CN107574176A

CN107574176A - 一种改进的白藜芦醇生物生产方法

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Publication number: CN107574176A
Application number: CN201610524659.6A
Authority: CN
Inventors: 赵广荣; 赵莹
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2016-07-05
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明公开了一种改进的白藜芦醇生物生产方法，其中的改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，步骤：(1)全合成基因synTAL、syn4CL、synSTS；(2)制备SyBE‑002447(DE3)菌株；(3)全合成基因synaccBC‑dtsR1；(4)克隆外排蛋白基因yddG；(5)全化学合成SyBE‑217101和pSyBE‑217102；(6)将synTAL、syn4CL、synSTS与pSyBE‑217101连接，得到重组表达载体pSyBE‑synTLS；将synaccBC‑dtsR1、yddG与pSyBE‑217102连接，得到重组表达载体pSyBE‑synADY；(7)将两个重组表达载体转化到SyBE‑002447(DE3)菌株中，单克隆筛选，获得重组菌SyBEREST。本发明过表达外排蛋白促进白藜芦醇分泌，显著提升了白藜芦醇的产量，降低成本。

Description

一种改进的白藜芦醇生物生产方法

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及一种改进的产白藜芦醇的重组菌及其构建方法。

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol，Res)，分子式为为C₁₄H₁₂O₃，分子量为228，易溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂。白藜芦醇主要有四种天然存在形式：反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷和顺式白藜芦醇苷。作为一种多酚类天然植物抗毒素，白藜芦醇广泛存在于葡萄、花生、虎杖等70余种植物中，随着1990年“法国悖论”的提出而获得广泛关注。研究表明其具有舒张心血管、抗癌、抗氧化、抗炎、延长动物寿命等生理活性，因而可用于保健品、食品、药品和化妆品。目前白藜芦醇的获得主要有以下三种方式：

(1)植物提取法：作为一种天然产物，植物提取法是目前生产白藜芦醇的主要方法，其中欧美国家主要从葡萄皮和葡萄籽中提取，而我国主要从虎杖中提取。传统的提取方法为粉碎—提取—对提取物进行提纯浓缩。但面临使用有机溶剂较多、耗时长、效率低等问题。因此随着化工行业的发展，新兴的提取工艺如CO2超临界流体萃取法、超声波提取法、微波提取法等也被开发和研究，从而实现了白藜芦醇高品质高效率地生产，但生产成本仍然很高。

(2)化学合成法：以3,5-二(三甲基硅氧基)苯甲酸甲酯为起点，经Witting反应可获得白藜芦醇。目前国内主要以3,5-二羟基苯甲醇或3,5-二羟基苯甲醛为原料经5-8步合成白藜芦醇。

(3)植物细胞培养法：。利用植物细胞如愈伤组织可在短时间和较小的空间内高效率的合成白藜芦醇，利用乙酸钠刺激的花生的多毛根组织可合成98μg/mg白藜芦醇。

虽然上述方法已取得一定进展，但植物提取法受植物生长状况和时间空间等的限制；另一方面由于植物的大量需求和多种溶媒的大量使用，植物提取法对环境造成一定程度的危害，不符合可持续发展的理念。而化学合成法所需步骤多、产率较低且某些所需的高温高压条件不易实现等缺陷限制了其工业化生产。同时，生产过程中所用的化学试剂会对环境、生产工人甚至所生产的产品造成较严重危害，其并不是生产白藜芦醇的最理想方法。植物细胞培养法也具有细胞培养系统遗传不稳定以及诱导后和重复接种后的次级代谢物损失等缺点。近年来，随着合成生物学和代谢工程的不断发展，利用微生物成产化学品逐渐成为备受关注的方法，且如何进一步提升产量成为亟需解决的问题。

目前将T7RNA聚合酶嵌入到高产酪氨酸工程菌中，并将促进白藜芦醇外排和增强丙二酰辅酶A供给两方面结合起来以提升白藜芦醇产量的方式没有任何文献报道过。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种改进的产白藜芦醇的重组菌。

本发明的第二个目的是提供一种改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种改进的白藜芦醇生物生产方法。

本发明的技术方案概述如下：

改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)全合成酪氨酸脱氨酶基因synTAL、4-香豆酰辅酶A连接酶基因syn4CL、芪合酶基因synSTS，synTAL的核苷酸序列如SEQ ID No.06所示；syn4CL的核苷酸序列如SEQ IDNo.07所示；synSTS的核苷酸序列如SEQ ID No.08所示；

