CN109988778A - 一种蔗糖磷酸化酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶基因及其应用，基因核酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过构建重组质粒并将该质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，用乳糖诱导表达重组酶，采用Ni‑NTA亲和层析进行分离纯化。该蔗糖磷酸化酶具有更好的热稳定性。粗酶在55℃，pH 7.0条件下的比酶活为2.56 U/mg，纯化后的酶在55℃，pH 7.0条件下的比酶活为6.42 U/mg。该蔗糖磷酸化酶能以粗提物或全细胞催化剂的形式，由蔗糖和抗坏血酸钠制备2‑O‑α‑D‑吡喃葡萄糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)。利用该酶生成AA‑2G，产率可达33.6％（39.94±0.17 g/L）。具有较好的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶基因及其应用。
背景技术
蔗糖磷酸化酶（EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase），能够催化转移葡萄糖苷键，是催化糖苷合成的一类重要的酶。该酶属于胞内酶，1942年由Kagan等从肠膜明串珠菌中首次发现。之后，一些蔗糖磷酸化酶基因相继被表征，包括来源于肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、变形链球菌（Stococcus mutans）、嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）等微生物中的蔗糖磷酸化酶。由于野生型菌株中的代谢调控机制非常复杂，蔗糖磷酸化酶的含量较低，难以应用于生产。所以，通常采用基因工程的手段，构建工程菌株产酶来获取大量的蔗糖磷酸化酶。
蔗糖磷酸化酶的低热稳定性限制了其工业化应用，在60℃进行可避免微生物污染，因此如何提高该酶的热稳定性是当前的研究热点之一。热稳定的酶在工业应用中具有许多优点，例如，反应效率随温度的提升而提高，以致反应过程以及其下游的分离纯化过程的经济效益更好。可以通过突变的手段，提高蔗糖磷酸化酶的热稳定性。具有8个突变的变形链球菌来源的蔗糖磷酸化酶在57℃和60℃温育20 min后分别保持其初始活性的95％和67％，而野生型酶则彻底失活[1]。嗜热菌历来是热稳定酶的主要来源，Verhaeghe等[2]为了得到热稳定性较强的酶，从嗜热菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum中鉴定出蔗糖磷酸化酶，该酶在60℃下的半衰期达到60 h。
Cerdobbel等[3]通过多点共价固定化来自青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶，将最适反应温度从58℃提高到了65℃。将60℃下的半衰期从24 h提高到了62 h。T50从（酶温育1 h后失去50%酶活的温度）64℃提高到了67℃。Winter等[4]对青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶进行交联，先添加甘油以诱导酶保持高亲和力状态，随后用戊二醛交联，酶对甘油作为受体底物的比活力增加了两倍，同时在60℃下的稳定性也得到改善。张奥[5]采用戊二醛交联蔗糖磷酸化酶，得到交联酶聚集体，其最适反应温度较游离酶提高了5℃，为50℃。采用壳聚糖微球作为载体，分别用戊二醛和三羟甲基磷作为交联剂固定化酶，经戊二醛固定化的酶的最适反应温度较游离酶提高了15℃，三羟甲基磷固定化的酶的最适反应温度较游离酶提高了20℃，为65℃。
环境pH易影响蔗糖磷酸化酶的活性和稳定性。该酶是偏酸性酶，万月佳[6]等得到的重组蔗糖磷酸化酶的最适pH为6.7，在pH 6.0-6.7的条件下比较稳定。叶慧等[7]通过大肠杆菌表达的重组蔗糖磷酸化酶，最适pH为6.7，在pH 6.5-7.0范围内相对稳定，保持80%以上的酶活。于丽的野生型蔗糖磷酸化酶最适pH为4.5，而突变体F156A和Y196A的最适pH为6.0。
AA-2G是AA 的糖类衍生物，由于在2位上有葡萄糖掩蔽，不会发生AA的氧化反应，因此AA-2G不仅稳定性强，而且能够保持AA的生物活性。AA-2G安全性高、生产方式简单，是AA的最佳替代品，目前被广泛应用于食品、化妆品、医疗保健等行业。CGTase是目前最常用于合成AA-2G的酶，该酶能够以的α-环糊精为底物合成AA-2G。但与蔗糖、可溶性淀粉等来源广泛的底物相比，α-环糊精的价格相对较高。有研究者利用可溶性淀粉和麦芽糊精等较为廉价的底物，通过CGTase合成AA-2G，但产量较低，普遍在2－3 g/L左右。并且，用CGTase催化首先得到的是AA系列衍生物，还需要经酶解等后处理过程才能获得AA-2G。2007年，Kwon首次发现蔗糖磷酸化酶能够以成本较低的蔗糖为糖基供体，特异性催化AA合成AA-2G。但相关研究较少。
