CN116334159A - 一种提高麦芽四糖产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高麦芽四糖产量的方法，属于基因工程和生物技术。本发明提供的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS‑ΔCBM酶活为310U/mL，比酶活为1802U/mg，相较于野生型(230U/mL，1200U/mg)分别提高了34.8％和50.2％。本发明通过将来源于Pseudomonassaccharophila的直链麦芽低聚糖生成进行突变得到产物中麦芽四糖占比提高的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS‑ΔCBM，其催化得到的产物中麦芽四糖占比达到了73.1％，具有良好的工艺适应性，在生物领域具有广阔的应用前景。

Description

一种提高麦芽四糖产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高麦芽四糖产量的方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
直链麦芽低聚糖定义为由3-10个葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接而成的聚合物，有广阔的应用前。首先其具有优异的食品加工性能：当将麦芽低聚糖添加进入烘焙食品或膨化食品中时，由于其良好的保水性能，可作为水分调节剂；当加入到饮料中时，由于其较高的黏度可作为增稠剂。其次麦芽低聚糖也具有良好的生理功效：人体摄入麦芽低聚糖后，经体内的酶水解后可被迅速用于合成糖原，因此其不易造成血糖升高；其进入血液后并不会引起渗透压的升高，从而可作为运动饮料添加物提高运动员的耐力；酵母菌等细菌难以利用，可一定程度上减缓其生长速率从而有效预防龋齿。
在直链麦芽低聚糖中，麦芽四糖可以降低血管平滑肌细胞与单核细胞的粘附，有效抑制动脉粥样硬化的发生，在医药领域具有潜在的应用价值。此外，其还可以抑制欧文氏菌的生长以及具有显著的皮肤保湿性能和抗炎特性。
目前，直链麦芽低聚糖的制备方法包括酸制备法、酸酶制备法以及酶催化法。其中，酶催化法因此水解效率高、水解过程较为环保以及对生产设备损害较小，从而应用较为广泛。但目前工业上使用麦芽低聚糖生成酶催化底物生成的麦芽低聚糖通常是多种低聚糖混合物，其中麦芽四糖占比较低。而产物中的麦芽四糖占比较低会造成后续分离困难，生产成本过高，工业化生产困难。
目前对于提高麦芽低聚糖生成酶应用前景的研究大多集中于提高其热稳定性，对于提高其产物特意性的研究较少。因此有必要研究提高直链麦芽四糖生成酶产物特异性的突变体，以更好地满足工业化需求
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明通过将来源于Pseudomonassaccharophila的直链麦芽低聚糖生成进行突变得到产物中麦芽四糖占比提高的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM，其催化得到的产物中麦芽四糖占比达到了73.1％。
本发明提供了一种麦芽四糖的制备方法，所述方法为：采用氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM为催化剂，或采用表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的重组枯草芽孢杆菌为催化剂，或采用表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的重组枯草芽孢杆菌发酵制备的重组酶为催化剂，以麦芽糊精和/或淀粉为底物，反应制备得到麦芽四糖。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM是将来源于Pseudomonas saccharophila的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS截短(截去CBM序列)后得到的。
在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilisWB600为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43nmk质粒为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉包括但不限于玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉和小麦淀粉。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的添加量至少为：10U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为：反应温度为50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酶的制备方法为：将重组枯草芽孢杆菌接种于含有卡纳抗性的LB培养基中活化后，取活化液接种于含有卡纳抗性的TB发酵培养基中发酵培养，将发酵液离心取上清液得到重组酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以MFAPS-ΔCBM为催化剂，以麦芽糊精为底物，所述底物麦芽糊精的DE值为：7-9；所述底物麦芽糊精的添加量至少为：10U/g。
本发明还提供了上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM或采用表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的重组枯草芽孢杆菌在提高麦芽四糖产量中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilisWB600为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43nmk质粒为表达载体。在本发明的一种实施方式中，编码所述直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM或采用表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的重组枯草芽孢杆菌在制备提高麦芽四糖产量的产品中的应用。
有益效果
