CN110396512B - 一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用 - Google Patents
一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用，属于酶工程领域。本发明首先对微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604来源的菊糖蔗糖酶进行截断处理，在5’端和3’端分别截断411和702个核苷酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的中间序列，然后在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸Asp突变为谷氨酸Glu后得到突变体酶D288E，突变体酶D288E的总酶活为326U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(248U/mg)相比提高了31.45％，这一发现对于工业化制备菊糖具有重要的研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用，属于酶工程领域。
背景技术
果聚糖具有优异的理化性质和生理功能，在改善食品表观特性和营养价值上具有潜在的重大价值。如：可作为脂肪替代品，低热量的甜味剂、乳化剂、增稠剂和质构修饰剂应用于奶酪，酸奶，冰淇淋，面包以及许多其他的产品中以改善食品的质构、感官特性并提高食品货架期。此外，果聚糖在生理功能方面具有抗高血压、抗糖尿病、抗肥胖、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂等显著特点。
菊糖是果聚糖中的一种，由若干个果糖基分子和末端的一分子葡萄糖连接而成，且果糖基分子间通过β-(2,1)糖苷键连接。菊糖在植物中存在比较广泛，但是植物来源的菊糖总体分子量范围较低，且聚和度范围广。通过微生物来源的菊糖蔗糖酶利用蔗糖合成的菊糖普遍具有较大的分子量。因此，通过微生物酶法生产菊糖是必要且有效的途径。不同微生物来源的菊糖蔗糖酶，呈现出明显的产物特异性，主要表现为产物菊糖的分子量方面。
目前，已经报道的菊糖蔗糖酶的来源菌株仅有15个，且仅有10个来源的菊糖蔗糖酶的氨基酸序列可通过NCBI查询到。且大多数菊糖蔗糖酶存在活力低下等问题，因此为进一步提高菊糖的产量，可以对菊糖蔗糖酶进行分子改造。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶进行分子改造，为进一步提高其催化活性以及得到更适合于工业应用的菊糖蔗糖酶(Laga-Iase)。
本发明的第一个目的是提供一种菊糖蔗糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。
在一种实施方式中，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述的基因工程菌以pET-22b(+)为表达载体。
本发明的第五个目的是提供一种制备菊糖的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，以蔗糖为底物制备菊糖。
在一种实施方式中，所述制备是以醋酸缓冲液作为缓冲体系。
本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、食品领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明首先对微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604来源的菊糖蔗糖酶进行截断处理，在5’端和3’端分别截断411和702个核苷酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的中间序列，然后在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到突变体酶D288E，突变体酶D288E的总酶活为326U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(248U/mg)相比提高了31.45％。
附图说明
图1：酶的纯化；M表示蛋白marker；1为纯化后的菊糖蔗糖酶；左侧数字为蛋白分子量，单位(kDa)。
图2：相同条件下野生酶和突变体酶的比酶活比较。
具体实施方式
菊糖蔗糖酶比酶活的测定方法：1mL的反应体系，包括终浓度30％(w/v)的蔗糖、终浓度50mM的pH 5.5的醋酸缓冲液和10μg/mL纯酶，在25℃条件下反应20min，沸水浴10min终止反应。
菊糖蔗糖酶利用蔗糖合成菊糖涉及两步反应，第一步先将蔗糖裂解为葡萄糖和酶-果糖基中间物，第二步将果糖基转移到另一分子蔗糖上，化学反应式为：蔗糖+蔗糖-(2,1-β-D-果糖基)n→葡萄糖+蔗糖-(2,1-β-D-果糖基)n+1。因此，以蔗糖为唯一底物时菊糖蔗糖酶的活力包括总酶活、水解酶活和转糖基酶活三类，分别用反应体系中葡萄糖、果糖和两者之差表示。水解酶活代表蔗糖的水解，而转糖基酶活代表果聚糖的产生。
1U菊糖蔗糖酶总酶活定义为：在pH 5.5，25℃条件下反应，每分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。1U总水解酶活定义为在pH 5.5，25℃条件下反应，每分钟生成1μmol果糖所需要的酶量。转糖基酶活为总酶活与水解酶活之差。比酶活为总酶活与反应体系中加酶量之比，单位U/mg。
实施例1菊糖蔗糖酶突变体的制备
(1)来源于微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶(Laga-Isase)基因在GeneBank的编号为GU166814.1，基因全长2707个核苷酸。为了在表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)获得大量表达的目的蛋白，将全基因进行截断处理。在5’端和3’端分别截断411和702个核苷酸，仅保留中间序列，该中间序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(2)pET-22b(+)-D288E突变质粒的构建
以人工合成的pET-22b(+)-Laga-ISase为模板(其中Laga-ISase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，经PCR-l，PCR-2及PCR-3三个步骤，引入D288E定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b(+)-D288E构建成功。突变体酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