热稳定性是目前该类酶应用推广中有待解决的关键问题。本专利旨在发掘具有优异热稳定性的蔗糖磷酸化酶资源，通过基因异源表达获取大量的重组酶，并对该酶的性质和其催化AA-2G合成的反应影响因素进行研究，为建立基于蔗糖合酶的AA-2G生产工艺奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶基因及其应用，该基因编码的蔗糖磷酸化酶热稳定性高，能够特异性催化AA合成AA-2G。
目前，未发现该蔗糖磷酸化酶基因的相关研究报道，其编码的蔗糖磷酸化酶与现有文献报道的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列相似性在40%~66%左右。
来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的蔗糖磷酸化酶基因编码的蔗糖磷酸化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
一种表达载体，它包含所述的蔗糖磷酸化酶基因。
一种含有蔗糖磷酸化酶基因的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因与表达载体pRSFDuet-1连接所构建的重组载体。
一种重组菌，其是通过所述的表达载体转化宿主细胞获得的。
一种含有上述重组表达载体的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
来自Thermobacillus sp. ZCTH02-B1的蔗糖磷酸化酶序列A0A1Y3Q6Q6和来自Thermoanaerobacterium sp.的蔗糖磷酸化酶序列A0A1X2FWC2，与已知的P10249、Q59495和D9TT09位于同一簇。 A0A1Y3Q6Q6和A0A1X2FWC2在氨基酸水平上具有65.85％的同一性，与来自热厌氧杆菌的D9TT09具有62.42％和91.6％的同一性，与来自肠膜明串珠菌的Q59495具有41.87％和40.77％的同一性，与来自变形链球菌的P10249具有41.72％和41.10％的同一性。
对Thermobacillus sp. ZCTH02-B1来源的蔗糖磷酸化酶基因序列进行密码子优化和合成，将其亚克隆到表达载体pRSFDuet-1的BamHI和XhoI限制性内切核酸酶位点之间，在N-末端添加6-his标签，得到重组质粒pRSF-TSPase。将该质粒转化到E. coli BL21(DE3)中，得到重组菌株E. coli BL21(pRSF-TSPase)。乳糖诱导表达蔗糖磷酸化酶，对重组酶采用Ni-NTA亲和层析进行纯化。
本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，对其进行结构功能分析，选取关键位点进行突变研究，并获取结合底物能力提高，催化效率更佳的突变酶。
一种来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶在催化蔗糖和抗坏血酸钠生成AA-2G中的应用。所述蔗糖磷酸化酶以酶液或表达酶的细胞的形式存在。
在本发明的一种实施方式中，以100-1200 mM蔗糖和抗坏血酸钠为底物，与2-20U/mL酶进行转化反应，在pH 6.0-8.0和45-75℃，200 rpm温育反应6-24小时，转化生成AA-2G。
在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖和抗坏血酸钠的摩尔比为2～4：1。
有益效果：本发明基于生物信息学的分析方法和分子生物学技术所获得的核酸序列是一种热稳定性好、pH适用范围广的蔗糖磷酸化酶基因，将SEQ ID NO.1所示基因与表达载体连接构建重组质粒，重组质粒转化到宿主细胞内生产蔗糖磷酸化酶，该酶的最适温度为65℃，在55℃和65℃温育20 min后分别保持其初始活性的101.79%和98.72％，该酶在60℃下的半衰期为98 h，T60 50（酶温育1 h后失去50%酶活的温度）为69℃，T15 50（酶温育15 min后失去50%酶活的温度）为71℃。酶的热稳定性远高于通过其他复杂繁琐手段得到的蔗糖磷酸化酶。该酶在pH 6.0-8.0的范围内催化效率较高，最适反应pH为7.0。相比与偏酸性的反应pH，中性的反应pH更有利于保持酶的活性和稳定性。能催化蔗糖和抗坏血酸钠生成AA-2G。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蔗糖磷酸化酶应用于AA-2G的合成，取得很好的效果。利用该重组蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和抗坏血酸钠生成AA-2G，产量可达45g/L。