(1)以20％的麦芽糊精(DE 7-9)为底物，加酶量为20U/g，采用本发明的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM反应后，产物中麦芽四糖占比为73.1％，较野生型直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS(64.6％)提高了11.6％，结合底物转化率，该突变体产物中麦芽四糖含量为161.9g/L，相较于野生型(146.6g/L)提高了10.4％。
(2)本发明提供的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM酶活为310U/mL，比酶活为1802U/mg，相较于野生型(230U/mL，1200U/mg)分别提高了34.8％和50.2％。
(3)本发明提供的生产直链麦芽低聚糖的方法：将底物调浆后降温至50℃后加入直链麦芽低聚糖生成酶即可，无需加入普鲁兰酶、钙离子、异淀粉酶等其他添加物。工艺简单便捷，生产成本更低，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1：纯化直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的SDS-PAGE分析。其中，M：蛋白标准分子量；1：MFAPS；2：MFAPS-ΔCBM。
图2：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的最适温度。
图3：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的热稳定性
图4：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的最适pH。
图5：不同信号肽的优化结果。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：1％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)氯化钠，pH7.0。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加1.5(w/v)琼脂。
TB液体培养基：1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4，pH 6.0。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
直链麦芽低聚糖生成酶酶活测定方法：酶的水解活性通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法还原糖含量的变化来表征。以去离子水为底物配制1％(w/v)完全糊化的可溶性淀粉溶液，将100μL酶液稀释200倍加入900μL底物中，50℃反应后加入1mL 15分钟。加入1mLDNS溶液终止反应，在沸水浴中加热5min显色，立即置于冰水浴中，冷却至室温，然后在540nm处测定吸光度值。与葡萄糖标准曲线相比，每分钟产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量为1单位粗酶活(U)。
比酶活性表示每毫克酶蛋白的酶活性。比酶活性(U/mg)＝酶活性(U/mL)/纯酶浓度(mg/mL)。
聚合度的检测方法：取反应后上清液稀释后过0.22μm水系滤膜，采高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)测定直链麦芽低聚糖生成酶处理后产物的聚合度分布情况。流动相由250mM(w/v)氢氧化钠和1M(w/v)乙酸钠组成，流速为0.5mL/min，柱温保持在35℃。底物转化率和各单糖组分在G1-G7中占比计算方式如下：
单糖占比＝(单糖质量/G1-G7质量)×100％。
底物转化率＝(G1-G7/底物干基质量)×100％。
下述实施例中所涉及的pP43nmk载体购自丰晖生物。
下述实施例中所涉及的引物由金唯智生物科技有限公司合成，同源重组参照Vazyme公司Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒说明书进行。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌分泌表达系统的选择
具体步骤如下：
1、含有不同信号肽的重组载体pP43nmk-MFAPS的构建
(1)重组载体pP43nmk-SPSTP01-MFAPS的构建
连接有信号肽SPSTP01的MFAPS以张梓芊硕士毕业论文“来源于Pseudomonassaccharophila的麦芽四糖生成酶的分泌表达及其结构与性质研究”中构建的mfaps/pST为模板，利用引物F1和R1进行PCR复制片段1；
利用引物F2和R2进行PCR复制出pP43nmk载体片段2，随后通过同源重组将两个片段进行连接，连接后的片段送至金唯智生物科技有限公司测序，制备得到含有信号肽SPSTP01的重组载体pP43nmk-SPSTP01-MFAPS。
(2)分别采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.12所示的SPApre、SPGgt、SPAmye、SPNpre、SPYojL、SPNprB、SPBgls、SPepr信号肽替代信号肽SPSTP01，该信号肽SPSTP01序列如SEQID NO.13所示。信号肽的连接：通过下述表1所述引物分别利用PCR复制出信号肽片段以及不含信号肽的pP43nmk-MFAPS片段，随后利用同源重组将片段进行连接，从而分别制备得到含有不同信号肽的重组载体pP43nmk-MFAPS。
所述及的引物序列如表1所示。
表1：引物序列
Figure BDA0003809115560000051
2、不同的重组菌的构建
分别将步骤1制备得到的重组载体转化至Bacillus subtilis WB600中，得到含有不同信号肽的重组基因工程菌。
3、酶的表达
分别将步骤2制备得到的重组基因工程菌在加有卡纳抗性的LB培养基上划线，37℃条件下培养12h后，挑单菌落接种于50mL的LB培养基中，并添加卡纳抗性，37℃培养8h后，取2mL菌液添加于50mL TB培养基中并添加卡纳抗性，最后置于37℃摇床200rpm发酵60-72h，制备得到发酵液；分别检测发酵液中直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS的酶活，结果如图5所示。
结果显示，含有将SPSTB01信号肽替换为SPBgls的重组载体pP43NMK-SPBgls-MFAps的重组基因工程菌，所表达的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS的酶活最高，其酶活是未替换信号肽(即采用SPSTB01信号肽)重组基因工程菌表达的酶活的1.27倍。
