CN114250210B - 双果糖酐水解酶活力提高的突变体a175l - Google Patents

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Abstract

本发明公开了双果糖酐水解酶活力提高的突变体A175L，属于基因工程技术领域。本发明以来源于微生物Arthrobacter chlorophenolicus A6的双果糖酐水解酶(AcDFA‑IIIase)作为亲本酶，利用基因突变技术，将其氨基酸序列的第175位的丙氨酸替换成亮氨酸，获得单点突变体酶A175L，在最适催化条件下(pH 6.5，55℃)催化底物双果糖酐合成菊二糖的活力提高了3.1倍，催化效率提高了近5倍。双果糖酐水解酶突变体A175L为进一步工业应用双果糖酐水解酶提供了有利保障。

Description

双果糖酐水解酶活力提高的突变体A175L
技术领域
本发明涉及双果糖酐水解酶活力提高的突变体A175L，属于基因工程技术领域。
背景技术
自然界中普遍存在着各种各样的多糖聚合物，如淀粉是葡萄糖单元聚合而成的葡聚糖，而有果糖单元聚合而成的多糖聚合物为果聚糖。果聚糖存在于双子叶植物中，其主要用来提高植物的耐旱能力，还可以起到液泡渗透缓冲剂和低温保护剂的作用，这是由于植物中的果聚糖在细胞液泡中起到调节渗透压的作用。果聚糖也大量存在于微生物包括细菌和真菌中，用以保护细胞和防止失水。
其中，果糖基通过β-(2,1)键聚合而成的果聚糖为菊糖，其末端含有一分子葡萄糖，整体不显示还原性。作为一种膳食纤维，且价格比较便宜,目前应用广泛。菊糖在自然界或者人体肠道中有不同的代谢途径，其中一条途径可以先通过菊糖果糖转移酶被转化成为益生元双果糖酐。双果糖苷是一种新型功能性甜味剂，在人体上消化道中不被消化吸收到达大肠，在大肠中主要通过肠道微生物中的双果糖酐水解酶水解为菊二糖(inulobiose)，菊二糖进一步被微生物果糖苷酶水解成为果糖而被人体吸收利用。
目前对于菊糖、双果糖酐、果糖的研究较为透彻，但是对于菊二糖的研究较少，其生理功能未有相关报道，甚至理化性质研究也鲜有报道。菊糖代谢途径中其它糖都具有重要生理功能，因此，菊二糖应该也是一种功能糖。市场上并无菊二糖纯样品可售，目前极少有关菊二糖合成报道，这可能限制了生产和性质研究。目前对菊二糖合成研究处于初级阶段，主要是利用双果糖酐水解酶水解菊二糖获得。但双果糖酐水解酶活力较低，因此，筛选获得高效合成菊二糖双果糖酐水解酶是目前关键方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过对微生物Arthrobacter chlorophenolicus A6来源的双果糖酐水解酶进行分子改造，获得酶活和催化效率都显著提高的双果糖酐水解酶突变体。
本发明提供了一种双果糖酐水解酶突变体A175L，所述突变体A175L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了编码上述双果糖酐水解酶突变体A175L的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET系列为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET-22a(+)为表达载体。
本发明提供了携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为表达宿主。
本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为表达宿主，以pET-22b(+)为载体，表达上述双果糖酐水解酶突变体A175L。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供了一种提高双果糖酐水解酶热稳定性的方法，所述方法为在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第175位的丙氨酸替换成亮氨酸。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述基因工程菌或上述方法在食品领域中的应用。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述基因工程菌或上述方法在制备含有菊二糖的产品中的应用。
有益效果：
1、本发明微生物Arthrobacter chlorophenolicus A6来源的双果糖酐水解酶进行分子改造，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第175位氨基酸进行定点突变，获得了酶活和催化效率都显著提高的突变酶A175L。本发明提供的突变体A175L对于工业化制备菊二糖具有重要意义。
2、本发明提供的突变体A175L与野生酶相比，最适催化条件相同，即最适反应pH为6.5，最适反应温度为55℃，但酶活提高了3.1倍，由原来的101.25U mg-1提高到313.88U mg-1；催化效率提高了近5倍，由原来的4.61s-1mM-1提高到23.05s-1mM-1。采用本发明的突变体，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，降低了反应的成本。
附图说明
图1：双果糖酐水解酶及其突变体A175L的SDS-PAGE；
图2：温度对双果糖酐水解酶及其突变体A175L酶活影响；
图3：pH对双果糖酐水解酶及其突变体A175L酶活影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
下述实施例中涉及的培养基如下：
培养基均使用ddH2O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。
LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。
LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉15g/L。
实施例1：双果糖酐水解酶的制备及表达纯化
编码双果糖酐水解酶的基因来源于微生物Arthrobacter chlorophenolicus A6(该菌种在GenBank中基因组编号是CP001341)，全长为1338个核苷酸(SEQ ID NO.2)，双果糖酐水解酶基因编号为Achl_2895。该基因所编译的长度为445个氨基酸的蛋白质编号为ACL40859.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
1)菌株构建
