CN102732456B - 耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种耐有机溶剂糖苷酶产生菌及该菌产生的耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其同源体和突变体，以及该耐有机溶剂糖苷酶Fru6在水相或者非水相中糖基化修饰黄酮类物质的应用和合成高品质寡糖的应用。该耐有机溶剂糖苷酶Fru6能耐受一定浓度的多种亲水性有机溶剂。本发明分离克隆到该菌所产耐有机溶剂的耐有机溶剂糖苷酶Fru6编码基因，它具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。该耐有机溶剂糖苷酶Fru6/Fru6突变体具有强的转糖合成作用，故具有在水相或者非水相中糖基化修饰黄酮类化合物及合成寡糖等工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体和应用，具体地，涉及一种耐有机溶剂糖苷酶产生菌及其产生的耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体，以及其在水相或非水相中催化果糖基化反应生成-O-糖苷的应用，具有高效糖基合成能力，能够在水相或非水相高效糖基化修饰黄酮类化合物及合成寡糖能力，属于微生物学与酶学领域。
背景技术
糖苷化合物在食品、制药及饲料等领域有着广泛的用途。寡糖（4-8碳糖，低聚糖）作为生理活性物质，具有调整肠道菌群结构，增强免疫能力等功能；2002年全球低聚糖产量为15万吨，创造了400亿美元功能寡糖食品和100亿美元功能寡糖饲料的市场；另外，糖苷化合物在天然产物-中药有效成分改性，提高其生物利用度等方面起着重要的作用。因此，对天然产物进行酶法糖基化修饰已成为当今新药创制领域的研究热点。
酶法糖基化是糖苷化合物合成的有效手段：由于糖分子存在多个性质相似的羟基，且糖苷键形成过程中还可能产生α-和β-两种异构体，因此化学法糖基化缺乏区域和立体选择性。酶法糖基化具有高度的区域及立体专一性。糖基转移酶（Glycosyltransferase）以核苷磷酸糖基为供体（例如UDP-Glu）转移糖基至受体上，由于活化糖基价格昂贵而限制了该酶在糖苷化合物大规模制造中的应用。糖苷酶（Glycosidase）又称糖基水解酶，是一大类催化糖苷键水解的酶，以廉价的寡糖作为糖基供体合成糖苷化合物。糖苷酶按催化机制主要分为两类：构型翻转酶和构型保持酶。构型翻转酶催化中心的一对羧基（源于谷氨酸或天冬氨酸残基）大约相隔1.05nm，起着广义酸/碱的作用，通过单置换机制导致构型翻转来催化水解反应。构型保持酶的一对羧基大约相隔0.55nm，分别作为广义酸碱和亲核体，通过双置换机制保持糖苷构型不变，后者提供了一条利用糖苷酶合成寡糖及其他糖苷化合物的简便途径，但此法因对糖苷产物的水解能力较强，往往产率较低，难以实现工业化大生产，因此糖苷酶的糖苷产物水解性能成为了糖苷化合物合成产业中的最大的技术瓶颈。为了提高糖基化产量，许多小组展开了相关的研究，其中在有机相中进行糖基化修饰的研究成为热点。大量研究表明在非水介质中进行酶的催化反应有许多优点：①可增加非极性底物的溶解性；②可通过控制反应平衡移动的方向极大地提高产率；③抑制依赖于水的某些不利反应；④转化体系不易染杂菌；⑤可采用双相体系进行转化，便于产物的分离；⑥通过溶剂体系调节有效成分进行定向的转化或修饰。近年来，有关在有机介质中的酶催化反应研究是酶工程中一个活跃的领域。目前，国内外对耐有机溶剂的脂肪酶、蛋白酶及其非水相催化特性研究较多，而对耐有机溶剂糖苷酶的发现和研究则较少。本发明的耐有机溶剂糖苷酶Fru6筛选自耐有机溶剂极端微生物，由于耐有机溶剂极端微生物能在富含有机溶剂的环境中生存，因此由这类微生物分泌到胞外的如糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等也具有一定的有机溶剂耐受性。耐有机溶剂糖苷酶的发现及其在非水相中生物催化的相关研究，为开发高效的酶法糖苷化技术提供指导。
黄酮类化合物广泛存在于自然界，是多种药用植物的有效成分。许多黄酮类化合物现在已经作为治疗心血管疾病的药物，还有一些作为潜在的药物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肝脏毒性和抗抑郁等诸多活性。但是由于其溶解度低，毒副作用等缺点，对黄酮类化合物进行糖基化修饰已经成为获得新的高活性及低毒性衍生物的重要手段。但目前所报道的关于在有机相糖基化修饰黄酮类的糖苷酶转糖基作用、转化率及产量相对较低（低于70%），而本发明筛选的糖苷酶Fru6具有低糖苷产物水解特性，加之该酶的有机溶剂耐受性，极大提高底物溶解性，进而极大提高转化率及产物量。
葛根素与芒果苷均属于黄酮类化合物。葛根素是异黄酮类化合物，化学名为7,4’-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮，呈白色针状结晶，能溶于水，但溶解度小(6.24g/L)，其水溶液为无色或微黄色，分子量为416.37。葛根素具有广泛药理活性，临床上已用于降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量；扩张冠状血管，改善正常和缺血心肌的代谢；对脑循环、周围血管及微循环有影响；除此以外，葛根素还有降血糖降血脂、抗氧化、抗肿瘤等作用（姚丹,丁选胜.中国临床药理学与治疗学,2008,13,468-474.）。芒果苷是一种四羟基吡酮的碳酮苷，属双苯吡酮类黄酮类化合物，在多种植物中存在，如芒果树、扁桃树、东北龙胆及知母等。