CN117431285A - 玉米糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在合成黄酮糖苷衍生物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了玉米糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在合成黄酮糖苷衍生物中的应用。本发明属于分子生物学领域，具体涉及玉米糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在合成黄酮糖苷衍生物中的应用。本发明的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.3，玉米糖基转移酶可调控合成黄酮糖苷衍生物。ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在一定温度和pH范围内催化木犀草素生成底物的转化率较高(>90％)。此外，ZmUGT84A1和ZmUGT94A2具有较宽的底物催化活性，可以将圣草酚、柚皮素、芹菜素、槲皮素和山奈酚转化为单氧葡糖苷和二氧葡糖苷，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及玉米糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在合成黄酮糖苷衍生物中的应用。
背景技术
类黄酮化合物是一类普遍存在于植物体内的多酚类天然产物，具有广泛的生物活性。特别值得关注的是，大量研究表明类黄酮可以改善人体健康，如抗氧化、抗炎症、抗癌和抗糖尿病活性。我们前期的研究表明，C-糖苷黄酮异荭草素可以降低双转基因APP/PS1小鼠的阿尔茨海默病相关标志物。
糖基化是一种重要的修饰反应，常发生在类黄酮生物合成的最后一步，影响类黄酮的溶解度、理化稳定性、生物活性、药代动力学和细胞定位。糖基化是由糖基转移酶(GTs)催化的，它将糖基片段从激活的供体分子转移到受体分子，形成糖苷键。根据CAZy(http://www.cazy.org/GlycosylTransferase-family)的最新更新，GT分为115个家族。尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)由于其独特的糖基化活性而引起了广泛的关注。UGTs的C端有一个保守的44个残基基序，称为植物次生产物糖基转移酶(PSPG)，它是糖识别所必需的，并负责糖基的结合。UGTs在植物中广泛存在，有些UGTs对糖苷元的个别羟基表现出严格的区域选择性。
木犀草素具有抗氧化、抗炎和免疫调节等多种生物学作用，富含木犀草素的植物常被用于治疗各种疾病，如高血压，炎症性疾病，甚至癌症。由于木犀草素有4个羟基基团(C5、C7、C3’和C4’位)，不同类型的功能基团或糖苷可以与这些位置结合，形成许多不同但结构相似的化合物，最常见的木犀草素衍生物是C-和O-糖苷。荭草素是木犀草素的8-C-葡萄糖苷衍生物，具有一系列与健康相关的生物学特性，如抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎、血管舒张等作用。它在不同的药用植物中发现，如竹叶、西番莲、亚麻、巴西棕榈和许多其他植物。另一种木犀草素衍生物异荭草素(木犀草素-6-C-葡萄糖苷)作为抗氧化剂，具有光保护，肝保护和抗炎作用。除了这两类木犀草素的C-葡萄糖苷，木犀草素-O-葡萄糖苷也具有重要的生物活性。例如木犀草素7-O-葡萄糖苷能减轻异位性皮炎模型小鼠的皮肤损伤，保护细胞免受缺氧/复氧诱导的凋亡等功能。但是，目前木犀草素7-O-葡萄糖苷及木犀草素-二-O-葡萄糖苷的获取主要是从药用植物中提取，含量很低，无法满足市场需求。而化学合成常受到收率低、选择性差、官能团保护和去保护步骤多等限制，因此，发掘合成这些衍生物的关键酶，从而通过体外生物合成的方式来提高一系列木犀草素氧糖苷的产量具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何通过体外生物合成的方式来提高木犀草素氧糖苷的产量，并在此基础上进一步明确玉米糖基转移酶对其它黄酮糖苷衍生物的反应活性。
为了解决上述问题，本发明提供了蛋白质或其相关生物材料在调控合成黄酮糖苷衍生物中的应用。
本发明提供的蛋白质或其相关生物材料在调控合成黄酮糖苷衍生物中的应用，其中所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系；
所述蛋白质可为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
(A3)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A4)与(A1)-(A3)中任一所限定的氨基酸序列具有75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(A5)在(A1)-(A4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
所述蛋白质可为玉米糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ZmUGT84A1和ZmUGT84A2且具有蛋白质ZmUGT84A1和ZmUGT84A2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述蛋白质来源于玉米(Zea mays L.)。
上述应用中，所述相关生物材料可为下述中的任一种：