因此，采用将SPSTB01信号肽替换为SPBgls的重组载体pP43NMK-SPBgls作为表达载体，Bacillus subtilis WB600作为表达宿主做后续研究；同时，按照上述方法，制备得到Bacillus subtilis WB600/pP43NMK-SPBgls-MFAPS。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌分泌表达系统的构建
具体步骤如下：
利用实施例1中构建的pP43NMK-SPBgls-MFAPS为模板，利用PCR扩增去除CBM的基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，随后将载体与目的基因片段进行同源重组。
所涉及的引物序列如表2所示：
表2：引物
Figure BDA0003809115560000061
其中所涉及的PCR扩增程序为：Taq Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Taq DNA Polymerase(1.25U/μL)1μL，加入无菌水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min；再进行30个循环(98℃10s，60℃15s，68℃2min)；最后68℃保温10min。
将PCR扩增出的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM酶基因利用同源重组与pP43nmk-SPBgls载体进行连接，构建完之后转化至大肠杆菌E.coli JM109中，涂布具有氨苄青霉素的LB平板，挑取转化子进行测序、菌落PCR验证，提取得到含有直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM酶基因的重组质粒：pP43nmk-SPBgls-MFAPS-ΔCBM。
将重组质粒pP43nmk-SPBgls-MFAPS-ΔCBM转化至Bacillus subtilis WB600中，得到重组基因工程菌：Bacillus subtilis WB600/pP43nmk-SPBgls-MFAPS-ΔCBM。
实施例3：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的表达和纯化
具体步骤如下：
(1)直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的表达
分别将实施例1、实施例2制备得到的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600/pP43nmk-SPBgls-MFAPS-ΔCBM、Bacillus subtilis WB600/pP43NMK-SPBgls-MFAPS在加有卡纳抗性的LB培养基上划线，37℃条件下培养12h后，挑单菌落接种于50mL的LB培养基中，并添加卡纳抗性，37℃培养8h后，取2mL菌液添加于50mL TB培养基中并添加卡纳抗性，最后置于37℃摇床200rpm发酵60-72h，制备得到发酵液；分别检测发酵液中原始酶直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS、直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的酶活，结果如表1所示。
(2)直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的纯化
制备缓冲液A1(10mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH 7.5)和缓冲液B1(10mmol/LTris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.5)并用5mL镍柱(GEHealthcare)纯化。流速设置为2mL/min，平衡具有5-6柱体积缓冲液A1的镍柱。上样后，用缓冲液A1将镍柱上未结合的蛋白洗脱至洗脱曲线平衡。流速设置为1.5mL/min，40％(v/v)缓冲液A1和60％(v/v)缓冲液B1用于洗脱，收集洗脱液测定酶活性并通过SDS-PAGE蛋白电泳验证(如图1所示)。
纯化后的酶蛋白透析袋透析，缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，每6h更换一次缓冲液，重复4次。
分别得到原始酶直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS纯酶、直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM纯酶。
分别使用Detergent Compatible Bradford Protein Assay Kit(BetotimeBiotechnol,Shanghai,China)试剂盒测量透析后原始酶直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS纯酶、直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM纯酶酶蛋白的蛋白质浓度。结果如表3所示。
表3：截短型MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的酶活以及比酶活
Figure BDA0003809115560000071
结果显示：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM酶活为310U/mL，比酶活为1802U/mg，相较于野生型(230U/mL，1200U/mg)分别提高了34.8％和50.2％。
实施例4：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的最适温度及热稳定性
分别检测实施例2制备得到的经纯化后的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM酶及MFAPS纯酶最适温度及热稳定性，具体步骤如下：
(1)最适温度的检测
直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM、MFAPS纯酶的最适温度测定方法如下：按照酶活测定方法，分别测定酶液在30℃～80℃下的酶活力，以酶活最高者为100％，结果如图2所示。