芒果苷分子式：C19H18011，分子式：422。芒果苷具有多种生物活性和药理作用，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗糖尿、抗炎等（邓家刚,蕈骊兰.长春中医药大学学报,2008,24(4):463-464.）。葛根素与芒果苷虽然具有广泛的药理作用，但两者的溶解度均很差，为方便应用，需要改善葛根素和芒果苷的溶解性和生物利用度。目前的方法主要通过对葛根素进行糖基化结构修饰或采用特殊剂型有效改善葛根素溶解性。葛根素糖苷化后，水溶性得到显著提高，糖苷化修饰后分子结构的变化不影响葛根素的药效，但提供了一种高浓度给药的葛根素糖苷化合物。芒果苷糖苷化后，水溶性得到显著提高，由于芒果苷较差的水溶性，利用生物转化方法进行芒果苷糖基化修饰时，转化前芒果苷浓度普遍较低（均不超过0.5g/L），产物摩尔转化率也较低（均不超过30%），这些局限性给获得足够产物进行肿瘤相关疾病的药理实验及后期的工业化生产都带来了相当的难度。
寡糖又称为低聚糖，是指以2-10个单糖以糖苷键连接起来的糖类的总称。寡糖具有以下生理特性：1、寡糖不被口腔中变异链球菌（S.Mutants）利用，同时也不被龋齿菌凝集，从而大大降低龋齿的发生；2、寡糖难被唾液酶和小肠消化酶水解，难以被消化吸收，热量值低，同时寡糖类似水溶性植物纤维，能改善血脂代谢，降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量；3、寡糖是超强双歧因子，能很好的促进双歧杆菌增值，同时寡糖经双歧杆菌降解产酸，降低肠腔pH值，降解致病物质，直接抑制病菌生长，调节胃肠功能，抑制肠内腐败物质，改变大便性状，防治便秘同时排毒，并增加维生素合成，提高人体免疫功能。4、寡糖属非胰岛素依赖，不会使血糖升高，适合于高血糖人群和糖尿病人食用；除此以外，寡糖还可以促进Ca2+、Mg2+等矿物质吸收、调节蛋白质代谢、保护肝脏等功能。因此寡糖广泛应用于食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂等领域。寡糖是替代蔗糖的新型功能性糖源，是面向二十一世纪“未来型”新一代功效食品，是一种具有广泛适用范围和应用前景的新产品，目前国际上颇为流行。美国、日本、欧洲等地均有规模化生产，我国寡糖的开发和应用起于90年代中期，近几年发展迅猛。近年来，为解决寡糖化学合成中需要多次保护基的操作和中间体分离对糖合成的制约，糖化学工作者发展了诸如一釜合成（one-pot synthesis）、固相合成（solid-phasesynthesis）、标签辅助的合成（tag-assisted synthesis）等一些新的策略和方法，这些策略和方法在一定程度上促进了寡糖化学合成技术的发展，但仍然很复杂，并不能满足高效合成及大规模生产寡糖的需要。酶催化反应相比化学催化最突出的优点是快速、高效、反应条件温和及立体专一性，这些特征决定了酶法合成寡糖是解决寡糖中的异头碳的活化、糖环上多个羟基的区别反应及糖苷键形成时的立体专一性等问题的最有效手段。因此，酶促寡糖合成是现今糖化学中又一热门领域。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种耐有机溶剂糖苷酶产生菌。
本发明的第二个技术目的是提供所述耐有机溶剂糖苷酶产生菌的胞外产物，即耐有机溶剂糖苷酶Fru6，以及耐有机溶剂糖苷酶Fru6的基因。
本发明的第三个技术目的是提供所述耐有机溶剂糖苷酶Fru6的重组表达酶。
本发明的第四个技术目的是提供所述的耐有机溶剂糖苷酶产生菌、耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其重组表达酶在催化果糖基化反应生成-O-糖苷中的应用。
上述技术目的使得本发明所述的耐有机溶剂糖苷酶产生菌及其耐有机溶剂糖苷酶Fru6、耐有机溶剂糖苷酶Fru6重组表达酶能高效糖基化修饰葛根素、芒果苷和合成高品质功能寡糖，能为高效非水相催化提供基础，同时可以在非水相条件下糖基化修饰获得新的高活性及低毒性黄酮类化合物衍生物并可以提高底物转化率及糖基化产物量，为工业化大生产提供菌种来源。
为了实现本发明的目的，本发明的技术目的如下。
本发明首先从化工厂排污口土样中筛选获得一株耐有机溶剂糖苷酶Fru6产生菌，其分类命名为Arthrobacter arilaitensis NJEM01，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012155。
本发明对上述耐有机溶剂菌株Arthrobacter arilaitensis NJEM01发酵培养后，对其胞外产物耐有机溶剂糖苷酶Fru6进行纯化，经过硫铵沉淀、DEAE SepharoseTm FF弱阴离子交换层析、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化达到电泳纯，其比活性达到12U/mg蛋白。
本发明对该耐有机溶剂糖苷酶Fru6进行了酶学性质的研究，实验证明该糖苷酶Fru6最适反应pH为5.0，同时在pH5.0到8.5的缓冲液中都能保持较高的糖苷酶活力，相对酶活高于87%左右。该糖苷酶Fru6最佳反应温度为35℃，糖苷酶Fru6在30-35℃酶活性高于90%，35℃时酶活性最高，当温度低于25℃或高于40℃时，酶活性低于65%。金属离子影响糖苷酶Fru6活性，5mmol/L EDTA能有效抑制糖苷酶Fru6的活力，5mmol/L Ca2+、Ba2+、Ni2+和Mg2+存在时可提高酶的活性，4℃下处理1h后酶活性分别增至初始酶活性的143%、119%、104%及108%。其中，Ca2+对酶活性的提高最为显著（增加143%）。5mmol/L Fe2+对酶活性有很强的抑制作用，抑制率达95%。5mmol/L Mn2+、Co2+、Cu2+和EDTA对酶活性均有一定的抑制作用，抑制率为42%～61%。