C1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，所述核酸分子可为如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述是本领域技术人员公知的，能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为pMAL-c2X载体。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性等。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。
上述应用中，所述合成黄酮糖苷衍生物可为如下任一：
P1)在制备4’,7-二-O-葡萄糖苷中的应用；
P2)在制备3’,7-二-O-葡萄糖苷中的应用；
P3)在制备单氧葡糖苷中的应用；
P4)在制备二氧葡糖苷中的应用；
P5)在制备催化木犀草素的产品中的应用；
P6)在制备催化圣草酚的产品中的应用；
P7)在制备催化柚皮素的产品中的应用；
P8)在制备催化芹菜素的产品中的应用；
P9)在制备催化槲皮素的产品中的应用；
P10)在制备催化山奈酚的产品中的应用；
P11)提高产品中O-糖基化类黄酮含量。
本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料可在如下中的应用：
1)制备具有类黄酮-二-O-糖基转移酶活性的产品；
2)制备类黄酮-二-O-糖基转移酶。
所述类黄酮-二-O-糖基转移酶为ZmUGT84A1或/和ZmUGT84A2。
本发明还提供了制备前文所述的蛋白质的方法。
本发明提供的制备前文所述的蛋白质的方法，包括使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤。
上述方法中，所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。
所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。
在一个具体的实施例中，所述重组大肠杆菌为将外源基因导入大肠杆菌NovaBlue(DE3)感受态得到的表达所述重组蛋白质的重组微生物。
所述重组载体为将载体pMAL-c2X的5’-CAGAATTCGGATCCTCTAGA-3’和5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTT-3’之间的小片段替换为外源基因(核苷酸序列为SEQ ID No.2或SEQID No.4所示的DNA分子)得到的重组载体。重组载体具体可为pMAL-c2X-ZmUGT84A1和pMAL-c2X-ZmUGT84A2。
本发明还提供了一种重组肠杆菌，所述重组肠杆菌含有前文所述的蛋白质的编码基因。
上文中，所述重组肠杆菌表达前文所述的蛋白质。
上文中，所述肠杆菌可为大肠杆菌。
本发明还提供了合成黄酮糖苷衍生物的方法，包括利用底物柚皮素、圣草酚、芹菜素、槲皮素和山奈酚，获得产物柚皮素-O-葡萄糖苷，圣草酚-O-葡萄糖苷，圣草酚-二-O-葡萄糖苷，芹菜素-O-葡萄糖苷，芹菜素-二-O-葡萄糖苷，槲皮素-O-葡萄糖苷，槲皮素-二-O-葡萄糖苷，山奈酚-O-葡萄糖苷，山奈酚-二-O-葡萄糖苷。
在一个具体的实施例中，ZmUGT84A1和ZmUGT94A2可以催化木犀草素单氧糖苷生成木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷和木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷。
所述催化为在体外条件下进行催化。
所述催化的体外条件为：针对主产物木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷，ZmUGT84A1最佳条件为pH 9.5和温度25℃；ZmUGT94A2的最佳条件是pH 7.5和45℃。
本发明克隆玉米中两个类黄酮二-O-糖基转移酶基因ZmUGT84A1和ZmUGT84A2。用大肠杆菌表达的两种重组酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2对木犀草素具有多位点糖基化催化作用，在体外两步糖基化反应中主要生成4’,7-二-O-葡萄糖苷，少量生成3’,7-二-O-葡萄糖苷；此外，ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在一定温度和pH范围内催化木犀草素生成底物的转化率较高(＞90％)；同时，ZmUGT84A1和ZmUGT94A2具有较宽的底物催化活性，可以将圣草酚、柚皮素、芹菜素、槲皮素和山奈酚转化为单氧葡糖苷和二氧葡糖苷。高效的糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2可作为有效合成各种类黄酮苷的工具，并可应用于作物育种、或提高食品中O-糖基化类黄酮含量。
附图说明
图1为ZmUGT84A1-MBP和ZmUGT84A2-MBP纯化重组蛋白的SDS-PAGE图。其中A.纯化重组蛋白ZmUGT84A1-MBP；B.纯化重组蛋白ZmUGT84A2-MBP；a、b、c分别为：未诱导，粗提液，纯化的重组蛋白；M:蛋白Marker.红色边框标记目标片段。
图2为ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化木犀草素转化产物的HPLC图谱A、B和峰面积C、D。其中峰1：木犀草素-3’-O-葡萄糖苷；峰2：木犀草素-4’-O-葡萄糖苷；峰3：木犀草素-7-O-葡萄糖苷；峰4：木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷；峰5：木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷；L：木犀草素。
