CN115992109A

CN115992109A - 石吊兰素糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN115992109A
Application number: CN202211085566.XA
Authority: CN
Inventors: 尹青岗; 向丽; 吴田泽; 高冉冉; 陈伟强; 万会花; 陈士林
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2022-09-06
Filing date: 2022-09-06
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了石吊兰素糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的石吊兰素糖基转移酶蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有石吊兰素糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明基于吊石苣苔三代全长转录组数据，用反向遗传学的方法找到并鉴定石吊兰素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和石吊兰素‑5‑O‑β‑D‑葡萄糖苷合成的特异糖基化修饰酶LpUGT95，为生物合成石吊兰素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和石吊兰素‑5‑O‑β‑D‑葡萄糖苷提供了糖基转移酶蛋白及其编码序列。

Description

石吊兰素糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及石吊兰素糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

石吊兰素Lysionotin(又称Nevadensin)化学名为5,7-二羟基-6,8-二甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)色烯-4-酮(5,7-dihydroxy-6,8-dimethoxy-2-(4-methoxyphenyl)chromen-4-one)。分子式为C18H16O7，溶于DMSO，微溶于甲醇，不溶于水。石吊兰素是苦苣苔科植物中比较特异的一种化合物，已被确立为一种有前景的天然生物活性物质，有可能成为药物设计中的新型“天然先导物”。其代表植物吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)的野生资源丰富，来源十分广泛，并且提取方法和纯化工艺相对简单。石吊兰素是一种天然存在的人羧基酯酶1(hCE1)的选择性抑制剂。药理实验研究表明，石吊兰素具有保肝、降压、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、神经保护等作用，同时，临床上还有利于治疗淋巴结核、肺结核、骨结核以及支气管炎。Lena Müller等报道了石吊兰素对体外拓扑异构酶(TOPO)的影响，结果显示石吊兰素通过激活半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3诱导内源性凋亡途径，揭示了细胞周期破坏和凋亡事件在石吊兰素引起的HT29细胞TOPO I中毒的细胞反应中起关键作用，揭示了石吊兰素的DNA嵌入特性。石吊兰素被张亚芬研究发现可能降低肥大细胞干细胞生长因子(c-Kit)受体表达，具有缓解小鼠食物过敏反应的作用。Wang等通过对一系列天然黄酮类化合物的初步筛选，发现石吊兰素是一种对hCE1比hCE2具有高度选择性的抑制剂。但由于石吊兰素水溶性差，极大地制约了石吊兰素的推广和应用。石吊兰素经过糖基化修饰后，不仅可以极大地提高其可溶性，还可以改善药效。以石吊兰素为基本结构，进行结构修饰以增强石吊兰素活性，扩大应用范围是一项重要的研究工作。

国内外对石吊兰素的研究停留在化学提取及合成、药理活性阶段，石吊兰素结构修饰的研究报道较少。早在1966年，石吊兰素被Farkas在Iva物种中首次分离并使用14步合成方法证明其结构。随后中国科学院上海药物研究所研究员对设计路线进行简化，总收率提高10倍以上。石吊兰素不溶于水，其钠盐为水溶性，但临床注射会给患者带来疼痛，因此，该研究员合成了一种肌内注射用石吊兰素甲胺糖苷盐，具有很好的抑菌活性。综上，亟待一种特异性高的酶，来特异合成石吊兰素糖苷，为药物合成设计提供新参考。

发明内容

虽然现在已有石吊兰素糖苷化学提取的报道，但尚未有公布的石吊兰素糖苷生物合成方法。本发明主要是基于吊石苣苔三代全长转录组，获得石吊兰素糖基转移酶序列，并通过原核表达重组蛋白，确认LpUGT95可以催化石吊兰素糖基化生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和/或石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有石吊兰素糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述石吊兰素糖基转移酶活性是催化石吊兰素糖基化生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和/或石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

将该基因命名为LpUGT95，将其编码的蛋白命名为LpUGT95。具体信息如下：LpUGT95基因序列如序列表中序列1所示，其含有1416个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由471个氨基酸组成。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述蛋白在作为石吊兰素糖基转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白、所述编码基因在催化UDP-葡萄糖和石吊兰素生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和/或石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷中应用也属于本发明的保护范围。

本发明基于吊石苣苔三代全长转录组数据，用反向遗传学的方法找到并鉴定石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖合成的特异糖基化修饰酶LpUGT95，为生物合成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖提供了糖基转移酶蛋白及其编码基因。

附图说明

为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：

图1为LpUGT95基因克隆和pMAL-c2X连接载体构建结果。

图2为pMAL-c2X-LpUGT95转化Novablue结果。

图3为LpUGT95重组蛋白SDS-Page胶图。

图4为LpUGT95对石吊兰素催化活性鉴定UPLC图。

图5为LpUGT95对石吊兰素催化产物MS和MS/MS鉴定图。

图6为石吊兰素(左)、石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷(中)和石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷(右)分子结构式。