(2)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE-002447底盘菌株染色体上得到SyBE-002447(DE3)菌株；

(3)全合成乙酰辅酶A羧化酶基因synaccBC-dtsR1，synaccBC-dtsR1的核苷酸序列如SEQ ID No.09所示；

(4)以大肠杆菌基因组为模板，克隆外排蛋白基因yddG，yddG的核苷酸序列如SEQID No.10所示；

(5)全化学合成以SEQ ID No.11所示的表达载体骨架SyBE-217101、以SEQ IDNo.12所示的表达载体骨架pSyBE-217102；

(6)将所述基因synTAL、syn4CL、synSTS与表达载体骨架pSyBE-217101通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pSyBE-synTLS；将所述基因synaccBC-dtsR1、yddG与表达载体骨架pSyBE-217102通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pSyBE-synADY；

(7)将重组表达载体pSyBE-synTLS和pSyBE-synADY转化到SyBE-002447(DE3)菌株中，对单克隆筛选，获得含有重组表达载体pSyBE-synTLS和pSyBE-synADY的改进的产白藜芦醇的重组菌SyBEREST。

上述方法构建的改进的产白藜芦醇的重组菌SyBEREST。

一种改进的白藜芦醇生物生产方法，是用上述重组菌SyBEREST发酵制备白藜芦醇。

本发明的优点：

本发明过表达外排蛋白促进白藜芦醇分泌，增强重要前体丙二酰辅酶A以进一步提升白藜芦醇产量。本发明显著提升了白藜芦醇的产量，同时降低了生产成本，有利于工业上进一步扩大生产。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

本发明改进的白藜芦醇合成途径属于植物苯丙烷代谢途径：以甘油或葡萄糖为碳源，为生长提供必需的能量来源及乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。甘油或葡萄糖经代谢合成酪氨酸，再经酪氨酸脱氨酶(TAL)催化合成对香豆酸，继而经4-香豆酰辅酶连接酶(4CL)催化生成对香豆酰辅酶A，再经芪合酶(STS)将1分子对香豆酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A缩合成1分子白藜芦醇。在此过程中，本发明通过过表达转运蛋白促进白藜芦醇外排，引入外源乙酰辅酶A羧化酶增强重要前体丙二酰辅酶A供给，逐步提升白藜芦醇产量。

本发明所使用原始高产酪氨酸底盘菌株，名称为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SyBE-002447，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明所使用大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)和E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

本发明所使用pKD46质粒,pCP20质粒和pKD3质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。

实施例1：酪氨酸脱氨酶TAL，4-香豆酰辅酶A连接酶4CL，芪合酶STS，乙酰辅酶A羧化酶亚基accBC，dtsR1基因设计设计

优选黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)来源的酪氨酸脱氨酶TAL；

拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4-香豆酰辅酶连接酶4CL；

葡萄(Vitis vinifera)来源的芪合酶STS；

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的乙酰辅酶A羧化酶亚基AccBC，DtsR1，上述几种酶的氨基酸序列依次分别如序列表中SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5所示。

使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长synTAL、syn4CL、synSTS、synaccBC-dtsR1基因，上述基因的核苷酸序列依次分别如序列表中SEQ ID No.06、SEQ ID No.07、SEQ ID No.08、SEQ ID No.09所示。并全合成。

实施例2：底盘菌株SyBE-002447(DE3)构建

依据大肠杆菌BL21(DE3)基因组，设计T7RNA聚合酶嵌入片段，设计引物如下：

克隆ybhB基因上游500bp同源臂引物如下：

F-ybhB：AGAAAGGAGGGTTCATGAAA(SEQ ID No.13)

R-ybhB：GAGCGAAACGGGAAGGTAAA(SEQ ID No.14)

克隆T7RNA聚合酶引物如下：

F-T7RNA：TTTACCTTCCCGTTTCGCTCGTATCAAGGTATTTTATGCG(SEQ ID No.15)

R-T7RNA：GAAGCAGCTCCAGCCTACTCACTCATTAGGCACCCC(SEQ ID No.16)

克隆氯霉素片段引物如下：

F-Chl：GTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID No.17)

R-Chl：CTGCTTTTTTATACTAACTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID No.18)

克隆ybhC基因下游500bp同源臂引物如下：

F-ybhC：AAGTTAGTATAAAAAAGCAG(SEQ ID No.19)

R-ybhC：ATCAAGGGAAAGCCCAATCT(SEQ ID No.20)