图3为酶促反应产物和标准品的色谱图和质谱图。其中A-E.ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化底物产生的质谱图(峰1-5)：峰1：木犀草素-3’-O-葡萄糖苷；峰2：木犀草素-4’-O-葡萄糖苷；峰3：木犀草素-7-O-葡萄糖苷；峰4：木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷；峰5：木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷；F-H.标准品木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)图谱。
图4为分别以木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷为底物，ZmUGT84A1(A)和ZmUGT84A2(B)体外催化生成产物的HPLC图谱。其中L-30min：这是指图3中反应时间为30分钟的组，作为峰(产物)的参照；L:木犀草素。峰2/峰3对照组：木犀草素-4’-O-葡萄糖苷/木犀草素-7-O-葡萄糖苷标准品；峰2+ZmUGT84A1：ZmUGT84A1催化木犀草素-4’-O-葡萄糖苷的产物峰；峰3+ZmUGT84A1：ZmUGT84A1催化木犀草素-7-O-葡萄糖苷的产物峰；峰2+ZmUGT84A2：ZmUGT84A2催化木犀草素-4’-O-葡萄糖苷的产物峰；峰3+ZmUGT84A2：ZmUGT84A2催化木犀草素-7-O-葡萄糖苷的产物峰；
图5为以木犀草素为底物的催化反应条件优化及动力学参数测定。其中A-B.ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在不同pH和温度条件下催化木犀草素的转化率；C-D.产物木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷在不同pH和温度下的积累曲线；E-F.ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的预测动力学曲线。误差线和数据±SD表示三个独立分析的标准差。
图6为使用不同底物时ZmUGT84A1和ZmUGT84A2酶促反应产物的HPLC图谱(A-E)和转化率(F)。底物分别为：A中的Nar(柚皮素)；B中的Eri(圣草酚)；C中的Api(芹菜素)；D中的Que(槲皮素)和G中的Kae(山奈酚)，UDP-葡萄糖苷为供体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的pMAL-c2X质粒已记载于：Xiaorong Sun,Xiaofeng Xue,XiaqingWang,Chun Zhang,Dengyu Zheng,Wei Song,Jiuran Zhao,Jianhua Wei,Zhongyi Wu,Zhongbao Zhang*.Natural variation of ZmCGT1 is responsible for theisoorientin accumulation in maize silk.Plant Journal,2022,109:64-76.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中玉米(Zea mays L.)自交系B73已记载于:Zuoping Wang,ZhongbaoZhang,Dengyu Zheng,Tongtong Zhang,Xianglong Li,Chun Zhang,Rong Yu,JianhuaWei,Zhongyi Wu.Efficient and genotype independent maize transformation usingpollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles.Journal ofIntegrative Plant Biology,2022,64:1145-1156.公众可以从北京市农林科学院生物技术研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的木犀草素(luteolin)(货号P0065)、柚皮素(Naringenin)(货号P0028)、圣草酚(Eriodyctiol)(货号P0753)、芹菜素(Apigenin)(货号P0060)、槲皮素(Quercetin)(货号P0014)和山奈酚(Kaempferol)(货号P0013)购于上海纯优生物公司。
下述实施例中的木犀草素7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside)(货号ZES-1126)、木犀草素4′-O-葡萄糖苷(luteolin-4′-O-glucoside)(货号ZES-1412)和木犀草素3′,7-二-O-葡萄糖苷(Luteolin-3,7-di-O-glucoside)(货号ZES-0085)购于甄准生物科技有限公司。
下述实施例中的UDP-葡萄糖(UDP-glucose)(货号UF94335)购于中科瑞泰生物科技有限公司。
下述实施例中的纯甲醇、纯乙腈和纯甲酸购于赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher Scientific)。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示。