PCR-1反应体系如下：
以带有菊糖蔗糖酶目的基因的克隆质粒pET-22b(+)-Laga-ISase为模版。
| 10×PCR Buffer | 5μL |
| dNTP(2mmol/L) | 4μL |
| 上游外侧引物(10μM) | 1μL |
| 反向突变引物(10μM) | 1μL |
| pET-22b(+)–Laga-ISase | 1μL |
| Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 将体系补足50μL |
PCR-2反应体系如下：
| 10×PCR Buffer | 5μL |
| dNTP(2mmol/L) | 4μL |
| 下游外侧引物(10μM) | 1μL |
| 正向突变引物(10μM) | 1μL |
| pET-22b(+)–Laga-ISase | 1μL |
| Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 将体系补足50μL |
PCR-1、PCR-2的扩增条件为：
94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火l min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。
PCR-1、PCR-2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化。
PCR-3反应体系如下：
PCR-3扩增条件为：
94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火l min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR-3扩增产物经限制性内切酶Nde I和Xho I酶切后连接至载体pET-22b(+)，得到重组质粒pET-22b(+)-D288E。
表1引物序列表
实施例2工程菌株的构建
将实施例1中得到的重组质粒pET-22b(+)-Laga-Isase和pET-22b(+)-D288E分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基培养，后提取质粒pET-22b(+)-Laga-Isase和pET-22b(+)-D288E，并将其转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌E.coli BL21/pET-22b(+)-Laga-Isase和E.coli BL21/pET-22b(+)-D288E。
实施例3菊糖蔗糖酶及其突变体酶的表达
将实施例2中构建得到的重组菌E.coli BL21/pET-22b(+)-Laga-Isase和E.coliBL21/pE T-22b(+)-D288E分别在LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，后转接入LB培养基37℃培养2-3h至OD值为0.6～0.8，加入终浓度为1mM的IPTG诱导6h～8h。
将发酵液于4℃、l0000rpm离心20min，取菌体。加入20mL缓冲液(50mM PBS，200mMNaCl，调节pH至6.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间ls，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，得到分别含有菊糖蔗糖酶及其突变体酶的粗酶液。
实施例4菊糖蔗糖酶及其突变体酶的纯化
准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用低盐浓度的缓冲液(500mmol/L NaCl，50mM PBS调节pH至6.5)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用含有低浓度咪唑的缓冲液(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM PBS调节pH至6.5)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，50mM PBS调节pH至6.5)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，分别获得纯化后的菊糖蔗糖酶及其突变体酶。纯化后的菊糖蔗糖酶及其突变体酶D288E达到电泳纯。
实施例5菊糖蔗糖酶及其突变体酶的比酶活测定
分别测定突变前后酶的比酶活，结果表明：突变体酶D288E的总酶活为326U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(248U/mg)相比提高了31.45％，突变体酶D288E的转糖基酶活为227U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(165U/mg)相比提高了37.58％，突变体酶D288E的水解酶活为99U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(83U/mg)相比提高了19.28％。
表2比酶活的测定
实施例6利用突变体酶D288E和野生酶制备菊糖
分别取实施例3中制备得到的菊糖蔗糖酶及其突变体酶粗酶液，按照4.5U/g蔗糖的加酶量，加入300mg/mL蔗糖溶液中，蔗糖用pH 5.5的醋酸缓冲液配置，25℃下反应1h。通过高效液相色谱法测定反应体系中蔗糖、葡萄糖和果糖的量，以计算产物菊糖的生成情况。
结果表明：野生菊糖蔗糖酶产物菊糖的生成量为53g/L，底物转化率为17.7％。突变体D288E产物菊糖的生成量为55g/L，底物转化率为18.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
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Phe Leu Leu Gln Ile Asn Pro Asp Asn Thr Thr Thr Val Leu Ala Lys
500 505 510
Met Thr Asn Gln Gly Asp Trp Ile Trp Asp Asp Ser Ser Glu Asn Ala
515 520 525
Asp Met Met Gly Val Leu Glu Lys Asp Ala Pro Asn Ser Ala Ala Leu