实验证明该糖苷酶Fru6对甲醇、乙醇、DMSO等多种亲水性有机溶剂都具有良好的耐受性，耐受浓度达20%（v/v）。
本发明分离克隆到Arthrobacter arilaitensis NJEM01菌株所产耐有机溶剂糖苷酶Fru6的编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂糖苷酶Fru6基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂糖苷酶Fru6基因全长1488个核苷酸，编码495个氨基酸，成熟糖苷酶Fru6为495个氨基酸，与Arthrobacter globiformis IFO 3062的序列相似性86%，蛋白质一级结构同源性为85%。其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。
根据本领域人员的公知常识可知，具有与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有98%以上同源性的氨基酸序列及其突变体，应当视为与本发明保护的耐有机溶剂糖苷酶Fru6等同的同种功能蛋白质。因此，本发明还保护与SEQ ID NO：2表示的耐有机溶剂糖苷酶Fru6的氨基酸序列具有98%同源性的氨基酸序列及其突变体。
本发明将耐有机溶剂糖苷酶Fru6的氨基酸序列中的氨基酸位点突变，从单点突变到最高10个位点的突变组合（99%-97.6%）。并将突变酶在大肠杆菌表达菌BL21中获得表达。突变的糖苷酶Fru6具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列至少98%的同源性。
具体的，本发明通过定点突变了，得到的24种耐有机溶剂糖苷酶Fru6的突变体，其通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的耐有机溶剂糖苷酶Fru6的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的耐有机溶剂糖苷酶Fru6突变体，且所述的氨基酸残基位置选自SEQ ID NO：1中的：(a)第1位；(b)第2位；(c)第3位；(d)第133位；(e)第134位；(f)第135位；(g)第403位；(h)第404位；(i)第405位；(j)第406位。
更进一步地，所述的另一种氨基酸残基是：
(a)第1位：甘氨酸（G）；
(b)第2位：丝氨酸（S）；
(c)第3位：天冬氨酸（D）；
(d)第133位：天冬氨酸（D）；
(e)第134位：谷氨酸（E）；
(f)第135位：丙氨酸（A）；
(g)第403位：缬氨酸（V）或甘氨酸（G）；
(h)第404位：甘氨酸（G）；
(i)第405位：丙氨酸（A）；
(j)第406位：苏氨酸（T）。
本发明将上述突变糖苷酶Fru6进行了酶学性质的研究，发现同原未突变糖苷酶Fru6的酶学性质基本一致。检测突变糖苷酶对葛根素的转化能力，发现突变酶仍具有较强的转糖能力，在延长反应时间或者增加突变酶用量的条件下，依然可以达到同未突变糖苷酶Fru6同等的转化能力。
由于每一个氨基酸残基都是以三位密码子的核苷酸序列编码而得的，因此，本发明相应地，也要求保护所述的耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体的基因。
本发明构建了耐有机溶剂糖苷酶Fru6基因及其突变体的表达载体（如选择载体pET22b），并将表达载体成功导入大肠杆菌表达菌BL21中，加入IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE验证在BL21中成功表达了重组糖苷酶Fru6，经检测，该表达酶的活力达到3.6U/mL。因此，根据本领域技术人员的公知常识可知，所述耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体的基因的重组载体，以及重组载体的转化体，也是本发明的保护主题。
本发明提供了耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体在水相或非水相中糖基化修饰黄酮类化合物的应用。
将Arthrobacter arilaitensis NJEM01发酵液或者纯化的糖苷酶Fru6或者其突变体成功应用到在水相或非水相中糖基化葛根素或芒果苷的反应中，结果表明在水相转化条件下，果糖基化葛根素转化率达95%以上。在非水相转化条件下，果糖基化葛根素衍生物转化率达90%。在非水相转化条件下，果糖基化芒果苷衍生物转化率达92%。
本发明提供了耐有机溶剂糖苷酶Fru6/Fru6突变体在水相合成寡糖的应用。
将发酵液或者纯化的糖苷酶Fru6或者该酶重组表达获得的糖苷酶Fru6/Fru6突变体成功应用到在水相中合成寡糖的反应，结果表明所述水相转化条件下，寡糖转化率达58%。