实施例1、ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在大肠杆菌(Escherichia coli)中的克隆和异源表达
玉米自交系B73生长在北京农林科学院的试验地。取三叶期的幼叶，液氮速冻后保存于-80℃冰箱中，待后续实验。
根据提供的序列信息(Zm00001d053715和Zm00001d015623)，通过逆转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)从玉米自交系B73的cDNA中扩增ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的开放阅读框(open reading frame，ORF)。使用带有20bp载体同源序列的引物扩增ORF序列，引物信息见表1。
表1、扩增ZmUGT84A1和ZmUGT84A2所用的引物
注：表1中标示下划线的碱基序列为同源臂序列，加粗的碱基为ZmUGT84A1或ZmUGT84A2基因的首/尾序列。
用上述引物ZmUGT84A1-F/R进行PCR扩增,得到约1500bp的PCR产物(即ZmUGT84A1基因的编码区)。经过测序，该PCR产物为1503bp，ZmUGT84A1基因的编码序列如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白命名为ZmUGT84A1，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，该蛋白包含500个氨基酸。
用上述引物ZmUGT84A2-F/R进行PCR扩增,得到约1500bp的PCR产物(即ZmUGT84A2基因的编码区)。经过测序，该PCR产物为1476bp，ZmUGT84A2基因的编码序列如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白命名为ZmUGT84A2，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，该蛋白包含491个氨基酸。
将ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的编码序列使用生工的无缝克隆试剂盒(Ready-to-UseSeamless Cloning kit，货号B632219)克隆到带有麦芽糖结合蛋白标签(MBP)的pMAL-c2X表达载体，得到重组载体pMAL-c2X-ZmUGT84A1和pMAL-c2X-ZmUGT84A2。
重组载体pMAL-c2X-ZmUGT84A1的结构描述如下：在pMAL-c2X载体的5’-CAGAATTCGGATCCTCTAGA-3’和5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTT-3’之间插入了序列表中序列2自5’末端第1至1503位核苷酸所示的DNA分子，并且保持pMAL-c2X载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。将此重组载体命名为重组载体pMAL-c2X-ZmUGT84A1，pMAL-c2X-ZmUGT84A1可以表达ZmUGT84A1-MBP融合蛋白，预期分子量约为95.9KD。
重组载体pMAL-c2X-ZmUGT84A2的结构描述如下：在pMAL-c2X载体的5’-CAGAATTCGGATCCTCTAGA-3’和5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTT-3’之间插入了序列表中序列4自5’末端第1至1476位核苷酸所示的DNA分子，并且保持pMAL-c2X载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。将此重组载体命名为重组载体pMAL-c2X-ZmUGT84A2，pMAL-c2X-ZmUGT84A2可以表达ZmUGT84A2-MBP融合蛋白，预期分子量约为95.3KD。
2.重组大肠杆菌NovaBlue-pMAL-c2X-ZmUGT84A1和NovaBlue-pMAL-c2X-ZmUGT84A2的获得
将步骤1得到的重组载体pMAL-c2X-ZmUGT84A1和pMAL-c2X-ZmUGT84A2转化至大肠杆菌NovaBlue(DE3)感受态(上海唯地生物技术有限公司)。经羧苄青霉素(50mg/L)筛选获得阳性克隆，经测序正确后，接种至50mL LB培养基，37℃条件下生长至OD600值为0.6-0.8后，加入IPTG至终浓度为0.1mM。振荡培养箱16℃，转速200rpm诱导培养20h后，使用收集管收集菌体，获得重组大肠杆菌NovaBlue-pMAL-c2X-ZmUGT84A1和NovaBlue-pMAL-c2X-ZmUGT84A2，将阳性转化子保存于4℃冰箱中。
3.融合蛋白的制备
根据pMAL融合蛋白纯化系统(pMAL fusion protein purification system，NewEngland Biolabs)的操作步骤，纯化含有MBP(maltose-binding protein)标签的融合蛋白。其中，重组大肠杆菌NovaBlue-pMAL-c2X-ZmUGT84A1和NovaBlue-pMAL-c2X-ZmUGT84A2菌体使用柱缓冲液(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM dithiothreitol(DTT)，pH7.4)重悬，使用JY92-IIN超声破碎仪破碎细菌。