530 535 540
Pro Gly Glu Trp Gly Lys Pro Val Asp Trp Asp Leu Ile Gly Gly Tyr
545 550 555 560
Asn Leu Lys Pro His Gln
565
<210> 4
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atggcggtaa aacaagatga aaaagcagct actgcagtta aagcaaatac tgaagtaaaa 60
gctaacgaaa cttctacaaa atcagcttca aaagataaca aagctgaatt aaagggccaa 120
attaaagata ttgttaaaga atctggtgtg gataccagta aattaactga tgatcaaatt 180
aatgaattaa ataagattag cttttctaaa gaagcaaaga gcggtactca attaacttac 240
agcgatttta agaaaattgc taaaacttta attgaacaag atgctcgtta tgctgttcct 300
ttctttaatg caagtaaaat taagaacatg ccagcagcaa aaactcttga tgctcaaaca 360
ggaaaagtag aagacttaga aatttgggat tcatggccag ttcaagatgc caaaactggt 420
tatgtttcta actggaatgg ttatcaatta gtaattggaa tgatgggagt tccaaatact 480
aatgacaatc acatttatct tctttacaac aagtacggtg acaataactt taataattgg 540
aagaatgctg gtcctatttt tggcttaggt actccagtta ttcaacaatg gtctggttca 600
gcaactttaa ataaagatgg ttcaatccaa ctttactaca ctaaggttga tacaagtgat 660
aacaacacta accatcaaaa gattgcaagc gcaactgttt acttaaatct tgaaaagaat 720
caagataaga tttctattgc acacgtagat aatgatcaca tcgtttttga aggtgatgga 780
tatcattacc aaacttacaa tcaatggaag aagaccaaca agggtgcaga taatattgca 840
atgcgtgatg cacacgtaat tgaagataag gatggtaatc gttatcttgt ttttgaggca 900
agtactggaa cagaaaatta tcaaggtgct gaccaaattt atcaatggtt aaattatggt 960
ggtactaaca aagataattt gggtgatttc ctacaaatct tgtctaactc tgatattaaa 1020
gatagagcaa agtggtctaa cgctgcaatc ggtattatta agttaaacaa tgatactaag 1080
aatcctggtg ttgagaaggt ttacacacca cttattagtg ctccaatggt aagtgatgaa 1140
attgaacgtc ctgatgtagt tcgtttaggc aataaatatt acttatttgc cgctactaga 1200
ttaaaccgtg gaagcaacga tgatgcatgg atggctgcta ataaagcagt tggtgataac 1260
gttgctatga ttggttacgt ttctgataac ttaactcatg gatatgttcc attaaacgaa 1320
tctggagtgg ttttaactgc ttctgttcca gcaaactggc gtactgcaac ttactcatac 1380
tatgcagtac cagtagaagg aagagatgat cagttattga ttacttccta tatcactaac 1440
cgtggtgaag ttgctggaaa gggtatgcac gcaacttggg caccaagttt cttgttacaa 1500
attaatccag ataatactac tactgtttta gctaagatga ctaaccaagg tgactggatt 1560
tgggatgatt ctagcgaaaa cgctgatatg atgggtgtac ttgaaaagga tgctccaaat 1620
agcgctgctc ttcctggtga atggggtaaa ccagttgact gggatttaat tggtggatat 1680
aacttaaagc cacatcaata a 1701
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ttatccatat ggaggatgca aacatgcat 29
<210> 6
<211> 29
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tatatctcga gccgataaca cacttcatt 29
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cgtaattgaa gataaggatg gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
accatcctta tcttcaatta cg 22
Claims (9)
1.一种菊糖蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为：在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以pET-22b(+)为表达载体。
7.一种制备菊糖的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或含有所述突变体或基因的全细胞为催化剂，以蔗糖为底物制备菊糖。
8.根据权利要求7所述的制备菊糖的方法，其特征在于，所述制备是以醋酸缓冲液作为缓冲体系。
9.权利要求1所述的突变体或权利要求4所述的基因工程菌在医药生产、食品领域的应用。
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