第一步以BL21(DE3)基因组为模板，以F-T7RNA和R-T7RNA为引物进行PCR反应，扩增得到T7RNApol片段。

以pKD3质粒为模板，以F-Chl和R-Chl为引物进行PCR反应，扩增得到氯霉素片段。

以大肠杆菌SyBE-002447基因组为模板，分别以F-ybhB，R-ybhB和F-ybhC，R-ybhC为引物进行PCR反应，扩增得到ybhB基因上游500bp同源臂片段和ybhC基因下游500bp同源臂片段。由于所设计引物退火温度相似，因此PCR反应程序相同：97℃，7min，1个循环；95℃，30s，57℃，30s，72℃，1min，共30个循环；72℃，5min，1个循环；4℃保存。将得到的PCR产物利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。

第二步以T7RNApol和氯霉素片段为模板，以F-T7RNA和R-Chl为引物进行重叠延伸PCR反应，获得T7RNA-Chl片段，将得到的T7RNA-Chl片段利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。

第三步以ybhB基因上游500bp同源臂和T7RNA-Chl片段为模板，以F-ybhB和R-Chl为引物进行重叠延伸PCR反应获得ybhB-T7RNA-Chl片段，将得到的ybhB-T7RNA-Chl片段利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。

第四步以ybhB-T7RNA-Chl片段和ybhC基因下游500bp同源臂为模板，以F-ybhB和R-ybhC为引物进行重叠延伸PCR反应获得完整的敲除片段ybhB-T7RNA-Chl-ybhC，将得到的ybhB-T7RNA-Chl-ybhC片段利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。

挑取含有pKD46质粒的大肠杆菌SyBE-002447于5mlLB培养基中，30℃过夜培养。取100ul过夜培养物转接于含有50mL LB培养基的250mL摇瓶中，同时添加终浓度为50ug/mL的氨苄青霉素，30℃，220rpm培养。当菌体培养至OD600在0.1-0.2之间时，加入终浓度为100mM的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续培养至OD600约为0.6收获，制备电击转化感受态细胞。

取5ul制备的敲除片段(ybhB-T7RNA-Chl-ybhC)，电击转化SyBE-002447感受态细胞，2.5KV，5-6ms，37摄氏度复苏。复苏完成后涂布氯霉素抗性的LB的平板，过夜培养。第二天用F-ybhB和R-ybhC为引物进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆。

将阳性克隆接于5mL LB培养基中过夜培养，将其划线至氯霉素抗性平板上。取单克隆分别划线于氯霉素抗性平板和氨苄抗性平板。挑取在氯霉素抗性平板上生长，但不在氨苄抗性平板上生长的单菌落于5mL LB培养基中。

将pCP20质粒电转入上述菌株，涂布于氨苄抗生素和氯霉素双抗的平板上，挑取单菌落于5mL LB培养基中30℃过夜培养。将50uL过夜培养菌液转接至5mL无抗素LB培养基中43℃培养12h，继而划线于无抗平板上，43℃培养12h。以F-ybhB和R-ybhC为引物进行菌落PCR验证，将阳性克隆接种5mL无抗LB培养基中，43℃培养12h，继而划线至无抗平板上，43℃培养12h，挑取单菌落分别划线于氯霉素和无抗的平板，30℃12h后挑取在氯霉素抗性平板上不长，但是在无抗平板上生长的单菌落为最终构建成功的底盘菌株SyBE-002447(DE3)。

实施例3：pSyBE-synTLS表达载体的构建

以人工全合成的synTAL基因为模板(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)，利用PCR方法，设计引物如下，获得两端带有BamHI和HindIII的人工全合成synTAL基因片段，PCR程序参照实施例2。

synTALup：CGCG ATGCCGTCCCGCATCGACTA(SEQ ID No.21)

synTAL down:CCCTTACGCCTTGATAGACTTAA(SEQ ID No.22)

其中双划线为BamHI和HindIII酶切位点。

全化学合成表达载体骨架pSyBE-217101，其序列如序列表SEQ ID No.11所示。用BamHI和HindIII将所纯化回收的synTAL基因PCR产物和提取的pSyBE-217101载体进行双酶切，酶切反应体系为：(1)5μL 10*FD buffer，2.5μLBamHI、2.5μLHindIII、30μL synTAL基因片段、10μL超纯水，(2)5μL 10*FD buffer，2.5μLBamHI、2.5μLHindIII、30μL pSyBE-217101载体、10μL超纯水。反应条件为：37℃，1h。将synTAL基因和pSyBE-217101的酶切产物分别利用PCR回收试剂盒进行纯化回收。并进行连接，连接体系为：1μL 10*T4DNA LigaseBuffer，1μL T4DNA Ligase，6μL酶切后的synTAL基因片段和2μL酶切后的pSyBE-217101载体片段。反应条件为：22℃，0.5h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，37℃复苏完成后涂布于卡纳链霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，后用synTALup和synTALdown进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并将验证得到的阳性克隆进行测序验证，得到pSyBE-synTAL载体。