蛋白粗提液装载到含有淀粉树脂的纯化柱上，以吸附MBP融合蛋白。纯化后的融合蛋白ZmUGT84A1-MBP和ZmUGT84A2-MBP，使用默克密理博公司的30kD超滤管(Amicon Ultra-4 30kD ultrafiltration tube)进行脱盐，并将蛋白储存在保存液(100mM Tris-HCl,20％glycerol,pH 7.5)中。使用12％的SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel)凝胶检验蛋白质质量，并使用康为公司的BCA定量试剂盒(BCA protein assay kit)对蛋白浓度进行定量测定。
使用淀粉树脂纯化柱纯化ZmUGT84A1和ZmUGT84A2融合蛋白，并通过SDS-PAGE检测质量，结果如图1所示：ZmUGT84A1融合蛋白的大小约为95.9kDa，ZmUGT84A2融合蛋白的大小约为95.3kDa。
实施例2、ZmUGT84A1和ZmUGT84A2酶学分析和反应条件优化
1、ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化活性研究
为测定ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的催化活性，配制50μL的反应液(100mM Tris-HClpH 7.5，10mM DTT)，其中含有4mM的UDP-葡萄糖、10μg融合蛋白和0.1mM的底物(木犀草素、柚皮素、圣草酚、芹菜素、槲皮素和山奈酚)。混匀后在30℃条件下反应60min，加入等体积纯甲醇终止反应。混合液于4℃下，21,100g离心10min。其中对底物木犀草素，设置5个反应时间梯度(5min、10min、30min、2h和24h)。所有实验均独立重复三次，并以无融合蛋白添加为对照组。催化产物保存在-20℃，待HPLC分析。
2、ZmUGT84A1和ZmUGT84A2酶促反应条件优化
为优化反应pH和温度，同样使用100mM Tris-HCl缓冲液，以木犀草素和UDP葡萄糖为底物进行反应，设置4个pH梯度(6.5、7.5、8.5和9.5)和5个温度梯度(25℃、30℃、35℃、40℃和45℃)。
3、酶促产物分析
使用安捷伦的高效液相色谱系统(high performance liquid chromatograph，HPLC，型号为1100)分析ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的酶促产物。
上样量为10μL，柱子类型为C18(4.6×150mm，5μm，购自安捷伦)，流速为0.8mL/min，流动相A为0.1％的甲酸水混合液，流动相B为纯乙腈。流动相梯度设置为：5-20％(0-5min)、20-40％(5-20min)、40-70％(20-30min)、70-5％(30-35min)、以及5％(35-40min)。检测波长为350nm。产物使用赛默飞世尔的液相-质谱联用仪(UltiMate3000-LTQ-XLTMlinear ion trap mass spectrometer)进一步分析。质谱设置为负电荷模式，电离方法为ESI(electrospray ionization)，质量检测范围为100-800m/z。归一化碰撞能量(Normalized collision energy，NCE)设置为35eV。不同底物经ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化产物峰的a-p的保留时间和质谱数据见表2。以含有pMAL-c2X空载体的E.coli的粗提物作为阴性对照。所有实验均重复三次。
表2、不同底物经ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化产物峰的鉴定
4、酶活力参数分析
通过设置不同的木犀草素浓度(底物浓度)，以测定ZmUGT84A1-MBP和ZmUGT84A2-MBP的酶活力参数。
在100mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，30℃反应5min。设置木犀草素的8个浓度梯度，分别是25、50、75、100、200、300和400μM。使用Prism 8提供的米氏方程(Michaelis andMenten equation)，通过非线性拟合的方式计算酶活力参数(Km,Vmax,and Kcat)。所有实验均重复三次。
经过上述试验考察可知：
1)酶促反应分析表明，ZmUGT84A1-MBP和ZmUGT84A2-MBP均可以将木犀草素转化成多种木犀草素-O-葡萄糖苷(图2中A和B)。反应5min和10min时，主要产物是峰1、峰2和峰3，对应的保留时间(retention time，tR)分别是12.9、12.1和10.4min。10min后，峰4和峰5也被检测到，对应的tR为8.9min和8.1min，同时峰1、2和3的峰面积表现为下降(图2中C和D)。结果表明，化合物1、2和3作为化合物4和5的底物。
图3中A-E为5种产物的质谱峰图。峰1、2和3鉴定为木犀草素单氧糖苷，具有相同的分子量448，并且碎片离子[M-H]-的m/z为447，[M-H-162]-的m/z为285(图3中A-C)。峰4和峰5鉴定为木犀草素双氧糖苷，碎片离子[M-H]-的m/z为609，[M-H-162]-和[M-H-162-162]-的m/z分别为447和285(图3中D和E)。基于标准品：木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷的tR和质谱结果(图3中F-H)，可以得出峰2为木犀草素-4’-O-葡萄糖苷，3为木犀草素-7-O-葡萄糖苷，4为木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷。产物1的减少伴随着产物4(木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷)的增加，产物2(木犀草素-4’-O-葡萄糖苷)的急剧减少伴随着产物5的快速增加。这意味着产物4由产物1和3生成，而产物5由产物2和3生成。因此，推断单氧糖苷1和双氧糖苷5分别为木犀草素-3’-O-葡萄糖苷和木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷。