结果显示，该酶在50℃-55℃时酶活较高，最适温度为50℃，当温度进一步升高大于55℃时，酶的活力发生急剧下。
(2)热稳定性的检测
直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的热稳定性、MFAPS纯酶测定方法如下：将酶液分别置于不同温度(50℃～90℃)下保温，每隔一定时间将酶液取出，迅速冷却后，测定酶的残余酶活力，以未保温酶液的活力为100％。
结果显示，该酶在50℃保温时酶活力稳定，50℃孵育28min后，其活性下降到50％以下(图3所示)。
(3)最适pH的检测
直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM、MFAPS纯酶的最适pH测定方法如下：首先以10mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4的缓冲液为溶剂配置pH值5-8的底物，随后再以10mmol/LGly-NaOH缓冲液为溶剂配置pH值8-10的底物。随后按照酶活的测定方法，分别测定酶液在pH 5-10下的酶活，以酶活最高者为100％，结果图4所示。
结果显示，突变体和野生型在pH 6.0～7.5(10mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)范围内表现出较高的酶活性，最适pH为6.5。
当pH低于6.0或高于7.5时酶活性显着降低。此外，在相同的pH下，酶在Gly-NaOH缓冲液中的水解活性略大于在NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中的水解活性。
实施例5：直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM的应用
本实施例中采用直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM酶水解麦芽糊精；具体步骤如下：
(1)配制浓度为20％(w/w)的DE 7-9麦芽糊精溶液100g。
(2)将浓度为20％(w/w)的DE 7-9的麦芽糊精溶液置于90℃水浴摇床中预糊化0.5h，使底物溶解完全，接着将体系温度降至50℃，随后分别向上述反应体系中添加20U/g的直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS-ΔCBM，在50℃水浴摇床中反应24h，随后转移至沸水中灭酶20min，以终止反应。
(3)待灭酶处理后，将反应液在12000rpm条件下离心10min，取上清液过0.22μm的水系膜去除杂质后稀释10000倍，即可用离子色谱分析反应液中不同聚合度的分布情况。
同时以实施例2制备得到的原始酶直链麦芽低聚糖生成酶MFAPS作为对照，分别以玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、麦芽糊精(DE 4)、麦芽糊精(DE 7-9)、麦芽糊精(DE 16)为底物进行酶反应，结果如表4所示。
表4：不同底物下截短型MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的G4占比和转化率
Figure BDA0003809115560000091
结果显示，以麦芽糊精(DE 7-9)为底物，截短型MFAPS-ΔCBM酶解产物的底物转化率以及G4占比均显著高于野生型，当以玉米淀粉和蜡质玉米淀粉为底物时，截短型MFAPS-ΔCBM的底物转化率较野生型显著降低。
随后以DE 7-9麦芽糊精为底物，分点取样，结果如表5所示
表5：底物为麦芽糊精(DE 7-9)时截短型MFAPS-ΔCBM和野生型MFAPS的G4占比和转化率
Figure BDA0003809115560000092
结果显示，突变体G4占比和转化率在早期迅速增加，随后增速放缓，反应结束时截短型MFAPS-ΔCBM的G4占比和转化率较野生型分别提高了9.4％和11.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种麦芽四糖的制备方法，其特征在于，所述方法为：采用氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶为催化剂，或采用表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶的重组枯草芽孢杆菌为催化剂，或采用表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶的重组枯草芽孢杆菌发酵制备的重组酶为催化剂，以麦芽糊精和/或淀粉为底物，反应制备得到麦芽四糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述直链麦芽低聚糖生成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillussubtilis WB600为表达宿主。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43nmk质粒为表达载体。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉包括但不限于玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉和小麦淀粉。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体pP43nmk质粒上还含有SPBgls信号肽。
7.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶或采用表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶的重组枯草芽孢杆菌在提高麦芽四糖产量中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillussubtilis WB600为表达宿主。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43nmk质粒为表达载体。
10.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶或采用表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的直链麦芽低聚糖生成酶的重组枯草芽孢杆菌在制备提高麦芽四糖产量的产品中的应用。
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