以人工全合成的syn4CL基因为模板(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)，利用PCR方法，设计引物如下，获得两端带有NdeI和BglII的人工全合成syn4CL基因片段，PCR程序参照实施例2。

syn4CLup：GGAATTCGCGCCACAAGAACAAGC(SEQ ID No.23)

syn4CLdown：GGATTACAGACCGTTTGCCAGTT(SEQ ID No.24)

其中双划线为NdeI和BglII酶切位点。

用NdeI和BglII将所纯化回收的syn4CL基因PCR产物和提取的pSyBE-synTAL载体进行双酶切，后进行连接，(具体酶切连接反应体系和反应条件参见实施例3)。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，37℃复苏完成后涂布于卡纳链霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，后用syn4CLup和syn4CLdown进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并将验证得到的阳性克隆进行测序验证，得到pSyBE-synTL载体。

以人工全合成synSTS基因为模板(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)，利用PCR方法，设计引物如下，获得两端带有BglII和KpnI的人工全合成synSTS基因片段，PCR程序参照实施例2。

synSTSup：GGA AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCC CTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTTCCGTAGAGGAATT(SEQ ID No.25)

synSTSdown：CGGTTAATTTGTAACCGTAGGGATC(SEQ ID No.26)

其中双划线为BglII和KpnI酶切位点。

用BglII和KpnI将所纯化回收的synSTS基因PCR产物和提取的pSyBE-synTL载体进行双酶切，后进行连接，(具体酶切连接反应体系和反应条件参见实施例3)。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，37℃复苏完成后涂布于卡纳链霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，后用synSTSup和synSTSdown进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并将验证得到的阳性克隆进行测序验证，得到pSyBE-synTLS表达载体。

实施例4：pSyBE-synADY表达载体的构建

以人工全合成的synaccBC-dtsR1基因为模板(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)，利用PCR方法，设计引物如下，获得两端带有BamHI和HindIII的人工全合成synaccBC-dtsR1基因片段，PCR程序参照实施例2。

synaccBCup：CGCATGTCGGTTGAAACCCGTAA(SEQ ID No.27)

syndtsR1down：CCCTTAGAGCGGCATATTGCCGT(SEQ ID No.28)

其中双划线为BamHI和HindIII酶切位点。

用BamHI和HindIII将所纯化回收的synaccBC-dtsR1基因PCR产物和提取的全合成pSyBE-217102载体骨架(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)进行双酶切，后进行连接，(具体酶切连接反应体系和反应条件参见实施例3)。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，37℃复苏完成后涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，后用synaccBCup和syndtsR1down进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并将验证得到的阳性克隆进行测序验证，得到pSyBE-synAD载体。

以大肠杆菌基因组为模板，获得yddG基因(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)。具体方法为：利用PCR方法，设计引物如下，获得两端带有BglII和KpnI的yddG基因片段，PCR程序参照实施例2。

yddGup：GGACATGACACGACAAAAAGCAACG(SEQ ID No.29)

yddGdown：CGGTTTAACCACGACGTGTCGC(SEQ ID No.30)

其中双划线为BglII和KpnI酶切位点。

用BglII和KpnI将所纯化回收的yddG基因PCR产物和提取的pSyBE-synAD载体进行双酶切，后进行连接，(具体酶切连接反应体系和反应条件参见实施例3)。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，37℃复苏完成后涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，后用yddGup和yddGdown进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并将验证得到的阳性克隆进行测序验证，得到pSyBE-synADY载体。

实施例5：重组菌株SyBEREST构建

将大肠杆菌菌株SyBE-002447(DE3)制备成电转感受态，将实施例3和实施例4所构建的表达载体pSyBE-synTLS和pSyBE-synADY电转入其中，获得重组菌株SyBEREST。制备电转感受态的具体步骤如下：

1、将大肠杆菌菌株SyBE-002447(DE3)甘油菌50μL接种于5mL LB培养基中，37℃，220 rpm过夜培养；

2、将活化的大肠杆菌菌株SyBE-002447(DE3)100μL，接种于10ml LB培养基中，37℃，220rpm，培养至OD₆₀₀为0.8-1.0时，转入10mL离心管中，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体；