附图说明
图1为蔗糖磷酸化酶基因诱导表达及纯化后的SDS-PAGE电泳图，M，Marker； 泳道1和2，分别为对照菌E. coli BL21（DE3）的上清和沉淀； 泳道3和4分别是重组菌E. coli BL21（pRSF-TSPase）的上清和沉淀； 泳道5，纯化的蔗糖磷酸化酶。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
蔗糖磷酸化酶酶活测定：在3 mL反应体系中（148 mM蔗糖，50 mM磷酸钠缓冲，pH7.0）加入2 mg粗酶液启动反应，反应在55℃，200 rpm条件下进行，30 min后反应液经95℃水浴加热10 min后，12000 rpm室温离心5 min取上清液，后采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）检测样品中生成的还原糖（果糖）的量。
蔗糖磷酸化酶的酶活定义为：在上述条件下，每分钟生成 1μmol果糖所需的酶量称为1个酶活力单位（U）。蔗糖磷酸化酶比活的定义为：1 mg纯酶所具有的活力单位数，单位为U/mg。
AA-2G的高效液相色谱 (HPLC)检测：色谱柱为Diamonsil C18柱 ，5 μm（φ250×4.6 mm）。紫外检测波长为 238 nm。流动相为 1 %的甲醇，用磷酸调pH至 2.0，流速 0.8 mL/min，时间为20min，进样量10 μL，柱温为 25 ℃。HPLC 图谱中 AA-2G 的峰面积和浓度成正比，以此绘制 AA-2G 标准曲线。利用标准曲线及样品中的 AA-2G 的峰面积，得出样品中AA-2G 的浓度。
实施例1：重组菌株E. coli BL21(pRSF-TSPase)的构建
来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，由南京金斯瑞科技有限公司（GenScript）合成该基因并克隆到大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1的BamHI和XhoI限制性内切核酸酶位点之间，使其N-末端添加6-his标签，得到质粒pRSF-TSPase。将重组质粒pRSF-TSPase转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌株E. coli BL21(pRSF-TSPase)。实施例2：蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的诱导表达
挑取实施例1构建的重组菌及对照菌E. coli BL21(DE3)单菌落接入含5 mL LB培养基（添加50 mg/L卡那霉素）的摇管中，置于37℃、200 rpm摇床，培养8 h左右，作为种子液。将种子液以2%接种量接入含100 mL TB培养基（添加50 mg/L卡那霉素）的摇瓶中，先37℃、200rpm摇床培养约2 h，至OD600达0.6左右，转入25℃、200 rpm摇床，诱导培养约22 h，4℃、7000rpm、离心3 min，去除培养液，获得菌体。并用50 mM pH7.0的磷酸钠缓重悬冲洗菌体两次，4℃、7000 rpm、离心3 min收集菌体，4℃保存备用。用50 mM pH7.0的磷酸钠缓冲重悬菌泥，漩涡震荡仪混匀后置于冰水中，利用超声破碎仪进行细胞破碎，工作1 s，停2 s，超声时间为20 min。破碎后的菌液使用冷冻高速离心机，4℃、8000 rpm离心30 min，上清即为粗酶液，放置于4℃冰箱待用。
使用Brandford法测定粗酶液的蛋白质浓度。结果显示，对照菌的比酶活为0，而粗酶液的比酶活为3 U/mg。
使用12.5％（w/v）SDS-PAGE测定蔗糖磷酸化酶的分子量和蛋白质纯度。SDS-PAGE分析如图1所示，粗酶液上清和沉淀均在56 KDa附近有特异性蛋白条带出现，与该酶的计算分子量55.8 KDa一致。对照菌相应位置并没有明显表达条带。
实施例3：蔗糖磷酸化酶的分离纯化
使用金属亲和层析进行重组蔗糖磷酸化酶的纯化。首先，将5 ml Ni -NTA柱安装至蛋白纯化仪，用缓冲液A（50 mM磷酸钠缓冲，300 mM NaCl，10%（v/v）甘油， pH7.2 ）以0.5-1ml/min的流速冲洗管路。将含有TSPase的粗酶液上样，带有His标签的蛋白能与Ni柱中的硫酸镍结合，将蛋白截留。上样完成后利用缓冲液B（50 mM磷酸钠缓冲，300 mM NaCl，10%（v/v）甘油，250 mM咪唑，pH7.2）以1 ml/min的流速进行梯度洗脱，缓冲液B中的咪唑也可以与Ni柱中的硫酸镍结合，从而与带有His标签的蛋白形成竞争关系。收集穿透峰和目标峰。洗脱结束后分别用纯水和20%乙醇清洗Ni柱。洗脱液用超滤离心管4℃、6000 rpm离心10 min，脱盐除咪唑，得到纯酶液。超滤离心管的截留分子量为30 KDa，。
使用Brandford法测定粗酶液的蛋白质浓度。结果显示，纯化后的蔗糖磷酸化酶的比酶活为7 U/mg。