本发明的有益效果在于所提供的耐有机溶剂糖苷酶Fru6以及该耐有机溶剂糖苷酶Fru6基因及该耐有机溶剂糖苷酶Fru6的重组表达酶/Fru6突变体，该耐有机溶剂糖苷酶Fru6具有的对多种亲水性有机溶剂具有优良的耐受性。该耐有机溶剂糖苷酶Fru6在有机溶剂中糖基化修饰葛根素、芒果苷的成功应用进一步证明该耐有机溶剂糖苷酶Fru6在有机溶剂催化反应所表现的优良性质（克服目前由于葛根素、芒果苷较差的水溶性，葛根素、芒果苷浓度普遍较低（均不超过10g/L），产物摩尔转化率也较低（均不超过70%）。该糖苷酶Fru6将来在有机相糖基化修饰黄酮类化合物以便获得足够产物量，这将大大有利于利用该产物进行心脑血管及肿瘤相关疾病的药理试验及后期的工业化生产。同时该耐有机溶剂糖苷酶Fru6利用蔗糖合成寡糖（主要4-6个聚合为主的寡糖）的应用为目前市场上存在的单一及低品质寡糖的缺陷提供酶来源。
附图说明
图1各级纯化后的耐有机溶剂糖苷酶Fru6的SDS-PAGE电泳分析。
图2耐有机溶剂糖苷酶Fru6的最适pH；
其中，●=C6H8O7-Na3C6H5O7(pH3.0–6.5),□=Na2HPO4-KH2PO4(pH6.5–8.5)，▲=Glycine-NaOH(pH 8.5–10.0)。
图3耐有机溶剂糖苷酶Fru6的pH稳定性。
其中，●=C6H8O7-Na3C6H5O7(pH3.0–6.5),□=Na2HPO4-KH2PO4(pH6.5–8.5)，▲=Glycine-NaOH(pH 8.5–10.0)。
图4耐有机溶剂糖苷酶Fru6的最适反应温度。
图5耐有机溶剂糖苷酶Fru6的热稳定性。
图6金属离子对耐有机溶剂糖苷酶Fru6的影响。
图7耐有机溶剂糖苷酶Fru6的溶剂耐受性。
图8耐有机溶剂糖苷酶Fru6的重组酶的SDS-PAGE电泳图谱。
图9耐有机溶剂糖苷酶Fru6的部分突变酶的SDS-PAGE电泳图谱。
图10耐有机溶剂糖苷酶Fru6水相生物转化葛根素的HPLC图谱。
图11耐有机溶剂糖苷酶Fru6非水相生物转化葛根素的HPLC图谱。
图12耐有机溶剂糖苷酶Fru6非水相生物转化芒果苷的HPLC图谱。
图13耐有机溶剂糖苷酶Fru6水相合成寡糖的HPLC图谱。
本发明所述的产耐有机溶剂糖苷酶的产生菌，其分类命名为Arthrobacter arilaitensisNJEM01，其于2012年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012155。
具体实施方式
一般性说明：
1、引物设计及制备：本发明中所使用的引物均由上海Invitrogen公司合成制备。
2、实验中所使用的pMD18-T载体、大肠杆菌（E.Coli）表达菌BL21、酶切用生物材料等等，均购自于Novagen公司。
实施例一
本实验说明产生耐有机溶剂糖苷酶Fru6的天然菌株的筛选程序。
采用10%-20%DMSO(v/v)有机溶剂为筛选压力从化工厂排污口土样中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。采用的初筛培养基为：玉米浆(1.5-2.5)mL/L、蔗糖（10-20）g/L、NH4Cl或尿素3.0g/L、KH2PO4 3.0g/L、MgSO4 2g/L(调节pH至7.0-7.5)。将筛选到的耐有机溶剂微生物接种于初筛培养基于30℃，180rpm培养两天后转接，按照接种量0.5%-1%(v/v)接种至已灭菌的培养基中；加入10%-20%DMSO(v/v)有机溶剂DMSO，需转接两次。将富集转接2次的培养液梯度稀释至适当倍数，涂布到LB平板上，LB平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L。30℃培养24h，获得耐有机溶剂菌株。选取涂布平板上的单菌落，在LB平板上进行划线分离菌种，相同培养条件下培养一天，将划线后的纯种在平板上富集，培养一天后保存于20%-30%(v/v)甘油中，以放入冰箱保存菌种。将初筛获得的耐有机溶剂菌种接种到LB平板上，30℃培养24h，接种到复筛培养基中30℃160rpm-180rpm培养12h，将发酵液加入到含葛根素底物、蔗糖和有机溶剂DMSO的非水转化体系中，以获得具有转化葛根素能力的耐有机溶剂目标菌株。复筛培养基：蔗糖10g/L-20g/L、蛋白胨5g/L-10g/L、酵母粉1g/L-3g/L，玉米浆1mL/L-2mL/L、KH2PO4 1g/L-2g/L、MgSO4 0.5g/L-1.0g/L、CaCl2 0.2g/L、pH 7.0-7.5。
通过以上筛选方法，筛选出一株具有优良耐受性的糖苷酶Fru6产生菌株，经过BIOLOG自动细菌鉴定仪鉴定和16S rRNA序列分析，表明该菌株属于Arthrobacter arilaitensis菌属，并命名为Arthrobacter arilaitensis NJEM01。对该菌株的革兰氏染色观察表明该菌株为革兰氏阳性菌株，无芽孢，该菌成杆状，适宜温度10℃-35℃，为严格好氧菌。
实施例二
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6的纯化程序。
首先将Arthrobacter arilaitensis NJEM01菌株在平板培养基中培养24h后，转接两次，分别培养24h后，接至种子液，培养12h后，再接至发酵培养基，再次培养12h，10,000rpm在4℃离心15min，取上清作为粗酶液。将粗酶液置于冰浴中，加入固体粉末状硫酸铵至50%，4℃静置过夜后离心（10000rpm×30min，4℃），沉淀用20mmol/L Tris-HCl pH7的缓冲液溶解，接着向溶解液中再次加入固体粉末状硫酸铵至90%，4℃静置过夜后离心（10000rpm×30min，4℃），沉淀依然用Tris-HCl pH7的缓冲液溶解。将透析过的沉淀溶解液进行DEAE SepharoseTm FF弱阴离子交换层析，用20mmol/L的Tris-HCl（pH7.0,NaCl含量为1mol/L）的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，将上述有酶活的收集液透析浓缩，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分析纯化结果，通过SDS-PAGE（图1）分析表明纯化糖苷酶Fru6已经达到电泳纯，图中第一栏为Marker，第二栏为发酵粗酶液，第三栏为DEAE弱阴离子交换后样品。该蛋白酶亚基分子量约为55kDa。经过分离纯化后，最终糖苷酶Fru6比活达到12U/mg蛋白。
