CN111575260B

CN111575260B - SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的应用

Info

Publication number: CN111575260B
Application number: CN202010571375.9A
Authority: CN
Inventors: 李文利; 姚婷婷; 刘晶; 金恩静
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111575260A

Abstract

为了解决现有技术中DMTs采用酶反应进行甲基化修饰的技术空白，本发明提供了一种SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2‑1（来源于海洋链霉菌Streptomyces sp.NRRL F‑5123）在制备甲基化的pre‑DMTs和DMTs中的应用。同时，还提供了该甲基转移酶的氨基酸序列及其核苷酸序列；并且提供了所述的甲基转移酶的克隆表达方法。所述的甲基转移酶DmtMT2‑1具有底物广谱性，能分别以多种pre‑DMTs/DMTs为底物，得到N4位甲基化pre‑DMTs/DMTs，一方面为酶法甲基化修饰DMTs扫清了关键障碍；另一方面也为二酮哌嗪类化合物的药物研制提供新的路径，具有重要的应用价值和社会意义。

Description

SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体涉及一种甲基转移酶及其在DMTs甲基化修饰中的应用。

背景技术

SAM依赖型甲基转移酶是催化以SAM(S-腺苷甲硫氨酸，S-adenosyl-L-methionine)为甲基的直接供体，来进行甲基转移反应的酶。研究表明，通过SAM依赖型甲基转移酶催化实现的甲基化可以极大地改善天然产物的性质。因此，在天然产物生物合成中，SAM依赖型甲基转移酶扮演着重要角色。发明专利申请201310552458.3公开了“L11 MT蛋白作为甲基转移酶的应用”。该申请所述的甲基转移酶能对如下底物蛋白中的至少一种进行甲基化修饰：Sul7d蛋白、Cren7蛋白、RPL11蛋白Rrp4蛋白、Csl4蛋白和Rrp42蛋白。该申请中的甲基转移酶实现了甲基从S-腺苷甲硫氨酸到底物蛋白的转移。由此可知，该申请中的甲基转移酶针对的底物是大分子蛋白。

Drimentines(DMTs)是一类异戊烯化二酮哌嗪类化合物，表现出了显著的抗细菌、抗肿瘤、杀昆虫及寄生虫等多种生物学活性。最早由Lacey Ernest等人从放线菌MST-8651中分离出，随后由Novartis Animal Health Australasia与Microbial ScreeningTechnologies公司对DMT A-E提交了专利申请(WO98/09968)。2012年，车茜等人从广东红树林保护区芦苇根际土壤中分离鉴定链霉菌CHQ64(Genbank No:JQ405211)，对其发酵产物进行分离鉴定出IndotertineA、B和DMT F、G、H和C，并提交了专利申请(CN102276613A)。目前，DMTs骨架的生物合成已经被阐明。以DMT G为例：首先，环二肽合酶合成cyclo(L-Trp-L-Val)(cWV)；然后，异戊烯基转移酶将法尼西基加载至cWV得到pre-DMT G(结构如式(2)所示)；最后，在萜类环化酶的作用下得到DMT G。

此外，根据文献报道，现有技术中DMTs采用菌株直接发酵和化学全合成得到，但尚未见通过酶反应制备DMTs。其中，DMTs中N15位的甲基化修饰具普遍性，以DMT F为例，其结构如式(1)所示。与N15位的甲基化修饰相比，N4位的只有甲酰化修饰，未见N4位甲基化修饰的报道。但总而言之，DMTs的甲基化机制一直未得到阐明。如上所述，甲基化修饰可以极大地改善天然产物的性质；且该类化合物在发酵液中的含量较低，产量受限，大大制约了其在产业上的应用前景。因此，通过酶法阐明DMTs的甲基化修饰，将为二酮哌嗪类化合物的药物研制提供新的路径，具有重要的应用价值和社会意义。