2)为进一步证明ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化木犀草素除了形成多种单氧糖苷外，这两种酶还可以进一步催化木犀草素单氧糖苷形成两种双氧糖苷，以木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-4'-O-葡萄糖苷为底物，在体外进行了酶催化反应。结果表明，ZmUGT84A1和ZmUGT84A2可以催化木犀草素单氧糖苷(木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-4'-O-葡萄糖苷)分别生成木犀草素-3’,7-二-O-葡萄糖苷和木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷(图4)。
ZmUGT84A1和ZmUGT84A2最佳催化活性反应条件如下：
以木犀草素和UDP葡萄糖为底物，探索ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的反应pH和温度。在不同pH和温度下，底物木犀草素的转化率均在90-100％(图5中A-D)，表明ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在体外条件下可以有效催化木犀草素合成木犀草素双氧糖苷。对于主产物木犀草素-4’,7-二-O-葡萄糖苷，ZmUGT84A1最佳条件为pH 9.5和温度25℃，ZmUGT94A2的最佳条件是pH7.5和45℃。
3)酶活力参数通过非线性拟合的方式计算。ZmUGT84A1的Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km的值分别是64.290μM、12.000μM/min、0.95901s-1和0.014917μM-1s-1(图5中E)。ZmUGT84A2-MBP的Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km的值分别是65.020μM、9.476μM/min、0.75255s-1和0.011574μM-1s-1(图5中F)。
4)为分析ZmUGT84A1和ZmUGT84A2的底物特异性，使用不同底物进行酶促反应，底物包括柚皮素、圣草酚、芹菜素、槲皮素和山奈酚。ZmUGT84A1和ZmUGT84A2均表现出较宽的底物催化活性，并且可以生成多种产物(图6中A-E)：对于柚皮素，ZmUGT84A1-MBP和ZmUGT84A2-MBP均产生两种产物a和b，通过与标准品的tR和质谱结果比对，鉴定为单氧葡萄糖苷(表2)。圣草酚、芹菜素、槲皮素和山奈酚也同样有多种相应的单氧葡萄糖和二氧葡萄糖苷产物(表2)。在参与反应的五种底物中，ZmUGT84A1和ZmUGT84A2催化木犀草素的效率最高，分别为96％和75％，其次是槲皮素、山奈酚、芹菜素、柚皮素和圣草酚(图6中F)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.蛋白质或其相关生物材料在调控合成黄酮糖苷衍生物中的应用：
所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系；
所述蛋白质为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
(A3)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)与(A1)-(A3)中任一所限定的氨基酸序列具有75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(A5)在(A1)-(A4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于玉米。
3.根据权利要求1或2任一所述的应用，其特征在于：所述相关生物材料为下述中的任一种：
C1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述合成黄酮糖苷衍生物中的应用为如下任一：
P1)在制备4’,7-二-O-葡萄糖苷中的应用；
P2)在制备3’,7-二-O-葡萄糖苷中的应用；
P3)在制备单氧葡糖苷中的应用；
P4)在制备二氧葡糖苷中的应用；
P5)在制备催化木犀草素的产品中的应用；
P6)在制备催化圣草酚的产品中的应用；
P7)在制备催化柚皮素的产品中的应用；
P8)在制备催化芹菜素的产品中的应用；
P9)在制备催化槲皮素的产品中的应用；
P10)在制备催化山奈酚的产品中的应用；
P11)提高产品中O-糖基化类黄酮含量。
6.权利要求1中所述的蛋白质或其相关生物材料在如下中的应用：
1)制备具有类黄酮二-O-糖基转移酶活性的产品中的应用；
2)制备类黄酮二-O-糖基转移酶中的应用。
7.制备权利要求1-6任一应用中的所述的蛋白质的方法，其特征在于：所述方法包括使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。
9.一种重组肠杆菌，其特征在于：所述重组肠杆菌含有权利要求1-6任一应用中的所述的蛋白质的编码基因。
10.如权利要求9所述的重组肠杆菌，其特征在于：所述重组肠杆菌表达权利要求1-6任一所述的蛋白质。
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