酶活检测方法：配制2g/L的葛根素和60g/L的蔗糖溶于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)中作为反应底物，900~950μL底物中加入50~100μL酶液，30℃保温10~30min，取反应液100μL加入到900μL甲醇中，经HPLC检测。酶活力单位定义为：在30℃条件下，每分钟转化1μmol葛根素所需酶的量为一个活力单位（1U即1μmol/min）。比活力定义（U/mg）：单位质量（mg）酶液中具有的酶活力（U）数。
实施例三
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6的酶学性质的测定方法。
耐有机溶剂糖苷酶Fru6最适反应pH值和pH稳定性的测定：
为了考察不同pH对糖苷酶Fru6活力的影响，确定反应的最适pH，分别配制pH3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0的缓冲液，将纯化后的糖苷酶Fru6与不同pH值底物反应液反应，分别检测糖苷酶Fru6活力，酶活力如图2所示。从图2可以看出，该酶在pH低于5.0或高于9.0时，酶活性损失严重，而在pH5.0-6.5酶活性较高（85%以上），其酶活性的最适pH为5.0。为了考察糖苷酶Fru6的pH稳定性范围，将酶液分别与不同pH的缓冲混合（50/50=v/v），于4℃处理1h，分别检测糖苷酶Fru6的活力。酶活力如图3所示，从图3可以看出，该酶在pH5.0-8.5的缓冲液中处理1h后都能保持较高的果糖苷酶活力，相对酶活性高于87%。但该酶在pH低于5.0或高于8.5的缓冲液中，酶活性快速下降。另外，由图3可以看出，相同pH值下缓冲液的种类对酶稳定性的影响也不同，酶在pH8.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液中相对酶活是在Glycine-NaOH缓冲液中的1.5倍。
耐有机溶剂糖苷酶Fru6最适反应温度和热稳定性的测定：
耐有机溶剂糖苷酶Fru6的最适温度的测定是在0.05mol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲体系（pH6.0）下，在不同的温度条件下以葛根素和蔗糖为底物进行酶促反应，酶活力如图4所示。热稳定测定：糖苷酶Fru6在4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下处理1h以后，测定残留酶活，酶活力如图5所示。酶的最适反应温度测量结果表明(图4)，该酶在30-35℃酶活性高于90%，35℃时酶活性最高，当温度低于25℃或高于40℃时，酶活性低于65%。在热稳定性实验中（图5），糖苷酶Fru6在4-35℃保温1h后至少有95%的酶活性被保留，但温度高于35℃后，酶活性快速下降。表明该酶在低温下具有良好的稳定性，超过35℃后，酶快速失活。
金属离子对耐有机溶剂糖苷酶Fru6活力的影响
金属离子对耐有机溶剂糖苷酶Fru6影响的测定是在酶液中分别添加Ca2+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Li+、Ba2+、Mn2+等金属离子（金属离子终浓度为5mmol/L），于4℃下放置1h后检测糖苷酶Fru6活力。以添加5mmol/L EDTA的酶液和原酶液的酶活作为对照，测定加入金属离子后酶的相对活力。金属离子对耐有机溶剂糖苷酶Fru6活力的影响如图6所示。由图6可见，5mmol/L Ca2+、Ba2+、Ni2+和Mg2+存在时可提高酶的活性，4℃下处理1h后酶活性分别增至初始酶活性的143%、119%、104%及108%。其中，Ca2+对酶活性的提高最为显著（增加143%）。5mmol/L Fe2+对酶活性有很强的抑制作用，抑制率达95%。5mmol/L Mn2+、Co2+、Cu2+和EDTA对酶活性均有一定的抑制作用，抑制率为42％-61%。
耐有机溶剂糖苷酶Fru6的溶剂耐受性检测：
考察亲水性有机溶剂对糖苷酶Fru6酶活的影响。考察7种亲水有机溶剂对糖苷酶Fru6稳定性的影响，分别将7种20%的有机溶剂缓缓加入酶液中，间歇振荡混匀，1h后检测糖苷酶活力。以不添加有机溶剂的糖苷酶酶活为对照，测定酶的相对酶活。亲水性有机溶剂对糖苷酶Fru6酶活影响结果如图7所示。图7结果表明酶在20%乙腈、异丙醇、DMF和丙酮中，于35℃处理1h后，酶活损失90%以上，而在20%甲醇、乙醇和DMSO中，酶仍能保持较高的酶活，分别为82.7%、61.0%和80.2%。
实施例四
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6编码基因的分离克隆程序。
采用酚－氯仿法抽提菌体总DNA。因GenBank中没有检索到Arthrobacter arilaitensis菌属糖苷酶基因序列，在GenBank中搜索同属不同菌种的糖苷酶的基因序列，通过Vector NTI软件分析比对确定相对保守的区域，设计相对应的引物，设计的引物为：