发明内容

为了解决现有技术中DMTs采用酶反应进行甲基化修饰的技术空白，本发明提供了SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1(来源于海洋链霉菌Streptomyces sp.NRRL F-5123)在甲基化修饰pre-DMTs/DMTs中的应用。所述的甲基转移酶DmtMT2-1具有底物广谱性，能分别以多种pre-DMTs/DMTs为底物，得到N4位甲基化pre-DMTs/DMTs，为酶法甲基化修饰DMTs扫清了关键障碍。

本发明的技术方案：SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的应用，是指所述甲基转移酶DmtMT2-1在制备甲基化的pre-DMTs/DMTs中的应用；所述甲基转移酶DmtMT2-1的氨基酸序列选自如下(1)、(2)或(3)：

(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有催化甲基供体结合到环二肽α-N活性的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同源性≥90％，且所表达蛋白具有催化甲基供体结合到环二肽α-N活性的氨基酸序列。

编码所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列选自如下(1)、(2)、(3)或(4)：

(1)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达蛋白具有催化甲基供体结合到环二肽α-N活性的核苷酸序列；

(4)与(1)、(2)或(3)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

所述的应用为，所述甲基转移酶DmtMT2-1将甲基供体结合到pre-DMTs/DMTs的N4位上；所述的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸。其中，所述pre-DMTs/DMTs为pre-DMT/DMT A，pre-DMT/DMT C，pre-DMT/DMT G或pre-DMT/DMT F。

含有编码所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列的表达载体。

所述的表达载体在表达SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1中的应用。

所述甲基转移酶DmtMT2-1的克隆表达方法，其特征在于：包括如下步骤：将编码所述的甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列克隆入表达载体中构建表达载体；再将所述的表达载体转入表达系统中进行蛋白表达；最后经纯化得到所述的甲基转移酶DmtMT2-1。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，公开了其催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸到pre-DMTs/DMTs转移的功能，填补了酶法对pre-DMTs进行N4位甲基化修饰的技术空白，对于酶法合成DMTs技术发展具有里程碑式的意义。

(2)本发明所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，能以pre-DMTs/DMTs为底物，具有底物广谱性，因此在DMTs的N4位甲基化修饰中具有重要的地位。

(3)本发明所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，对DMTs在N4位甲基化，为二酮哌嗪类化合物的药物研制提供新的路径，具有重要的应用价值和社会意义。

附图说明

图1是本发明中纯化的甲基转移酶DmtMT2-1的SDS-PAGE分析电泳图；

图2是本发明中DmtMT2-1与pre-DMT G/DMT G酶学反应的高效液相色谱(HPLC)图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：甲基转移酶DmtMT2-1基因的克隆及体外表达

1、基因组DNA的提取

将链霉菌Streptomyces sp.NRRL F-5123接种于TSBY液体培养基中，30℃培养，离心收集菌体，用1mL的STE buffer洗涤；加入500uL STE buffer配制的3～5mg/ml溶菌酶溶液，充分悬浮菌体，于37℃水浴30min，至细胞成为半透明状；加入250uL 6％的SDS，上下轻轻混匀，继续37℃水浴至澄清；加入1/10体积的3M NaAc(pH＝4.8)后，再加入200uL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1；v/v/v)，混合，12000rpm离心；移取上层清液，反复用酚:氯仿:异戊醇抽提，至中间层无蛋白杂质，转移上清，加入等体积的异丙醇，混合直至有白色絮状DNA沉淀析出；挑出絮状沉淀，用70％的乙醇洗涤1次；室温晾干后，用适量的TE溶解基因组DNA，备用。

2、重组载体的构建

将上述制备的链霉菌Streptomyces sp.NRRL F-5123的T-DNA稀释10倍作为模板进行PCR，设计引物对：

DmtMT2-1-F：5’–GGAATTCCATATGCAGCAGCAGACCACGGCG-3’/DmtMT2-1-RP：5’–CCGCTCGAGTCAGTTCCGCGCGGCGACG-3’。引物对DmtMT2-1-FP/RP用来扩增甲基转移酶DmtMT2-1的功能基因。