3、用5mL预冷的灭过菌的10％甘油重悬菌体，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体，重复此步骤三次；

4、尽量倒尽上清，加入100μL 10％甘油重悬菌体，制成SyBE-002447(DE3)感受态细胞；

5、将实施例3和实施例4中构建的pSyBE-synTLS和pSyBE-synADY质粒各取1.25μL，并混匀，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物分别加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。迅速分别加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布氨苄青霉素和卡纳链霉素双抗的LB平板，过夜培养；

6、挑选菌落PCR验证的阳性转化子到5mL LB培养基中过夜培养，得到重组菌株SyBEREST，保存菌株；

实施例6：重组菌株SyBEREST发酵检测

白藜芦醇的重组菌制备白藜芦醇的方法，包括如下步骤：将产白藜芦醇重组菌SyBEREST，37℃，220rpm过夜培养，转接在50mL的LB培养基中稀释至OD＝0.1，继续37℃，220rpm培养，至OD600为1.0-1.2之间，加入0.01mM IPTG，转为30℃，220rpm，继续培养8h。离心收集菌体，去除上清培养基，将菌体重新悬浮于YM9-甘油培养基中，同时添加0.02mMIPTG，48h后检测所得到白藜芦醇。

发酵结束后，取2mL发酵液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，8000r/min离心2分钟，将有机相吸出，进行旋转蒸发，继而用2mL甲醇重悬。样品用0.22μm的微孔有机滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)系统检测。色谱条件如下：C18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为乙腈：0.2％磷酸＝3:7，流速为1mL/min，进样量20μL，柱温室温，紫外检测器，白藜芦醇检测波长为303nm。最终48h后，白藜芦醇产量为546.5±39.2mg/L。

YM9-甘油培养基配方为：KH₂PO₄ 3g/L，Na₂PO₄·12H₂O 17.1g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1g/L，1mol/L MgSO₄ 2mL/L，1mol/L CaCl₂ 0.1ml/L，5g/L酵母提取物，添加4mL/L甘油121℃，0.1Mpa下灭菌20min。

LB培养基配方为：NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L。

实施例7：重组菌株SyBEREST发酵检测

白藜芦醇的重组菌制备白藜芦醇的方法，包括如下步骤：将产白藜芦醇重组菌SyBEREST，37℃，220rpm过夜培养，转接在50mL的LB培养基中稀释至OD＝0.1，继续37℃，220rpm培养，至OD600为1.0-1.2之间，加入0.01mM IPTG，转为30℃，220rpm，继续培养8h。离心收集菌体，去除上清培养基，将菌体重新悬浮于YM9-葡萄糖培养基中，同时添加0.02mMIPTG，48h后检测所得到白藜芦醇。

发酵结束后，取2mL发酵液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，8000r/min离心2分钟，将有机相吸出，进行旋转蒸发，继而用2mL甲醇重悬。样品用0.22μm的微孔有机滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)系统检测。色谱条件如下：C18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为乙腈：0.2％磷酸＝3:7，流速为1mL/min，进样量20μL，柱温室温，紫外检测器，白藜芦醇检测波长为303nm。最终48h后，白藜芦醇产量为298.7±23.9mg/L。

YM9-葡萄糖培养基配方为：KH₂PO₄ 3g/L，Na₂PO₄·12H₂O 17.1g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl1g/L，1mol/L MgSO₄ 2mL/L，1mol/L CaCl₂ 0.1ml/L，5g/L酵母提取物，121℃，0.1Mpa下灭菌20min。添加10g/L葡萄糖(葡萄糖在115℃，0.1Mpa下灭菌15min)。

LB培养基配方为：NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，其特征包括如下步骤：

(1)全合成酪氨酸脱氨酶基因synTAL、4-香豆酰辅酶A连接酶基因syn4CL、芪合酶基因synSTS，synTAL的核苷酸序列如SEQ ID No.06所示；syn4CL的核苷酸序列如SEQ ID No.07所示；synSTS的核苷酸序列如SEQ ID No.08所示；

(4)以大肠杆菌基因组为模板，克隆外排蛋白基因yddG，yddG的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示；

(5)全化学合成以SEQ ID No.11所示的表达载体骨架SyBE-217101、以SEQ ID No.12所示的表达载体骨架pSyBE-217102；

2.权利要求1的方法构建的改进的产白藜芦醇的重组菌SyBEREST。

3.一种改进的白藜芦醇生物生产方法，其特征是用权利要求2的重组菌发酵制备白藜芦醇。