D-果糖为底物对突变体P37H的活性进行测定，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的温度下进行测定，将酶活最高的一组定义其相对酶活为100％。测定结果如图5。由图5可知突变体P37H的最适反应温度为60℃，但在70℃条件下相对酶活依旧在80％以上。
为检测D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的热稳定性，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H在40℃～90℃的温度下中孵育1h后，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的温度下进行测定，以50g/L的D-果糖为底物对突变体P37H的活性进行测定，将未温育处理的对照组酶活定义为相对酶活的100％，测定结果如图6。由图6可知突变体P37H在40℃～60℃时热稳定性良好，残余酶活基本在80％以上，但当温度大于60℃时突变体P37H的热稳定性急剧下降。
为检测D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的最适pH，在pH为5～10的环境中以50g/L的D-果糖为底物，对突变体P37H的活性进行测定，分别在pH为5、6、7、7.5、8、8.5、9和10进行测定，酶活最高的一组定义其相对酶活为100％。测定结果如图7，由图7可知D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的最适pH为7.5
为检测突D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的pH稳定性，将酶在pH为5～10的环境中孵育4h后，以50g/L的D-果糖为底物对突变体P37H的活性进行测定，pH为5、6、7、7.5、8、8.5、9和10进行测定，将未温育处理的对照组酶活定义为相对酶活的100％，测定结果如图8。由图8可知D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H在pH为8.0的环境中残余酶活为96.78％。在pH 7.0～8.0的环境孵育4h，残余酶活在75％以上。
实施例6
D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的固定化及性质的测定：
(1)D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的固定化：
对D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H进行固定化：称取预处理的环氧树脂和活化后的氨基树脂各4g于50mL锥形瓶中，各加入20mL的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H溶液，20℃，100rpm，4h后用磷酸缓冲溶液洗涤固定化树脂2～3次后，真空抽滤4℃保存。
树脂处理方法：取适量树脂用磷酸缓冲溶液对环氧树脂清洗3～5次，真空干燥处理，密封后室温保存。
氨基树脂需要用活化剂戊二醛活化，为了测定最适活化剂浓度，配制不同质量浓度的戊二醛溶液分别为2％、4％、6％、8％、10％，各取20mL于锥形瓶中加入5g氨基树脂，20℃，150rpm活化4h，用磷酸缓冲溶液清洗3～5次后真空抽滤干燥处理，测定最适活化剂浓度。通过实验测试发现，戊二醛的浓度为6％时LX-1000HA的载酶量最多为33.16mg/g，因此在后续实验中以择6％戊二醛浓度活化树脂。
称取预处理的环氧树脂和氨基树脂各1g于离心管中，再各自加入5mL蛋白浓度为8.5mg/mL的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H溶液，20℃，100rpm固定4h后真空抽滤。通过计算发现LX-1000HA的载酶量为33.41mg/g，固定化酶活为4.82U/mg；LX1000EA的载酶量为28.68mg/g，固定化酶活为3.51U/mg；LX-1000EP的载酶量为15.44mg/g，固定化酶活为1.27U/mg；通过树脂载酶量和固定化酶的酶活力的比较，本发明选择LX-1000HA为最佳固定化载体对突变体P37H进行固定化。
(2)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的性质测定：
为检测固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的最适温度：在30℃～90℃的温度下，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的温度下进行测定，以50g/L的D-果糖为底物对固定化P37H的活性进行测定，酶活最高的一组定义其相对酶活为100％，测定结果如图9。固定化的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的最适温度为60℃，与对应的游离酶一致。
为检测固定化酶P37H的热稳定性，将固定化酶P37H在30℃～90℃的温度下中孵育1h后，以50g/L的D-果糖为底物对固定化酶P37H的活性进行测定，将未温育处理的对照组酶活定义为相对酶活的100％，测定结果如图10。相较于游离酶，固定化酶无论是野生型还是突变体其热稳定性都有所提高。但相比于野生型酶固定化酶，突变体P37H固定化酶热稳定性更好，将酶在60℃的环境中孵育1h，残余酶活依旧高达85％以上，是非常理想的工业化生产用酶
为测定固定化酶P37H的最适pH，在pH为5～10的环境中以50g/L的D-果糖为底物，对固定化酶P37H的活性进行测定，酶活最高的一组定义其相对酶活为100％，测定结果如图11。野生型固定化酶的最适pH为7.5，突变体P37H固定化酶最适pH为8.0，无论是野生型固定化酶还是突变体P37H固定化酶，他们的最适pH相比于游离酶都有所提高。