F1：GCTAGCGAACTCCCAAAACGT（SEQ ID NO：3）；
R1：GCTACTGCTTTGCCATTCTTCA（SEQ ID NO：4）。
PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec；64℃退火1min，72℃延伸1min20sec；循环30轮后，72℃保温5min，根据该反应条件，以基因组为模板，扩增出的一段长约800bp大小的片段G1，与原设计长度一致。
为获得耐有机溶剂糖苷酶Fru6的完整基因片段，选用Tail-PCR法扩增目的基因片断两侧翼序列，具体方法如下：根据扩增得到的糖苷酶Fru6部分基因的两端序列分别设计3条嵌套的特异性引物FSP1、FSP2、FSP3和RSP1、RSP2、RSP3，同时设计4条随机引物WP1、WP2、WP3、WP4及NWP，设计的引物为：
FSP1：CCTACATGGTTTTCGAGGGCAA（SEQ ID NO：5）；
FSP2：CGAAACCGTGGATGAGGTCAAT（SEQ ID NO：6）；
FSP3：CGATCCTGTCTGCTAACTGCGT（SEQ ID NO：7）；
RSP1：GGTGAAGAACAGCTTGATTTCG（SEQ ID NO：8）；
RSP2：ATTCTTGTTCGAGTGGACGTGG（SEQ ID NO：9）；
RSP3：TCACGGAAGTTGAAGTACGAGT（SEQ ID NO：10）；
WP1：CTAATACGACTCACTATAGGGNNNNATGC（SEQ ID NO：11）；
WP2：CTAATACGACTCACTATAGGGNNNNGATC（SEQ ID NO：12）；
WP3：CTAATACGACTCACTATAGGGNNNNTAGC（SEQ ID NO：13）；
WP4：CTAATACGACTCACTATAGGGNNNNCTAG（SEQ ID NO：14）；
NWP：CTAATACGACTCACTATAGGG（SEQ ID NO：15）。
根据Tail-PCR扩增原理，由特异引物FSP1（RSP1）与非特异简并引物WP1、WP2、WP3和WP4进行第一轮扩增；以第一轮PCR反应液为模板，由特异引物FSP2(RSP2)与非特异简并引物NWP进行第二轮扩增；以第二轮PCR反应液为模板，由特异引物FSP3(RSP3)与非特异简并引物NWP进行第三轮扩增，最终Fru6基因片段3’端及5’端未知序列扩增得到。选取扩增得到的片段做胶回收。用Vector软件将全部扩增的基因片段拼接得到全长1488bp的糖苷酶Fru6基因序列，根据获得序列拼接获得完整序列，重新设计引物，进行糖苷酶Fru6基因的验证，设计的引物如下：
F2：GCTAGCGAACTCCCAAAACGT（SEQ ID NO：16）；
R2：GCTACTGCTTTGCCATTCTTCA（SEQ ID NO：17）。
扩增得到了的PCR片段，经胶回收得到全基因片段，将此片段连接到pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明此片段有一个全长为1488bp的阅读框，编码成熟糖苷酶Fru6的氨基酸495个。
实施例五
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6的表达载体的构建及其在大肠杆菌（e.Coli）表达菌BL21中的表达。
以质粒T-fru6为模板，设计引物，如下：
F：GTTCATATGGCCACCGAACCAGTGCCTG（SEQ ID NO：18）；
R：CCCAAGCTTTTACTTTGCTACTGCTTTGC（SEQ ID NO：19）。
以F和R扩增fru6基因，经纯化后用限制性内切酶HindⅢ和NdeI双酶切，同时以相同限制性内切酶酶切载体pET22b，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收基因片段和载体，并将基因片段与载体连接，经酶切鉴定及PCR筛选出阳性克隆命名为pET-fru6，从而构建了表达载体pET-fru6。
将构建的重组质粒pET-fru6通过热休克转化法转化大肠杆菌（E.Coli）表达菌BL21感受态细胞，得到重组菌BL21/pET-fru6。同时将pET-22b质粒同样转化入BL21感受态细胞，命名为BL21/pET，用于糖苷酶Fru6表达时的对照菌株。将重组菌BL21/pET-fru6及BL21/pET接种至含100μg mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，180rpm培养过夜后，按2%接种量接种至新鲜LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm培养OD600为0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)，诱导6h。分别将诱导后的糖苷酶Fru6重组菌破碎后离心取上清进行SDS-PAGE，同时以未经诱导的重组菌作为对照，电泳结果如图12所示，其中第一栏为Marker，第二栏为重组菌BL21/pET-fru6加IPTG诱导表达产物，第三栏为重组菌BL21/pET-fru6未加IPTG诱导表达产物，第四栏为BL21/pET加IPTG诱导表达产物，第五栏为BL21/pET未加IPTG诱导表达产物。由此可见经诱导后的重组菌BL21/pET-fru6破碎后的上清中在55kDa左右处均有一明显条带，与初始糖苷酶Fru6的分子量大小一致。同时分别测定破碎液上清中糖苷酶Fru6酶活。加入诱导剂IPTG诱导后重组菌BL21/pET-Fru6的酶活力为3.6U/mL，而BL21/pET及未经诱导的菌基本不存在糖苷酶Fru6酶活。