合成全长为1338个核苷酸的双果糖酐水解酶全基因并在基因片段两端分别添加限制性内切位点Nde I和Xho I，C端添加组氨酸标签，用于镍离子亲和色谱分离纯化实验用。将合成的基因亚克隆到质粒载体pET-22b(+)上，构建出重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase。
将重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，将100μL重组细胞液涂布在含有100μg mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养16小时获得阳性转化子，并挑选单克隆转化子于含有50μg mL-1的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养获得种子液；将种子液按照体积比2％接入到500mL LB液体培养基37℃培养3～4h至OD值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.6mM，在30℃，200rpm诱导培养6h，获得发酵液。
2)蛋白纯化
将发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min收集菌体细胞沉淀。加入20mL缓冲液(50mMPBS，200mM NaCl，调节pH至6.5)充分重悬菌体后放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎(超声l s，停顿2s，共计18min)，菌体超声破碎液体经4℃、10000rpm离心30min并用0.45μm微孔滤膜过滤备用，获得粗酶液。
将粗酶液经镍离子亲和层析纯化，透析袋中过夜透析得到AcDFA-IIIase纯酶液，见图1，SDS-PAGE显示AcDFA-IIIase纯酶液达到电泳纯级别。
实施例2：双果糖酐水解酶突变体的制备及表达纯化
(1)双果糖酐水解酶的突变体A175L的制备
以双果糖酐水解酶重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase为模板进行175位点的突变引物设计，构建突变质粒pET-22b(+)-A175L。以实施例1中的重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase为模版和引物进行全质粒PCR，
突变正向引物：5’-TCATGTTGCAAGCCTTAATGATAGCT-3’；
突变反向引物：5’-GCTATCATTAAGGCTTGCAACATG-3’。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2mmol/L)4μL，突变正向引物(10μM)1μL，突变反向引物(10μM)1μL，模板pET-22b(+)-AcDFA-IIIase 1μL，聚合酶Taq Plus DNApolymerase(5U/μL)0.5μL，最后使用ddH2O将体系补足至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火l min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃保温10min。
PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测并经测序鉴定为阳性A175L突变，将鉴定正确的突变质粒命名为pET-22b(+)-A175L。
(2)双果糖酐水解酶突变体的表达纯化
将突变质粒pET-22b(+)-A175L转化至宿主Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，于含有100μg mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上均匀涂布，37℃培养16小时获得阳性转化子，并挑选单克隆转化子在含有50μg mL-1的氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养获得种子液；将种子液按照体积比2％接入到500mL LB液体培养基37℃培养3～4h至OD值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.6mM，在30℃，200rpm诱导培养6h，获得发酵液。
将发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min收集菌体细胞沉淀。加入20mL缓冲液(50mMPBS，200mM NaCl，调节pH至6.5)充分重悬菌体后放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎(超声l s，停顿2s，共计18min)，菌体超声破碎液体经4℃、10000rpm离心30min并用0.45μm微孔滤膜过滤备用，获得粗酶液。
将粗酶液使用镍离子亲和层析柱分离纯化，透析袋中过夜透析得到变体酶A175L纯酶液，见图1，SDS-PAGE显示变体酶A175L纯酶液达到电泳纯级别，见图1。
实施例3：测定双果糖酐水解酶与突变体A175L酶活
本实施例比较了突变前后酶活变化情况，酶活测定方法：1mL反应体系中包含10gL-1双果糖酐、50mM pH 6.5磷酸盐缓冲液和100noml L-1纯酶液，55℃反应10min，沸水浴10min终止反应。10000×g 4℃离心20min，反应液经0.22μm滤膜过滤处理后使用高效液相色谱仪测定，使用分析柱为糖柱Sugar-Pak I(4.6mm×250mm,Waters,MA,USA)配备示差折光显示器检测菊二糖。1U酶活定义为在pH 6.5，55℃条件下反应，每分钟生成1μmol产物菊二糖所需要的酶量。
酶活比较：双果糖酐水解酶的酶活为101.25U mg-1，突变体A175L的酶活为313.88Umg-1，即突变体酶活提高了3.1倍。催化效率Kcat/Km由原来的4.61s-1mM-1提高到23.05s-1mM-1。
实施例4：双果糖酐水解酶与A175L的最适催化条件
(1)最适反应温度
1mL的反应体系(10g L-1底物双果糖酐、50mM pH 6.5磷酸盐缓冲液和100nmol L-1纯酶液)，分别在不同温度下(30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃)反应10min，沸水浴10min终止反应。在l0000 rpm 4℃离心20min，0.22μm滤膜过滤上样至高效液相色谱仪。使用糖柱Sugar-Pak I(4.6mm×250mm,Waters,MA,USA)和示差折光显示器检测菊二糖。1U酶活定义为在pH 6.5，55℃条件下反应，每分钟生成1μmol菊二糖所需要的酶量。
结果如图2所示，双果糖酐水解酶及突变体酶A175L均是在为55℃左右具有较好催化活性。
(2)最适反应pH