具体实施方式

实施例1、克隆石吊兰素糖基转移酶蛋白的编码基因

一、基因获得的方法和步骤

吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)(记载过吊石苣苔(Lysionotuspauciflorus)的非专利文献是：黄梅,李美君,黄红,等.贵州省野生苦苣苔科物种多样性与地理分布[J].广西植物,2022,42(2):210-219.DOI:10.11931/guihaia.gxzw202008055.)样品植株采自中国贵州省安龙县仙鹤坪镇，根、茎、叶、花4个组织样品快速存于-80℃用于多组学等实验。基于吊石苣苔三代全长转录组，结合UGTs保守结构域PSPG box，获得187个302aa-560aa的LpUGTs序列，通过二代+三代转录组和广靶代谢组联合分析，着重关注LpUGT95。

在贵州省安龙县仙鹤坪收集吊石苣苔的根、茎、叶和花，提取RNA，反转录为cDNA，设计引物序列(如表1)，以根、茎、叶和花的混合cDNA为模板，利用KOD高保真酶克隆到1个LpUGT基因片段(KOD高保真酶PCR体系总体积为50μL：5μL 10ⅩBuffer，3μL MgSO₄，5μLdNTP(2mM)，3μL引物(10mM)，1μL模板和32μL水，程序如表2)。借助pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB101-01)，成功将LpUGT95片段连入载体上(连接体系总体积为2.5μL：0.5μL Mix Buffer with enzyme和2μL模板，25℃反应2h)。连接体系直接转化TransT1感受态(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB101-01)，挑选阳性克隆测序(菌落PCR体系总体积为20μL：13μL Mix Buffer，1μL模板，1μL引物和5μL水，程序如表3)，与transcript序列比对，核苷酸序列与原数据98％相似度，以实际测序结果为准。

表1克隆基因所用引物序列

标注：仅列出成功表达重组蛋白的1个基因的引物序列。

表2 KOD高保真酶PCR反应程序

表3菌落PCR反应程序

二、获得基因序列以及其编码的蛋白序列

获得的LpUGT95基因含有1416个核苷酸，如序列表中序列1所示；其编码471个氨基酸的蛋白，如序列表中序列2所示，将其编码的蛋白命名为LpUGT95。

三、基因功能验证

我们借助原核系统对基因功能进行了验证，构建pMAL-c2X-LpUGT载体，测序确认序列正确后，将载体成功转入原核表达菌株Novablue(购自北京华越洋生物科技有限公司)进行体外验证(图1)。

首先，给LpUGT片段加上酶切位点接头(体系和程序跟上述基因克隆方法一致，引物信息如表4)；LpUGT片段(带有酶切位点)酶切后，利用T4-DNA连接酶，将其构建到表达载体pMAL-c2X(由Yin提供，记载过表达载体pMAL-c2X的非专利文献是：Yin Q,Han X,Han Z,Chen Q,Shi Y,Gao H,Zhang T,Dong G,Xiong C,Song C,Sun W,Chen S.Genome-wideanalyses reveals aglucosyltransferase involved in rutin and emodin glucosidebiosynthesis in tartary buckwheat.Food Chem.2020Jul 15；318:126478.doi:10.1016/j.foodchem.2020.126478.Epub 2020Feb 25.PMID:32126466.)上(连接体系总体为7μL：3.5μL Mix Buffer，2.8μL LpUGT片段和0.7μL pMAL-c2X；4℃反应过夜)；其次，连接体系转化TransT1后，挑选阳性克隆(图1)；提取质粒后，转化到表达菌株Novablue。

表4构建原核表达所用引物序列

表注：序列中小写字母为保护碱基和酶切位点。

Novablue转化操作步骤如下：

1.取5μL质粒(约200μg/μL)至50μLNovablue感受态(购自北京华越洋生物科技有限公司)中，混匀；

2.冰浴20-30分钟后，42℃水浴热激1分钟；冰浴2分钟；

3.加入500μL液体LB培养基(不含抗生素)，于37℃振荡培养1小时(200rpm)；

4.取1/2体积菌液，吹打混匀后，涂布于LB固体培养基(含氨苄青霉素)；

5.37℃倒置培养过夜，挑选单克隆进行PCR验证(如图2)。挑选3个pMAL-c2X-LpUGT95单克隆，在1500bp处均有阳性条带。

重组蛋白的诱导、纯化、酶活分析和产物鉴定如下：

1)重组蛋白的诱导

分别挑取pMAL-c2X-UGT与pMAL-c2X单克隆菌落于2mL LB(含Carb 100mg/L)液体培养基中37℃中振荡(200rpm)过夜培养。

取1mL过夜培养的菌液加入100mL新鲜的LB培养液(含Carb 100mg/L，0.2％过膜灭菌的葡萄糖)中，37℃摇床培养至600nm OD值为0.5-0.6时，取1mL菌液，收集菌体作为对照。