实施例六突变酶克隆与表达
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6突变酶的克隆与表达。
选取糖苷酶Fru6氨基酸序列的10个位点突变，选取的位点分别为：Ala1、Thr2、Glu3、Glu133、Asp134、Gly135、Ala403、Ala404、Gly405、Ser406，按照从1个氨基酸至10个氨基酸(同源性99%-97.6%)的突变组合获得Fru6突变体。由于10个位点突变组合量大，所以选取部分突变组合获得Fru6突变体，Fru6突变体氨基酸变化列于下表1和表2。本实验中的Fru6突变体是通过Overlap PCR的方法获得，这对于本领域普通技术人员而言是公知可以实现的实验技术。
表1
表2
具体说明突变酶的克隆过程：本例中的所有突变是通过Overlap PCR方法获得。以Fru6突变体Fru6-16为例说明获得Fru6突变体获得过程。需设计四条引物并通过PCR获得Fru6突变体。设计的引物为：
TF1：GCTCATATGGGCAGCGATCCAGTGCCTGGCTTC（SEQ ID NO：20）；
TR1：CCCAAGCTTTTACTTTGCTACTGCTTTGCCATTC（SEQ ID NO：21）；
TF2：GAGCGTCCTGATGAAGCTGGCTGGACCTATGGC（SEQ ID NO：22）；
TR2：GGTCCAGCCAGCTTCATCAGGACGCTCATCGGC（SEQ ID NO：23）。
使用引物TF1与TR2扩增上游基因，以TF2与TR1扩增下游基因，PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec；58℃退火30sec，72℃延伸2min；循环30轮后，72℃保温5min，分别将扩增的上下游基因胶回收，胶回收后的基因片段按等摩尔量混合搭桥，PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec；60℃退火1min，72℃延伸2min；循环10轮后，72℃保温5min，搭桥后的基因经PCR扩增得到突变的Fru6-16的基因，PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec；60℃退火3min，72℃延伸1min20sec；循环20轮后，72℃保温5min，经胶回收后用限制性内切酶HindⅢ和NdeI双酶切，同时以相同限制性内切酶酶切载体pET22b，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收基因片段和载体，并将基因片段与载体连接，连接液转化大肠杆菌BL21，而后经菌落PCR鉴定出阳性克隆。
所有其他Fru6突变体均可以通过以上Overlap PCR方法获得，有些Fru6突变体需要2次及以上次数的上述程序才能最终获得。
将获得的阳性克隆Fru6突变体重组菌及未突变糖苷酶Fru6重组菌接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，180rpm培养过夜后，按2%接种量接种至新鲜LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm培养OD600为0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)，诱导6h。分别将诱导后的糖苷酶Fru6重组菌及Fru6突变体重组菌破碎后离心取上清进行SDS-PAGE，部分Fru6突变体电泳结果如图9所示，其中第一栏为未突变Fru6重组菌诱导表达产物，第二栏-第六栏分别为Fru6突变体Fru6-1、Fru6-4、Fru6-7、Fru6-10、Fru6-13重组菌诱导表达产物，第七栏为Marker，第八栏-第十栏为为Fru6突变体Fru6-16、Fru6-19、Fru6-24重组菌诱导表达产物。由此可见突变糖苷酶同Fru6一致，都可以在大肠杆菌表达菌BL21中实现可溶性表达。
实施例七
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6突变体的酶学性质与催化活性。
采用实施例三中的方法测定糖苷酶Fru6突变酶的最适反应pH值和pH稳定性，最适反应温度和温度稳定性及金属离子的影响。结果发现突变酶的酶学性质与糖苷酶Fru6的酶学性质基本一致。
测定突变酶的催化活力，以转化率为衡量指标。具体结果见表3。
检测方法：配制2g/L的葛根素和60g/L的蔗糖溶于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)中作为反应底物，900底物中加入100μL酶液，30℃保温10~60min，取反应液100μL加入到900μL甲醇中，经HPLC检测。
表3
由上表可以看出，突变酶仍将具有较强的转糖能力，在延长反应时间或者增加突变酶用量的条件下，依然可以达到同未突变糖苷酶Fru6同等的转化能力。
实施例八
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6/Fru6突变体在水相或者有机相中糖基化修饰黄酮类化合物的应用。
耐有机溶剂糖苷酶Fru6/Fru6突变体在水相或者有机相中糖基化修饰葛根素。