1mL的反应体系(10g L-1底物双果糖酐、50mM缓冲液和100nmol L-1纯酶液)于55℃分别在不同pH缓冲溶液(pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)中反应10min，沸水浴10min终止反应。在l0000 rpm 4℃离心20min后，反应液经过0.22μm滤膜过滤后上样至高效液相色谱仪。使用糖柱Sugar-Pak I(4.6mm×250mm,Waters,MA,USA)和示差折光显示器用于检测菊二糖。1U酶活定义为在pH 6.5，55℃条件下反应，每分钟生成1μmol菊二糖所需要的酶量。
结果如图3所示，对于双果糖酐水解酶与突变体A175L均是在pH为6.5左右具有较好催化活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 双果糖酐水解酶活力提高的突变体A175L
<130> BAA211682A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Pro Ser Asn Asn Arg Tyr Asp Val Thr Glu Trp Pro Ala Gly Asn
1 5 10 15
Pro Ala Lys Asp Ile Gly Glu Val Ile Asn Ser Ile Ile Ala Asp Ile
20 25 30
Lys Ala Arg Gln Gly Ala Ala Asp Val Asp Asp Gly Gly Lys Pro Gly
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Leu Pro Pro Gly Asp Tyr His Leu Arg Thr Gln Val
50 55 60
Leu Ile Asp Ile Ser Phe Leu Arg Ile Glu Gly Ser Gly His Gly Phe
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ser Ile Arg Phe Asn Val Pro Glu Glu Glu Trp Pro Asp
85 90 95
Leu His Glu Leu Trp Pro Gly Gly Ser Arg Val Ile Val Asp Leu Pro
100 105 110
Ala Gly Gly Ala Gly Asp Ser Ala Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ala
115 120 125
Arg Glu Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Val Glu Phe Ser Asn Phe Cys
130 135 140
Ile Asp Gly Leu His Phe Thr Ala Asp Gly Ser Gly Arg His Pro Glu
145 150 155 160
Asn Thr Tyr Ala Asn Gly Lys Thr Gly Ile His Val Ala Ser Ala Asn
165 170 175
Asp Ser Phe Arg Val Thr Asp Met Gly Phe Val Tyr Leu Glu Asn Ala
180 185 190
Leu Thr Ile His Lys Ala Asp Ala Leu Ser Ile His His Asn Phe Ile
195 200 205
Ala Glu Cys Gly Ser Cys Ile Glu Leu Arg Gly Trp Gly Gln Ala Ser
210 215 220
Lys Ile Thr Asp Asn Leu Val Gly Ala Gly Pro Arg Gly His Ser Ile
225 230 235 240
Tyr Ala Glu Asn His Gly Gly Leu Leu Val Thr Ala Asn Asn Val Phe
245 250 255
Pro Arg Gly Ala Ser Ser Val His Phe Lys Gly Val Thr Arg Ser Ser
260 265 270
Val Thr Asn Asn Arg Leu His Ala Phe Tyr Pro Gly Met Val Arg Leu
275 280 285
Glu Glu Asn Ser Ser Glu Asn Leu Val Ala Thr Asn His Phe Leu Arg
290 295 300
Asp His Glu Pro Trp Thr Pro Phe Phe Gly Val Asp Asn Gly Leu Asp
305 310 315 320
Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ser Ile Ser Gly Asn Asn Asn Ser Val Ile
325 330 335
Gly Asn His Phe Ser Glu Val Val Asp Ala Asn Glu Ile Arg Pro Glu
340 345 350
Gly Ala Thr Pro Val Ile Ile Arg Leu Thr Ala Gly Thr Gly Asn Phe
355 360 365
Val Ser Thr Asn His Val Val Ala Met Asp Val Asp Ala Ala Ser Ser
370 375 380
Asp Ser Cys Phe Glu Ala Gln Val Asp Ala Leu Leu Ala Thr Glu Ala
385 390 395 400
Ala Asp Leu Ala Val Thr Ala Val Leu Val Asp Pro Gly Ser Ala Arg
405 410 415
Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gly Ser Asp Thr Gln Val Val Ala Asp Arg
420 425 430
Ala Val Asn Ala Ile Arg Ala Thr Pro Thr Val Gly Phe
435 440 445
<210> 2
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgccgagta ataatcgcta tgatgtgacc gaatggccgg caggcaatcc ggccaaagat 60
attggcgaag tgattaatag tattattgca gatattaaag cacgtcaggg cgcagcagat 120
gtggatgatg gcggtaaacc gggcgccgtt atttatctgc cgccgggcga ttatcatctg 180