PCR反应体系：

引物对DmtMT2-1-FP/RP各5μl(50pmol)，模板5μl 10×Reaction Buffer 10μl，2.5mM dNTP 10μl，25mM MgCl₂ 6μl，pfu DNA Polymerase 1μl(5U/μl)，加ddH₂O至100μl。

PCR条件：

功能基因扩增条件，98℃变性2min；95℃10s，66.3℃15s，72℃10s，25循环；72℃5min。将其克隆到表达载体pET28a上，构建重组质粒pET28a-dmtMT2-1。

3.dmtMT2-1在大肠杆菌中的表达与纯化

将构建的重组载体分别导入大肠杆菌BL21(DE3)中，过夜菌液接种于1L含有50μgmL^-1卡那青霉素LB液体培养基，37℃培养至OD₆₀₀约为0.8，加入0.05mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),于16℃继续培养16小时。离心收集菌体，用缓冲液(0.05M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH7.5,containing cOmplete^TM protease inhibitor cocktail)重溶菌体，超生破碎菌体，经镍柱纯化，SDS-PAGE检测(如图1所示)，得到大小为33.2kDa的DmtMT2-1。将纯度较高的酶进行浓缩置换至缓冲液(0.025M Tris-HCl,0.02M NaCl,and 10％glycerol,pH 7.5)中，-80℃保存备用。

实施例2：DmtMT1的体外酶活检测

DmtMT2-1反应体系：50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，0.5mM SAM,10μM DmtMT1,0.5mM pre-DMT G/DMTG。

反应条件：30℃,12h,反应结束后加入等体积的甲醇终止反应，17,000xg离心30min除去反应体系中的蛋白。所得上清，进行HPLC检测分析。

HPLC检测条件：使用反相YMC-Pack ODS-AQ C18 column(规格：50mm×4.6mm,5μm,

)；柱温30℃；流动相A相(乙腈+0.1％甲酸)和B相(ddH₂O+0.1％甲酸)；洗脱条件：0-5min 50％A相和50％B相；5-30min梯度洗脱，50％-100％A相和50％-0％B相，检测波长为300nm，流速为1mL min^-1。

从HPLC获得的谱图(图2)可知，图2i)与图2ii)相比，在28min处出现了新的吸收峰；图2iii)与图2iv)相比，在28.4min处出现了新的吸收峰。这说明，DmtMT2-1可以精准识别pre-DMT G和DMTG，并发生酶促反应。

将上述反应产物分离纯化，然后进行核磁检测，其碳谱和氢谱数据如表1所示。经鉴定，所得化合物为pre-DMT G的N4甲基化产物N4-methyl-DMT G(结构如式(3)所示)和DMTG的N4甲基化产物N4-methyl-pre-DMT G(结构如式(4)所示)。这说明，本发明所述的甲基转移酶DmtMT2-1具有底物广谱性，具有很好的应用前景。

表1.实施例2产物的核磁氢谱(600MHz)和碳谱(500MHz)数据(溶剂DMSO-d6)

综上可知，本申请所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1，实现了甲基从S-腺苷甲硫氨酸到pre-DMTs/DMTs的转移；且由于其具有底物广谱性，实现了多种N4位甲基化的pre-DMTs/DMTs的酶法制备。因此，本申请所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1填补了酶法对pre-DMTs/DMTs进行N4位甲基化修饰的技术空白，对于酶法合成pre-DMTs/DMTs在产业上的应用前景具有重要的意义。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 294

<212> PRT

<213> 海洋链霉菌(Streptomyces sp. NRRL F-5123)

<400> 1

Met Gln Gln Gln Thr Thr Ala Ala Arg Ala Pro Gly Ala Pro Ala Val

1 5 10 15

Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gly Gly Glu Gly Asp Gly Asp Gly Ile Gly

20 25 30

Gly Leu Tyr Asp Lys Val Ser His Ile Leu Ser Gly Pro Tyr Gly Gly

35 40 45

Asn Leu His Ile Gly Leu Trp Ala Glu Pro Arg Glu Asp Asp Thr Leu

50 55 60

Pro Arg Ala Ala Asp Arg Met Thr Asp Leu Val Ala Asp His Leu Met

65 70 75 80

Leu Ser Arg Gly Gln His Leu Leu Asp Val Gly Ser Gly Thr Gly Ala

85 90 95

Pro Ala Leu Arg Ile Ala Arg Arg His Gly Val Glu Val Thr Gly Val

100 105 110

Ser Val Ser Ala Val Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Leu Ala Arg Ala