在100mL菌液中加入30μL IPTG(1M，异丙基-β-D-硫代半乳苷)，终浓度为0.3mM，于16℃培养24h。

4℃，8,000×g离心3min，收集菌体。

2)重组蛋白的纯化

根据pMAL融合蛋白和纯化系统(New England BioLab Inc.)手册对重组UFGT蛋白进行纯化。简而言之，柱缓冲液重悬上面收集的菌液沉淀，并-20℃过夜。次日样品融化后，利用超声破碎仪对细胞破碎，释放蛋白，高速9,000×g离心30mins后，待上样；利用柱缓冲液(8倍柱体积)活化亲和柱填料(流速为1mL/min)，将样品5倍稀释后上样，待样品都流过亲和柱填料后，用12倍柱体积的柱缓冲液冲洗杂蛋白，最后利用5倍柱体积柱缓冲液(10mM麦芽糖)洗脱目标蛋白。利用Millpore(30KDa)浓缩并置换成酶活反应缓冲液。SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色，确认重组蛋白(图3)。

3)酶活性的测定

一般酶活反应体系为50μL，如表5。37℃，反应2h后，用三倍体积甲醇终止反应，13,000rpm离心10min。取2μL上样。

表5重组蛋白酶活反应体系

4)酶活产物分析与鉴定

利用原核表达系统，成功表达了LpUGT95的重组蛋白，进一步酶活分析来鉴定它们的功能。酶活反应的供体为UDP-葡萄糖(购自Sigma公司)，受体为石吊兰素(购自成都普思生物科技股份有限公司，产品批号PS010177)。

UPLC条件：

UPLC型号：Nexera UHPLC LC-20A system(SHIMADZU,Japan)。

流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈。

洗脱梯度：0-7min，5％-100％B；7-9min，100％B；9-10.5min，100％-5％B；10.5-11.5min,5％B。

DAD检测波长：335nm。

利用质谱鉴定酶活产物，发现LpUGT95对于受体为石吊兰素、供体为葡萄糖的酶活反应产物峰有两个(图4，图5，峰I、峰II)，其中峰I的质荷比均比底物质荷比多出162(一个葡萄糖和底物羟基脱去一分子水后，产物增加的分子量)，表明其产物为石吊兰素的单葡萄糖苷；峰II的一级质谱图检测到质荷比为505.2的[M-H]-离子碎片与峰I一致，但未检测到底物离子碎片，左侧对应505.2母离子的二级质谱图与峰I一致，因此推测峰II产物也为石吊兰素的单葡萄糖苷。根据化合物结构式(图6，左图为底物石吊兰素，中图为产物I石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷，右图为产物石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷)，石吊兰素仅在A环5位或7位存在羟基可以进行O-糖基化，因此产物为石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷。综上所述，体外酶活证据显示LpUGT95编码了催化糖基化石吊兰素生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷的糖基转移酶蛋白。

质谱条件：

质谱前的样品准备同UPLC前的样品准备。

利用UPLC MS/MS对样品进行分离，柱子为InfinityLab Poroshell 120EC-C18column(2.1*50mm 1.9-micron；Agilent)，流动相与UPLC相同，洗脱梯度为0min，5％B；7min，95％B，最后95％B平衡(7-8min)，流速为0.30mL/min，检测波长同上。

UPLC MS/MS质谱条件，电喷雾离子化，全离子扫描，负离子模式negative-ion(EI)质谱分析。负离子模式条件如下：gas temperature：300℃，gas flow：6L/min，nebulizer：30psi，sheath gas temperature：300℃，sheath gas flow：11L/min，capillary voltage：2500V，nozzle voltage：2000V，collision energy：30V。。石吊兰素在负离子模式下的特征离子为343.1和241.1。

5)LpUGT95的催化活性

为进一步了解LpUGT95重组蛋白的催化特性，我们检测了它对于石吊兰素的催化活性。酶活反应体系，总体积为50μL，其中包括：10μg LpUGT95重组蛋白与2mM UDP-葡萄糖和10-400μM石吊兰素(分别为10、20、40、100、200、400μM)。30℃反应30min后，三倍体积甲醇终止反应，14000rpm高速离心后，过0.22μm膜，取2μL UPLC检测。实验发现，LpUGT95重组蛋白对于石吊兰素葡萄糖基化的K_m为596.5μM，k_cat/K_m为0.28s^-1μM^-1(如表6)。

表6 LpUGT95重组蛋白酶催化活性

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims

1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述石吊兰素糖基转移酶活性是催化石吊兰素糖基化生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和/或石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物。

6.权利要求1或2所述的蛋白在作为石吊兰素糖基转移酶中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述石吊兰素糖基转移酶活性是催化石吊兰素糖基化生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和/或石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

8.权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3或4所述编码基因在催化UDP-葡萄糖和石吊兰素生成石吊兰素-7-O-β-D-葡萄糖苷和/或石吊兰素-5-O-β-D-葡萄糖苷中应用。