为测定固定化酶P37H的pH稳定性，将酶在pH为5～10的环境中孵育4h后，以50g/L的D-果糖为底物对固定化酶P37H的活性进行测定，将未温育处理的对照组酶活定义为相对酶活的100％，测定结果如图12。突变体P37H固定化酶在pH为5和10的条件下，仍具有一定酶活。野生型固定化酶在pH为7～7.5条件下，残余酶活在85％以上；突变体P37H固定化酶在pH为7.5～8.0的条件下，残余酶活在85％以上，两种酸碱稳定性都很好，且固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H在pH 7.0的环境中残余酶活也在65％以上，基本适用于工业化生产的要求。
为测定反应时间对底物转化率的影响，以50g/L的D-果糖为底物，在最适温度下使用突变体P37H进行催化反应，检测结果如图13所示。随着反应时间的延迟，底物的转化率逐渐达到平衡，当时间达到3h使反应已经基本达到平衡，后续随着时间的增加底物转化率基本不变。因此我们确定的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H最佳反应时间为3h。
为检测固定化酶的操作稳定性，在最适条件下进行反应，反应结束后，分离固定化酶重新进行下一批次反应，重复七次。检测相对转化率结果如图14，以第一次反应批次的底物转化率为100％，经过连续的七个批次的反应，固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H催化底物的相对转化率在70％以上。
<110> 西北工业大学
<120> 一种D-阿洛酮糖 3-差向异构酶及其固定化方法
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID NO1
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO1
ATGAAAATCGGCTGTCACGGTCTGGTTTGGACCGGTCATTTTGACGCGGAAGGCATTCGT 60
TATAGCGTTCAGAAAACCCGCGAAGCAGGTTTCGATCTGGTTGAATTCCACCTGATGGAC 120
CCGTTTAGCTTCGACGTTCAGACCGCAAAATCTGCACTGGCAGAACACGGTCTGGCAGCA 180
TCTGCAAGTCTGGGTCTGTCTGACGCAACCGATGTTAGCAGCGAAGATCCGGCAGTTGTT 240
AAAGCAGGCGAAGAACTGCTGAATCGCGCAGTTGATGTTCTGGCAGAACTGGGCGCAACC 300
GATTTTTGCGGCGTTATCTACAGCGCGATGAAAAAATATATGGAACCGGCGACCGCGGCA 360
GGTCTGGCAAATAGTAAAGCGGCAGTTGGTCGCGTTGCAGATCGCGCATCAGATCTGGGT 420
ATTAACGTCAGCCTGGAAGTCGTTAACCGCTACGAAACCAACGTCCTGAATACCGGTCGT 480
CAAGCACTGGCGTATCTGGAAGAACTGAACCGTCCGAATCTGGGCATTCATCTGGACACC 540
TACCACATGAACATCGAAGAGAGCGACATGTTTTCCCCGATTCTGGATACCGCAGAAGCA 600
CTGCGTTACGTTCACATTGGCGAAAGCCATCGCGGTTATCTGGGTACCGGTTCTGTTGAT 660
TTCGATACCTTCTTTAAAGCGCTGGGTCGCATTGGTTACGACGGTCCGGTCGTCTTTGAA 720
AGCTTTAGCAGTAGCGTTGTTGCACCGGATCTGTCTCGTATGCTGGGTATTTGGCGCAAT 780
CTGTGGGCAGATAACGAAGAACTGGGCGCACACGCAAACGCGTTTATCCGCGATAAACTG 840
ACCGCGATCAAAACCATCGAACTGCATTAA 870
<210> SEQ ID NO2
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO2
MKIGCHGLVWTGHFDAEGIRYSVQKTREAGFDLVEFHLMDPFSFDVQTAK 50
SALAEHGLAASASLGLSDATDVSSEDPAVVKAGEELLNRAVDVLAELGAT 100
DFCGVIYSAMKKYMEPATAAGLANSKAAVGRVADRASDLGINVSLEVVNR 150
YETNVLNTGRQALAYLEELNRPNLGIHLDTYHMNIEESDMFSPILDTAEA 200
LRYVHIGESHRGYLGTGSVDFDTFFKALGRIGYDGPVVFESFSSSVVAPD 250
LSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDKLTAIKTIELH 289

Claims (7)

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，其特征在于，所述突变体酶P37H的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的编码基因。
4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含权利要求3所述的一种重组表达载体。
5.一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，其特征在于，由权利要求1所述的固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体P37H负载于环氧树脂或氨基树脂载体上制备而得。
6.如权利要求5所述的一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H，其特征在于，所述固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体P37H与树脂载体的质量比为5～40。
7.如权利要求6所述的一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将经戊二醛活化的氨基树脂中加入D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶P37H溶液，孵育即得。
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