CN115851790B - 一种樟树CcLis基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种樟树CcLis基因及其表达蛋白和应用，属于植物基因工程技术领域。本申请对诱导表达的重组蛋白分别添加底物GPP，进行重组蛋白催化活性检测，通过GC‑MS检测成分，结果表明本发明提供的CcLis是樟树芳樟醇合成的关键酶，在进行体外催化生产芳樟醇方面具有重要的应用价值。本申请利用注射法将已含pCambia1300S‑CcLis植物过表达载体的农杆菌转入受体材料中，瞬时转化后CcLis基因在受体材料中大量表达。表明本发明提供的CcLis是芳樟醇合成酶基因，在植物基因工程中，作为芳樟醇合成的关键基因，在促进植物芳樟醇合成方面具有重要的应用价值，因此本发明具有良好的应用前景。

Description

一种樟树CcLis基因及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种樟树CcLis基因及其表达蛋白和应用。

背景技术

我国是香化产品的生产大国和消费大国，2020年香化市场生产销售额接近5000亿元。芳樟醇是香化产业香料原料中使用频率最高、用量最大的香料原料，每年需求量高达10000t。芳樟醇(C₁₀H₁₈O)又名沉香醇，无色透明液体，属单萜类化合物。在香水配方中，芳樟醇是使用频率最高的一种香料，也可用来配制食用香精，每年全球用于配制香精的芳樟醇达10000吨；芳樟醇还有医疗保健的功效，具有抗菌、抗病毒和镇静等作用，自古以来民间就有芳樟醇的挥发油或植物作为催眠和镇静剂使用；另外，芳樟醇还可作为除臭剂和杀虫剂。

樟树(Cinnamomum camphora)是世界珍贵的芳香油类经济林树种。我国是世界上生产樟树精油最多的国家，其产量约占世界80％。根据叶精油主要组成成分，可将樟树划分为芳樟醇型、樟脑型、桉油素型、异橙花叔醇型、龙脑型等5个主要化学类型芳樟醇型樟树又称芳樟，其叶精油的主要成分为单萜类芳樟醇，含量一般可达85％以上。与其他芳樟醇植物资源(如芫荽、薰衣草、白兰花、金银花等)相比，芳樟具有含量高的优点，是生产天然芳樟醇精油的最理想植物材料之一。目前关于樟树精油的研究主要有成分的提取与鉴定，在樟树精油生物合成研究中尚未有芳樟醇合成酶基因克隆和功能鉴定的相关研究报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种樟树CcLis基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述樟树CcLis基因的表达蛋白。本发明还要解决的另一技术问题为提供所述樟树CcLis基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种樟树CcLis基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的樟树CcLis基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有权利所述的樟树CcLis基因的表达盒、载体、宿主菌或细胞系。

进一步地，所述的载体是植物表达载体。

进一步地，所述的植物表达载体是pCambia1300S-CcLis。

所述的樟树CcLis基因在植物育种或促进植物芳樟醇合成中的应用。

具体地，所述的樟树CcLis基因在促进植物芳樟醇合成中的应用，具体包括以下步骤：

1)构建樟树CcLis基因的载体；

2)将所构建的樟树CcLis基因的载体转化到植物中；

3)培育筛选得到芳樟醇含量提高的转基因植物。

所述的樟树CcLis基因在制备CcLis蛋白中的应用。

具体地，所述的樟树CcLis基因在制备CcLis蛋白中的应用，具体包括以下步骤：

(1)利用樟树CcLis基因构建表达载体；

(2)将所得表达载体转化到宿主菌或细胞中；

(3)培养所得宿主菌或细胞使其表达CcLis蛋白。

所述的樟树CcLis基因的表达蛋白在制备芳樟醇中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本申请对诱导表达的重组蛋白分别添加底物GPP，进行重组蛋白催化活性检测，通过GC-MS检测成分，CcLis的产物为100％芳樟醇。表明本发明提供的CcLis是樟树芳樟醇合成的关键酶，解释了樟树芳樟醇代谢的基本特征，在进行体外催化生产芳樟醇方面具有重要的应用价值。

(2)本申请利用注射法将已含pCambia1300S-CcLis植物过表达载体的农杆菌转入受体材料烟草叶片中，瞬时转化48小时后，CcLis基因在烟草叶片中大量表达，过表达CcLis基因显著促进了芳樟醇的合成。表明本发明提供的CcLis是芳樟醇合成酶基因，在植物基因工程中，作为芳樟醇合成的关键基因，在促进植物芳樟醇合成方面具有重要的应用价值，因此本发明具有良好的应用前景。

附图说明

图1为CcLis基因体外催化产物图；

图2为CcLis基因在烟草中的产物检测图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明创造的进一步详细的说明，至少具体描述一个最佳实施例，这种描述的具体化程度应达到使所属技术领域的技术人员按照所描述的内容能够重现发明，而不必再花费创造性的劳动，如不必再进行摸索研究和实验。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

实施例1：CcLis基因开放阅读框序列的克隆

基于樟树全基因组数据，设计特异引物用于扩增CcLis基因的开放阅读框序列，开放阅读框特异性引物序列如下所示：

CcTPS54正向引物：5’-CATAAAGCAGCGGGAGAA-3’，

CcLis反向引物：5’-GCTAACGGCATCATCATTT-3’。

50μL PCR扩增体系为：PrimerSTAR Max Premix 25μL；PF(10uM)2μL；PR(10uM)2μL；cDNA 1-3μL(50ng)；Primer STAR Max DNA polymerase 1μL；ddH₂O无菌水补齐至50μL。