115 120 125

Glu Gly Leu Ala Glu Arg Val Arg Phe Glu Arg Ala Asp Ala Leu Ala

130 135 140

Leu Pro Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ala Ala Cys Ala Val Glu Ser

145 150 155 160

Met Ser His Ile Arg Asp Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gln Ile Arg Arg

165 170 175

Val Leu Arg Pro Gly Gly Arg Leu Val Val Ala Asp Gly Met Leu Leu

180 185 190

Pro Pro Gln Gly Pro Arg Pro Arg Glu Ala Arg Ala Leu Asp Ala Gly

195 200 205

Pro Ala Met His Leu Pro Pro Thr Leu Glu Gly Trp Arg Thr Glu Leu

210 215 220

Arg Glu Ser Gly Leu Thr Pro Leu Glu Ala Val Asp Leu Ser Asp His

225 230 235 240

Trp Arg His Ser Ala Ala Gln Met Leu Arg Leu Met Ala Glu Ala Arg

245 250 255

Gly Glu Phe Glu Arg Ala Ile Gly Ala Glu Glu Phe Gly Ala Ala Leu

260 265 270

Ala Gly Leu Glu Gln Phe Cys Gly His Pro Asp Leu Gly Tyr Val Leu

275 280 285

Leu Val Ala Ala Arg Asn

290

<210> 2

<211> 885

<212> DNA

<213> 海洋链霉菌(Streptomyces sp. NRRL F-5123)

<400> 2

atgcagcagc agaccacggc ggcccgtgcc cccggcgccc ccgccgtcct cccgcctccc 60

ggacagggcg gcgaggggga cggggacggc atcggcggcc tctacgacaa ggtgtcgcac 120

atcctgtccg gcccctacgg agggaatctg cacatcggcc tgtgggccga gccccgcgag 180

gacgacacgc tcccccgggc cgccgaccgg atgaccgacc tggtcgccga ccacctgatg 240

ctctcgcgcg ggcagcacct gctggacgtc ggctcgggca ccggcgcacc ggccctgcgc 300

atcgcgcgcc ggcacggtgt cgaggtcacc ggagtgtccg tcagcgccgt ggagacggac 360

cgggccaccg cgctggcccg cgccgagggg ctcgccgagc gcgtccggtt cgagcgcgcc 420

gacgccctgg cgctgccgta cggcgccgga tccttcgacg cggcctgcgc ggtggagtcg 480

atgagccata tccgcgaccg cgccggtgcg ctggcgcaga tccgccgggt cctgcgtccg 540

ggcgggcgcc tggtggtcgc cgacggaatg ctgctgcccc cgcagggccc gcgcccgcgg 600

gaggcacggg cgctcgacgc cggcccggcg atgcacctgc cgcccacgct ggagggatgg 660

cgtacggagc tgcgggagag cgggctgacc ccgctggaag ccgtcgacct cagcgaccac 720

tggcgtcact cggcggccca gatgctccgg ctgatggccg aggcgcgcgg ggagttcgaa 780

cgggccatcg gcgccgagga gttcggtgcg gccctcgcgg ggctggagca gttctgcggc 840

catccggatc tgggttacgt cctgctcgtc gccgcgcgga actga 885

Claims

1.SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的应用，其特征在于：所述甲基转移酶DmtMT2-1在制备甲基化的pre-DMTs/DMTs中的应用；所述甲基转移酶DmtMT2-1的氨基酸序列为如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；所述的应用为所述甲基转移酶DmtMT2-1将甲基供体结合到pre-DMTs/DMTs的N4位；所述pre-DMTs/DMTs为pre-DMT/DMTG，所述的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码所述的SAM依赖型甲基转移酶DmtMT2-1的核苷酸序列为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。