cgtacccagg tgctgattga tattagcttt ctgcgtattg aaggctcagg tcatggcttt 240
acctcttcaa gcattcgctt taatgttccg gaagaagaat ggccggattt acatgaactg 300
tggccgggcg gtagtcgtgt gattgtggat ctgccggcag gcggtgcagg cgattcagcc 360
gcaggcgcag cctttctggt tgcacgcgaa ggctctccgc gcattagttc agttgaattt 420
tcaaattttt gtattgatgg cttacatttt accgccgatg gtagcggtcg ccatccggaa 480
aatacctatg ccaatggtaa aaccggcatt catgttgcaa gcgccaatga tagctttcgt 540
gtgaccgata tgggctttgt gtatctggaa aatgccttaa ccattcataa agcagatgcc 600
ctgtctattc atcataattt tattgccgaa tgtggttctt gtattgaact gcgcggttgg 660
ggtcaggcct ctaaaattac cgataattta gtgggtgcag gtccgcgcgg ccatagtatt 720
tatgcagaaa atcatggcgg cctgctggtg accgcaaata atgtgtttcc gcgtggtgca 780
agctcagtgc attttaaagg cgtgacccgc tcttcagtta ccaataatcg cttacatgcc 840
ttttatccgg gtatggttcg tttagaagaa aattctagtg aaaatctggt tgccaccaat 900
cattttctgc gcgatcatga accgtggacc ccgttttttg gtgtggataa tggcttagat 960
gatctgaccg gcctgctgtc tattagcggt aataataata gcgttattgg caatcatttt 1020
agcgaagttg ttgatgcaaa tgaaattcgt ccggaaggtg caaccccggt gattattcgt 1080
ctgaccgcag gcaccggcaa ttttgtgtca accaatcatg ttgttgcgat ggatgttgat 1140
gcagcaagta gcgatagctg ttttgaagcc caggtggatg ccctgttagc caccgaagca 1200
gcggacctgg ccgttaccgc cgtgctggta gatccaggta gtgcacgtaa taccattctg 1260
gatagcggct cagataccca ggttgttgcc gatcgcgcag tgaatgccat tcgcgcgact 1320
ccaacggtgg gcttttaa 1338
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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1 5 10 15
Pro Ala Lys Asp Ile Gly Glu Val Ile Asn Ser Ile Ile Ala Asp Ile
20 25 30
Lys Ala Arg Gln Gly Ala Ala Asp Val Asp Asp Gly Gly Lys Pro Gly
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Leu Pro Pro Gly Asp Tyr His Leu Arg Thr Gln Val
50 55 60
Leu Ile Asp Ile Ser Phe Leu Arg Ile Glu Gly Ser Gly His Gly Phe
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ser Ile Arg Phe Asn Val Pro Glu Glu Glu Trp Pro Asp
85 90 95
Leu His Glu Leu Trp Pro Gly Gly Ser Arg Val Ile Val Asp Leu Pro
100 105 110
Ala Gly Gly Ala Gly Asp Ser Ala Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ala
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130 135 140
Ile Asp Gly Leu His Phe Thr Ala Asp Gly Ser Gly Arg His Pro Glu
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165 170 175
Asp Ser Phe Arg Val Thr Asp Met Gly Phe Val Tyr Leu Glu Asn Ala
180 185 190
Leu Thr Ile His Lys Ala Asp Ala Leu Ser Ile His His Asn Phe Ile
195 200 205
Ala Glu Cys Gly Ser Cys Ile Glu Leu Arg Gly Trp Gly Gln Ala Ser
210 215 220
Lys Ile Thr Asp Asn Leu Val Gly Ala Gly Pro Arg Gly His Ser Ile
225 230 235 240
Tyr Ala Glu Asn His Gly Gly Leu Leu Val Thr Ala Asn Asn Val Phe
245 250 255
Pro Arg Gly Ala Ser Ser Val His Phe Lys Gly Val Thr Arg Ser Ser
260 265 270
Val Thr Asn Asn Arg Leu His Ala Phe Tyr Pro Gly Met Val Arg Leu
275 280 285
Glu Glu Asn Ser Ser Glu Asn Leu Val Ala Thr Asn His Phe Leu Arg
290 295 300
Asp His Glu Pro Trp Thr Pro Phe Phe Gly Val Asp Asn Gly Leu Asp