使用12.5％（w/v）SDS-PAGE测定纯化后蔗糖磷酸化酶的分子量和蛋白质纯度。SDS-PAGE分析显示，纯化后蔗糖磷酸化酶在56 KDa附近有特异性蛋白条带出现，与该酶的计算分子量55.8 KDa一致。纯化后的酶在65℃，pH 7.0条件下的比酶活为7 U/mg，75℃，pH7.0条件下的比酶活为5.6 U/mg。
实施例4：温度对蔗糖磷酸化酶的影响
将2 mg纯化的重组TSPase加至3 mL反应体系中（148 mM蔗糖，50 mM磷酸钠缓冲，pH7.0），在不同的温度（30℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃）200 rpm条件下反应30 min，反应液经95℃水浴加热10 min，12000 rpm室温离心5 min，取上清液，利用DNS法测定果糖浓度，每个反应做三组平行样。取酶活最高的一组作为相对酶活100%，用Origin作温度与酶残留相对活力的关系曲线。
将稀释至一定浓度（1 mg/mL）的纯化的重组TSPase在不同的温度（45℃、55℃、65℃、75℃、85℃）下温育一段时间（0、10、20、30、60）后，将反应所需纯酶液加至3 mL反应体系中（148 mM蔗糖，50 mM磷酸钠缓冲，pH 7.0），55℃、200 rpm条件下反应30 min，反应液经95℃水浴加热10 min，12000 rpm室温离心5 min，取上清液，利用DNS法测定果糖浓度，每个反应做三组平行样。取酶活最高的一组作为相对酶活100%，用Origin作温度与酶残留相对活力的关系曲线。
将TSPase纯酶用缓冲稀释至1 mg/mL，放入60℃温育102 h，隔一段时间取样，迅速用冷水进行冷却，在55℃、148 mM蔗糖、50 mM磷酸钠缓冲（pH 7.0）反应体系中，反应30min，95℃水浴10 min，12000 rpm室温离心5 min，利用DNS法测定果糖浓度，每个反应做三组平行样。取酶活最高的一组作为相对酶活100%，用Origin作残余酶活对时间的关系曲线。得蔗糖磷酸化酶的半衰期。
TSPase的T15 50指在其他条件不变的情况下，15 min使酶丧失50%活性的温度。将TSPase纯酶用缓冲稀释至1 mg/mL，分别在不同的温度（65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75℃）下温育15 min取样，迅速用冷水进行冷却，在55℃、148 mM蔗糖、50 mM磷酸钠缓冲（pH7.0）反应体系中，反应30 min，反应液经95℃水浴加热10 min，12000 rpm室温离心5 min，取上清液，利用DNS法测定果糖浓度，每个反应做三组平行样。取未温育15 min的一组作为相对酶活100%，用Origin作残余酶活对温度的关系曲线。求出温育15 min使酶活丧失50%的温度。TSPase的T60 50指在其他条件不变的情况下，60 min使酶丧失50%活性的温度。具体方法同上。
该酶的最适温度为65℃，在55℃和65℃温育20 min后分别保持其初始活性的101.79%和98.72％，在45℃-65℃温度范围内保温1 h后，TSPase仍保留了其原始活性的80％以上，该酶在60℃下的半衰期为98 h，T60 50（酶温育1 h后失去50%酶活的温度）为69℃，T15 50（酶温育15 min后失去50%酶活的温度）为71℃，该酶耐高温性能优越。最适pH为7.0，在pH 6.0-8.0范围内的催化效率较高。
实施例5：蔗糖磷酸化酶催化合成AA-2G
催化反应采用蔗糖磷酸化酶粗酶液进行。10 mL反应体系中包含1200 mM蔗糖，600 mM抗坏血酸钠，13 mM硫脲，pH 7.0的20 mMMOPS缓冲，加入8 mg/mL粗酶液，在65 ℃、200 rpm避光条件下反应24 h，取样，置于-20 ℃终止反应。产物用HPLC进行检测。AA-2G产量可达40g/L。
实施例6：蔗糖磷酸化酶催化合成AA-2G
催化反应采用蔗糖磷酸化酶粗酶液进行。10 mL反应体系中包含1200 mM蔗糖，600 mM抗坏血酸钠，13 mM硫脲，pH 7.0的20 mMMOPS缓冲，加入8 mg/mL粗酶液，在50℃、200 rpm避光条件下反应24 h，取样，置于-20 ℃终止反应。产物用HPLC进行检测。AA-2G产量可达45g/L。
本研究在不同温度37、45、50及65 ℃条件下，催化合成AA-2G。50℃反应时AA-2G的合成量最高，可见，50 ℃为最佳温度。高于50℃时，随着时间的增加，AA-2G的产量不再积累。
实施例7：蔗糖磷酸化酶催化合成AA-2G
催化反应采用蔗糖磷酸化酶粗酶液进行。10 mL反应体系中包含1200 mM蔗糖，600 mM抗坏血酸钠，13 mM硫脲，pH 8.0的20 mMMOPS缓冲，加入8 mg/mL粗酶液，在50℃、200 rpm避光条件下反应24 h，取样，置于-20 ℃终止反应。产物用HPLC进行检测。AA-2G产量可达35g/L。