所述水相转化条件包括：以10g/L葛根素，100g/L蔗糖为糖基供体，加入20%的发酵液（含果糖基化酶2U/mL)，于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化6小时，45℃加热2小时终止转化反应。转化液经HPLC检测：果糖基化葛根素转化率达95%以上，结果见图10，其中保留时间14.910min的峰为葛根素，保留时间10.131min的峰为单果糖基-β-(2,6)-葛根素，保留时间6.130min的峰为双果糖基-β-(2,6)-葛根素，保留时间5.409min的峰为三果糖基-β-(2,6)-葛根素，保留时间5.144min的峰为四果糖基-β-(2,6)-葛根素，保留时间4.968min的峰为五果糖基-β-(2,6)-葛根素。
所述非水相转化条件包括：采用20%的DMSO，100g/L葛根素，300g/L蔗糖为糖基供体，加入20%的发酵液上清（含果糖基化酶2U/mL)，于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化72小时，45℃加热2小时终止转化反应。转化液经HPLC检测：果糖基化葛根素衍生物转化率达90%。结果见图11，其中保留时间13.735min的峰为葛根素；保留时间7.450min的峰为单果糖基-β-(2,6)-葛根素，保留时间4.603min的峰为双果糖基-β-(2,6)-葛根素；保留时间4.192min的峰为三果糖基-β-(2,6)-葛根素。
在同样的转化条件下，Fru6突变体在延长反应时间或者增加突变酶用量的条件下，依然可以达到同样的果糖基化葛根素衍生物转化率。
耐有机溶剂糖苷酶Fru6/Fru6突变体在有机相中糖基化修饰芒果苷。
所述非水相转化条件包括：采用20%的DMSO，30g/L芒果苷，100g/L蔗糖为糖基供体，加入20%的含果糖基化酶2U/mL的发酵液上清，于1/15mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化48小时，45℃加热2小时终止转化反应。转化液经HPLC检测：果糖基化芒果苷衍生物转化率达92%。结果见图12，其中保留时间14.781min的峰为芒果苷，保留时间8.951min的峰为单果糖基-β-(2,6)-芒果苷，保留时间4.603min的峰为双果糖基-β-(2,6)-芒果苷，保留时间5.541min的峰为三果糖基-β-(2,6)-芒果苷。
在同样的转化条件下，Fru6突变体在延长反应时间或者增加突变酶用量的条件下，依然可以达到同样的果糖基化芒果苷衍生物转化率。
实施例九
本实验说明耐有机溶剂糖苷酶Fru6/Fru6突变体在水相中合成寡糖的应用。
所述水相转化条件包括：以600g/L蔗糖，加入10%的发酵液上清（含果糖基化酶1U/mL)，于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化48小时，100℃煮沸5分钟终止转化反应。转化液经HPLC检测：寡糖转化率达58%，结果见图13，其中保留时间10.320min和12.721min的峰为两种果聚糖。
在同样的转化条件下，Fru6突变体在延长反应时间或者增加突变酶用量的条件下，依然可以达到同样的果寡糖转化率。
Claims (8)
1. 一株耐有机溶剂糖苷酶Fru6产生菌，其分类命名为Arthrobacter arilaitensisNJEM01，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012155。
2. 根据权利要求1所述的耐有机溶剂糖苷酶Fru6产生菌所产的耐有机溶剂糖苷酶Fru6，其特征在于其为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；编码为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3. 权利要求2所述的耐有机溶剂糖苷酶Fru6的突变体，其特征在于：通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的耐有机溶剂糖苷酶Fru6的下述位置上的氨基酸残基而获得的耐有机溶剂糖苷酶Fru6突变体，且所述的氨基酸残基位置选自SEQ ID NO：1中的：(a)第1位；(b)第2位；(c)第3位；(d)第133位；(e)第134位；(f)第135位；(g)第403位；(h) 第404位；(i) 第405位；(j) 第406位；所述的另一种氨基酸残基是：
(a)第1位：甘氨酸；
(b)第2位：丝氨酸；
(c)第3位：天冬氨酸；
(d)第133位：天冬氨酸；
(e)第134位：谷氨酸；
(f)第135位：丙氨酸；
(g)第403位：缬氨酸或甘氨酸；
(h) 第404位：甘氨酸；
(i) 第405位：丙氨酸；
(j) 第406位：苏氨酸。
4. 根据权利要求2-3之一所述的耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体的基因。
5. 包含权利要求4所述基因的重组载体。
6. 包含权利要求5所述重组载体的转化体。
7. 根据权利要求2-3之一所述的耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体在水相或非水相催化果糖基化反应，生成-O-糖苷的应用。
8. 根据权利要求2-3之一所述的耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其突变体在以蔗糖作为糖基受体和供体合成寡聚果糖中的应用。
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