305 310 315 320
Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ser Ile Ser Gly Asn Asn Asn Ser Val Ile
325 330 335
Gly Asn His Phe Ser Glu Val Val Asp Ala Asn Glu Ile Arg Pro Glu
340 345 350
Gly Ala Thr Pro Val Ile Ile Arg Leu Thr Ala Gly Thr Gly Asn Phe
355 360 365
Val Ser Thr Asn His Val Val Ala Met Asp Val Asp Ala Ala Ser Ser
370 375 380
Asp Ser Cys Phe Glu Ala Gln Val Asp Ala Leu Leu Ala Thr Glu Ala
385 390 395 400
Ala Asp Leu Ala Val Thr Ala Val Leu Val Asp Pro Gly Ser Ala Arg
405 410 415
Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gly Ser Asp Thr Gln Val Val Ala Asp Arg
420 425 430
Ala Val Asn Ala Ile Arg Ala Thr Pro Thr Val Gly Phe
435 440 445
<210> 4
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgccgagta ataatcgcta tgatgtgacc gaatggccgg caggcaatcc ggccaaagat 60
attggcgaag tgattaatag tattattgca gatattaaag cacgtcaggg cgcagcagat 120
gtggatgatg gcggtaaacc gggcgccgtt atttatctgc cgccgggcga ttatcatctg 180
cgtacccagg tgctgattga tattagcttt ctgcgtattg aaggctcagg tcatggcttt 240
acctcttcaa gcattcgctt taatgttccg gaagaagaat ggccggattt acatgaactg 300
tggccgggcg gtagtcgtgt gattgtggat ctgccggcag gcggtgcagg cgattcagcc 360
gcaggcgcag cctttctggt tgcacgcgaa ggctctccgc gcattagttc agttgaattt 420
tcaaattttt gtattgatgg cttacatttt accgccgatg gtagcggtcg ccatccggaa 480
aatacctatg ccaatggtaa aaccggcatt catgttgcaa gccttaatga tagctttcgt 540
gtgaccgata tgggctttgt gtatctggaa aatgccttaa ccattcataa agcagatgcc 600
ctgtctattc atcataattt tattgccgaa tgtggttctt gtattgaact gcgcggttgg 660
ggtcaggcct ctaaaattac cgataattta gtgggtgcag gtccgcgcgg ccatagtatt 720
tatgcagaaa atcatggcgg cctgctggtg accgcaaata atgtgtttcc gcgtggtgca 780
agctcagtgc attttaaagg cgtgacccgc tcttcagtta ccaataatcg cttacatgcc 840
ttttatccgg gtatggttcg tttagaagaa aattctagtg aaaatctggt tgccaccaat 900
cattttctgc gcgatcatga accgtggacc ccgttttttg gtgtggataa tggcttagat 960
gatctgaccg gcctgctgtc tattagcggt aataataata gcgttattgg caatcatttt 1020
agcgaagttg ttgatgcaaa tgaaattcgt ccggaaggtg caaccccggt gattattcgt 1080
ctgaccgcag gcaccggcaa ttttgtgtca accaatcatg ttgttgcgat ggatgttgat 1140
gcagcaagta gcgatagctg ttttgaagcc caggtggatg ccctgttagc caccgaagca 1200
gcggacctgg ccgttaccgc cgtgctggta gatccaggta gtgcacgtaa taccattctg 1260
gatagcggct cagataccca ggttgttgcc gatcgcgcag tgaatgccat tcgcgcgact 1320
ccaacggtgg gcttttaa 1338

Claims (10)

1.一种双果糖酐水解酶突变体A175L，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述双果糖酐水解酶突变体A175L的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pET-22a(+)为表达载体。
5.携带权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组载体的微生物细胞。
6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为表达宿主，以pET-22b(+)为载体，表达权利要求1所述的双果糖酐水解酶突变体A175L。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括E. coli BL21（DE3）。
9.一种提高双果糖酐水解酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第175位的丙氨酸替换成亮氨酸。
10.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组载体，或权利要求5或6所述微生物细胞，或权利要求7或8所述基因工程菌，或权利要求9所述方法在制备含有菊二糖的产品食品领域中的应用。
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