PCR扩增反应程序为：预变性94℃反应2min；35个循环：变性98℃反应10sec，退火55℃反应30sec，68℃延伸2min；72℃终延伸5min；4℃保存。

对扩增产物进行测序，得到CcLis基因CDS编码区序列总长1755bp，如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：CcLis基因表达载体构建与体外催化

利用同源重组法构建原核表达载体pET28a-CcLis，所用引物系列如下所示：

正向引物：5’-TCAGCAGTCGAAGAGCAAGAATCACAACCAGGAAA-3’，

C_cLis反向引物：5’-TTAGCGTGTGAAGAGCTTAGATTTCCTTATCAGG-3’。

将重组载体pET28a-CcLis转化到大肠杆菌中，随后进行阳性克隆检测和质粒提取，并将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。将测序正确的重组菌置于温度为37℃的控温摇床中，以200r/min震荡培养；当OD值为0.6～0.8时加入终浓度为0.2mM的硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃继续震荡培养6小时；然后取菌液1mL，离心后弃上清，加入100μLSDS-PAGE(1×)缓冲液，吹打重悬菌液，水浴锅99℃煮沸5分钟，离心1分钟；取30μL上清液进行SDS-PAGE电泳。用浓度0.25％的考马斯亮蓝染色液染色2小时，随后脱色条带清晰并观察，选取表达量最高的菌液培养并保存，用于后续实验。在20℃下0.3mM IPTG培养12小时诱导蛋白表达，利用Ni-NTAResin(Transgen，中国)蛋白纯化试剂收获和纯化重组蛋白。然后，将1μg重组蛋白与10mM底物(GPP，Sigma)、10mM MgCl₂、10mM MnCl₂、10％(v/v)甘油、5mM DTT和50mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)，在30℃下孵育1小时。如图1中GC-MS检测结果显示：CcLis蛋白能催化GPP(牻牛儿基二磷酸盐)生成芳樟醇。

实施例3：CcLis基因过量表达载体的构建

扩增CcLis的CDS序列，利用百格公司的EXclone克隆试剂盒构建植物过表达载体pCambia1300S-CcLis，所用引物序列如下所示

正向引物：5’-TCAGCAGTCGAAGAGCATGTCCTCACCGGCTTCTTC-3’，

反向引物：5’-TTAGCGTGTGAAGAGCGATTTCTTTATCAGGGATA-3’。

具体方法为：扩增目的DNA片段，电泳检测后纯化回收DNA，进行EXIN反应，10μL反应体系为：5×EX-Buffer 2μL；EX-Vector 2μL；EXclonase Enzyme 1μL；插入DNA3μL(30ng)；ddH₂O无菌水补齐至10μL。

反应体系混匀后于PCR仪37℃下孵育30分钟，然后于20℃继续放置15分钟。取5μL反应液于100μL感受态细胞中进行转化、筛选培养、挑菌检测，阳性菌株保菌备用。

实施例4：CcLis基因在烟草中的瞬时表达

将构建好的过表达载体转化至LBA4404农杆菌感受态细胞中，以过表达空载为对照，制备OD₆₀₀为0.6～0.8的菌液，用悬浮液重悬菌液制备OD₆₀₀为0.6的侵染液(10mM MES，10mM MgCl₂，20mg/LAs，pH5.2)，28℃静置2～3小时。挑取状态良好的烟草，利用无针注射器将侵染液注入烟草叶片，培养48-60h后进行GC-MS检测和qRT-PCR分析。每个样品3次生物学重复。瞬时转化48小时后，qRT-PCR分析表明CcLis基因在烟草叶片中大量表达，GC-MS检测表明过表达CcLis基因显著促进了芳樟醇的合成(图2)。

Claims (1)

1.樟树CcLis基因在植物育种或促进植物芳樟醇合成中的应用，其特征在于，所述的樟树CcLis基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的植物表达载体是pCambia1300S-CcLis；具体包括以下步骤：

1）构建樟树CcLis基因的载体；扩增CcLis的CDS序列，利用百格公司的EXclone克隆试剂盒构建植物过表达载体pCambia1300S-CcLis，所用引物序列如下所示：

正向引物：5’-TCAGCAGTCGAAGAGCATGTCCTCACCGGCTTCTTC-3’，

反向引物：5’-TTAGCGTGTGAAGAGCGATTTCTTTATCAGGGATA-3’；

具体方法为：扩增目的DNA片段，电泳检测后纯化回收DNA，进行EXIN反应，10μL反应体系为：5×EX-Buffer 2μL；EX-Vector 2μL；EXclonase Enzyme 1μL；插入DNA3μL(30ng)；ddH₂O无菌水补齐至10μL；

反应体系混匀后于PCR仪37℃下孵育30分钟，然后于20℃继续放置15分钟；取5μL反应液于100μL感受态细胞中进行转化、筛选培养、挑菌检测，阳性菌株保菌备用；

2）将所构建的樟树CcLis基因的载体转化到植物中；

将构建好的过表达载体转化至LBA4404农杆菌感受态细胞中，以过表达空载为对照，制备OD₆₀₀为0.6～0.8的菌液，用悬浮液重悬菌液制备OD₆₀₀为0.6的侵染液，28℃静置2～3小时；挑取状态良好的烟草，利用无针注射器将侵染液注入烟草叶片，培养48-60h；

3）培育筛选得到芳樟醇含量提高的转基因植物；

培养48-60h后进行GC-MS检测和qRT-PCR分析；qRT-PCR分析表明CcLis基因在烟草叶片中大量表达，GC-MS检测表明过表达CcLis基因促进了芳樟醇的合成。