AA-2G在pH 7.0条件下的产量高于pH 8.0的产量。
实施例8：蔗糖磷酸化酶催化合成AA-2G
催化反应采用蔗糖磷酸化酶粗酶液进行。10 mL反应体系中包含13 mM硫脲，pH 8.0的20 mMMOPS缓冲，加入8 mg/mL粗酶液，分别采用1：2、1：3、1：4的抗坏血酸钠与蔗糖的浓度比，其中抗坏血酸钠的浓度为600 mM，在50℃、200 rpm避光条件下反应24 h，取样，置于-20℃终止反应。产物用HPLC进行检测。AA-2G产量分别为45 、38、39 g/L。表明比例为1：2时，AA-2G的量最高。
实施例9：全细胞催化合成AA-2G
采用反复冷冻和解冻后的全细胞进行催化反应，总体积为10 mL。反应体系包含1200mM蔗糖，600 mM 抗坏血酸钠，13 mM硫脲，pH 7.0的20 mM MOPS缓冲，加入15 mg/mL工程菌在50 ℃、200 rpm避光条件下分别取反应进行12、24和30 h时的样，置于-20 ℃终止反应。产物用HPLC进行检测。24 h的AA-2G产量可达33 g/L。
实施例10：全细胞催化合成AA-2G
采用反复冷冻和解冻后的全细胞进行催化反应，总体积为10 mL。反应体系包含1200mM蔗糖，600 mM 抗坏血酸钠，13 mM硫脲，pH 7.0的20 mM MOPS缓冲，加入15 mg/mL工程菌在65 ℃、200 rpm避光条件下分别取反应进行12、24和30 h时的样，置于-20 ℃终止反应。产物用HPLC进行检测。24 h的AA-2G产量可达38 g/L。
在不同温度50及65 ℃条件下AA-2G的合成情况，65℃时反应AA-2G的合成量最高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 南京工业大学
湖南木本禾生态农业科技有限公司
<120> 一种蔗糖磷酸化酶基因及其应用
<141> 2019-05-14
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaaactgga aaaccgtgtt 60
cagctgatta cctatccgga tagcctgggc ggtaatctgg cagcactgcg tgaagtgctg 120
cgtcgtcatt ttccgggcct gttcctgggc ggtattcaca ttctgccgcc gtttccgagc 180
agcggtgacc gtggtttcgc gccgctggat tatggcatga ttgacccggc gtttggtacc 240
tgggaagata tcgcgcagct gggcgaagaa tacggtgtta tgctggacgt tatggtgaac 300
catatcagcc gtcgtagccc gcagtttatg gatttcctga aacaaggccg tagcagcccg 360
tatgcggaca tgtttctgac cctggataaa atttggccgg acggtcgtcc ggtgcaagcg 420
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<211> 501
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Asp Pro Lys Leu
1 5 10 15
Glu Asn Arg Val Gln Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu Gly Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Arg Glu Val Leu Arg Arg His Phe Pro Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Gly Gly Ile His Ile Leu Pro Pro Phe Pro Ser Ser Gly Asp Arg
50 55 60
Gly Phe Ala Pro Leu Asp Tyr Gly Met Ile Asp Pro Ala Phe Gly Thr
65 70 75 80
Trp Glu Asp Ile Ala Gln Leu Gly Glu Glu Tyr Gly Val Met Leu Asp
85 90 95
Val Met Val Asn His Ile Ser Arg Arg Ser Pro Gln Phe Met Asp Phe
100 105 110
Leu Lys Gln Gly Arg Ser Ser Pro Tyr Ala Asp Met Phe Leu Thr Leu
115 120 125
Asp Lys Ile Trp Pro Asp Gly Arg Pro Val Gln Ala Asp Ile Asp Lys
130 135 140
Met Phe Leu Arg Arg Lys Leu Pro Tyr Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp
145 150 155 160
Gly Arg Glu Glu Leu Val Trp Thr Thr Phe Gly Lys Thr Asp Pro Ser
165 170 175
Glu Gln Ile Asp Leu Asp Val Arg Ser Pro Leu Ala Arg His Tyr Leu
180 185 190
Ser Gly Ile Phe Gln Arg Phe Lys Ala Asn Arg Val Asn Met Val Arg
195 200 205
Leu Asp Ala Val Gly Tyr Val Ile Lys Lys Pro Gly Thr Ser Cys Phe
210 215 220
Phe Val Glu Pro Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Asp Trp Val Ala Asp Gln
225 230 235 240
Ala Lys Glu His Asp Ile Ala Leu Leu Pro Glu Val His Ala His Tyr
245 250 255
Ser Ile Gln Tyr Lys Leu Ala Glu Arg Gly Phe Trp Ile Tyr Asp Phe
260 265 270
Ile Leu Pro Phe Met Val Leu Asp Ala Leu Val Asn Arg Ser Ser Ala
275 280 285
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290 295 300
Leu Asp Cys His Asp Gly Ile Pro Val Lys Pro Asp Leu Asp Asp Leu
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325 330 335
Gly Ala Asn Leu Ser Tyr Val Ile Ser Asp Arg His Lys Ser Pro Asp
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Phe Gln Gly Ser Phe Arg Val Cys Glu Ser Glu Asp Ser Lys Ile Arg
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Leu Glu Trp Glu Lys Asp Ala Ile Arg Cys Ala Leu His Val Asp Leu
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Asp Thr Tyr Arg Ser Ile Ile Thr Cys Thr Asp Gly Gln Gly Lys Glu
485 490 495
Ala Gln Trp Val Val
500
Claims (9)
1.一种来源于Thermobacillus的蔗糖磷酸化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种表达载体，它包含权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基因。
3.权利要求2所述表达载体为pRSFDuet-1。
4.一种重组菌，其是通过利用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞获得的。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
6.权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基因在催化蔗糖和抗坏血酸钠生成AA-2G中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将蔗糖磷酸化酶基因通过构建重组质粒并在宿主细胞中表达，获得热稳定性好、pH适用范围广的蔗糖磷酸化酶，催化蔗糖和抗坏血酸钠生成AA-2G。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以100-1200 mM蔗糖和抗坏血酸钠为底物，与2-20 U/mL酶进行转化反应，在pH 6.0-8.0，温度45-75℃，温育反应6-24小时，转化生成AA-2G。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，反应pH7.0，温度50℃。
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